何志龍 林瑩鄧有麟蔣利和 *

［1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧530004； 2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學與生物技術(shù)重點實驗室（玉林師范學院），廣西 玉林537000； 3.右江民族醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院、 藥學院，廣西 百色533000］

據(jù)報道，全世界每年約有841 000 例新增肝細胞癌病例，其中約有781 000 例患者死于此病［1］。腫瘤細胞即使在供氧充足的情況下，仍然高度依賴葡萄糖進行糖酵解作為產(chǎn)生能量的主要方式，產(chǎn)生大量乳酸，這種現(xiàn)象被稱為Warburg 效應(yīng)［2-3］。盡管尚不完全清楚這種代謝行為在腫瘤細胞中的機制，但干擾糖酵解已成為一種治療癌癥的策略［4-5］。

α-番茄堿是番茄中天然存在的甾體類生物堿，抑制許多類型的癌細胞的生長，例如結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病、肺癌和肝癌等［6-11］。研究證明α-番茄堿與血管生成有關(guān)，可以抑制腫瘤細胞促血管生成因子VEGF 釋放［12］。而缺氧與缺氧誘導因子（HIF-1α）水平升高和隨之而來的VEGF表達升高有關(guān)［13］。另外，單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4（MCT4）在腫瘤細胞中的高表達可以防止乳酸鹽誘導的質(zhì)子應(yīng)激的積累，并將細胞內(nèi)pH 維持在一個堿性水平［14］，同時也可以酸化細胞外環(huán)境，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲［15］。MCT4介導的乳酸外排和產(chǎn)生的pH 穩(wěn)態(tài)可能是抑制腫瘤的潛在治療靶點。

本研究為了探討α-番茄堿對肝細胞癌的抑制作用和可能的機制，檢測了α-番茄堿對人肝癌細胞增殖、凋亡及遷移等表型變化，初步分析α-番茄堿對糖酵解的生化指標和相關(guān)蛋白的變化，為α-番茄堿抑制肝細胞癌提供了科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 HH-ZK600 恒溫水浴鍋購自英峪高科儀器廠；TriStar LB94 多功能酶標儀購自德國Berthold Technologies 公司；UV-1750 紫外可見光光度計購自蘇州島津儀器有限公司；DMIL-FL 熒光倒置生物顯微鏡購自德國Leica 公司；Tanon-5200Multi 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 α-番茄堿（成都普瑞法生物科技有限公司，純度95%，貨號BP1726）。CCK-8 試劑盒（美 國MedChemExpress 公司，貨號HY-K0301）；葡萄糖試劑盒（貨號A154-1-1）、乳酸檢測試劑盒（貨號A019-2-1）購自南京建成生物工程研究所有限公司；ATP 檢測試劑盒（貨號S0026）、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（貨號P0010）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MCT4 抗體（貨號20889-1-AP）、HIF-1α 抗體（貨號20960-1-AP）、乳酸脫氫酶A（LDHA）抗體（貨號19987-1-AP）、GAPDH 抗體（貨號60004-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌HuH-7 細胞（中國科學院上海細胞研究所）培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1×青鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

2.2 細胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的HuH-7 細胞，每孔3×103個接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后待細胞貼壁，分別加入不同濃度α-番茄堿處理12、24、48 h，加入CCK-8 試劑，37 ℃下孵育1 h，在450 nm 波長處檢測各孔吸光度值。

2.3 平板克隆實驗 取對數(shù)生長期的HuH-7 細胞，每孔1×103個接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后待細胞貼壁，分別加入0、1.5、2、2.5 μmol／L α-番茄堿進行干預(yù)，7 d 后棄培養(yǎng)基，PBS 清洗3次，加入固定液固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 清洗，靜置晾干，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 糖酵解實驗

2.4.1 葡萄糖消耗檢測 取對數(shù)生長期的HuH-7 細胞，每孔3×105個接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后待細胞貼壁，分別加入0、1.5、2、2.5 μmol／L α-番茄堿干預(yù)24 h。根據(jù)葡萄糖檢測試劑盒說明書檢測葡萄糖消耗，使用多功能酶標儀在505 nm 波長處檢測各孔吸光度值。

2.4.2 乳酸水平檢測 HuH-7 細胞按“2.4.1”項下方法處理，根據(jù)乳酸檢測試劑盒說明書操作步驟檢測乳酸水平，使用多功能酶標儀在530 nm 波長處檢測各孔吸光度值。

2.4.3 ATP 水平檢測 HuH-7 細胞按“2.4.1”項下方法處理，根據(jù)ATP 檢測試劑盒說明書操作步驟檢測ATP 水平，使用多功能酶標儀在562 nm 波長處檢測各孔吸光度值。

2.5 劃痕實驗 取對數(shù)期HuH-7 細胞，每孔6×105個接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后待細胞貼壁，用200 μL 槍頭垂直畫線，用PBS 清洗2次，鏡下觀察并拍照，再分別加入含有不同濃度α-番茄堿的無血清培養(yǎng)基，干預(yù)48 h 后顯微鏡下觀察并拍照。傷口面積越小，表明細胞遷移能力越低。

2.6 Transwell 實驗 取對數(shù)期HuH-7 細胞，每孔2×104個接種于不含血清培養(yǎng)基的Transwell 上室，加入不同濃度α-番茄堿進行干預(yù)，Transwell 下室放入完全培養(yǎng)基，孵育24 h后取出小室，用棉簽擦去濾膜上室的細胞，固定液固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS 清洗2次，倒扣于濾紙上風干，顯微鏡下觀察并拍照。穿過小室基底膜細胞數(shù)越少，表明細胞遷移能力越低。

2.7 Autodock-1.5.6 進行α-番茄堿與HIF-1α 蛋白的分子對接從 NCBI（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／pccompound／？term＝）獲取α-番茄堿結(jié)構(gòu)，從Protein Data Bank（https：／ ／www.rcsb.org／）獲取HIF-1α 蛋白結(jié)構(gòu)，分別對候選靶點利用Autodock-1.5.6 進行分子對接。

2.8 生物信息學分析MCT4（SLC16A3）在肝細胞癌中的表達 利用Ualcan 數(shù)據(jù)庫研究MCT4 在肝細胞癌和肝細胞正常組織中的表達情況分析和MCT4 在肝細胞癌中的預(yù)后分析，采用人類蛋白組圖譜（the human protein atlas，THPA）初步探討MCT4 在人體的分布以及表達，分析MCT4 蛋白表達變化，通過在線分析工具STRING 分析MCT4 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

2.9 Western blot 檢測蛋白表達 HuH-7 細胞按“2.4.1”項下方法處理，24 h 后加入細胞裂解液裂解細胞，根據(jù)BCA 試劑盒說明書檢測蛋白濃度，凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，3%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，室溫孵育二抗2 h，TBST 洗膜，滴加ECL 發(fā)光液，使用發(fā)光成像系統(tǒng)進行成像并拍照，以GAPDH 為內(nèi)參，計算蛋白相對表達。

2.10 統(tǒng)計學分析 通過GraphPad Prism 7 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較用單因素方差分析（Oneway ANOVA）。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 α-番茄堿對人肝細胞癌HuH-7 生長的影響

3.1.1 α-番茄堿對HuH-7 細胞增殖的抑制作用 如圖1 所示，α-番茄堿對HuH-7 細胞的增殖能力具抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，24 h 的IC50值為（1.83±0.31）μmol／L。

圖1 α-番茄堿對HuH-7 細胞增殖抑制率的影響（， n＝4）

3.1.2 α-番茄堿對HuH-7 細胞克隆形成能力的抑制作用 與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿處理后，HuH-7 細胞集落形成數(shù)量減少（P＜0.05，P＜0.01），說明α-番茄堿能抑制HuH-7 細胞的克隆形成能力，見圖2。

圖2 α-番茄堿對HuH-7 細胞克隆形成能力的影響（， n＝3）

3.2 α-番茄堿對HuH-7 細胞葡萄糖消耗的影響 與0 μmol／L α-番茄堿組比較，2、2.5 μmol／L 番茄堿組HuH-7細胞葡萄糖消耗水平降低（P＜0.01），1.5 μmol／L 番茄堿組HuH-7 細胞葡萄糖消耗水平無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 α-番茄堿對HuH-7 細胞葡萄糖攝取的影響（，n＝3）

表1 α-番茄堿對HuH-7 細胞葡萄糖攝取的影響（，n＝3）

注：與0 μmol／L α-番茄堿組比較，**P＜0.01。

3.3 α-番茄堿對HuH-7 細胞乳酸生成的影響 與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿均能降低HuH-7 細胞乳酸的生成（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 α-番茄堿對HuH-7 細胞乳酸生成的影響（， n＝3）

表2 α-番茄堿對HuH-7 細胞乳酸生成的影響（， n＝3）

注：與0 μmol／L α-番茄堿組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 α-番茄堿對HuH-7 細胞ATP 水平的影響 與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿干預(yù)后HuH-7 細胞內(nèi)ATP 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 α-番茄堿對HuH-7 細胞ATP 水平的影響（， n＝3）

表3 α-番茄堿對HuH-7 細胞ATP 水平的影響（， n＝3）

注：與0 μmol／L α-番茄堿組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5 α-番茄堿對HuH-7 細胞轉(zhuǎn)移能力的影響 如圖3 所示，與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿干預(yù)后HuH-7 細胞遷移距離縮短，遷移面積減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 α-番茄堿對HuH-7 細胞遷移能力的影響（， n＝3）

3.6 分子對接 當結(jié)合能小于-4.25 kcal／mol，說明該分子與靶蛋白可能結(jié)合。如圖4 所示，α-番茄堿與HIF-1α 蛋白中的GLN-387 之間具有氫鍵作用，結(jié)合能為-4.41 kcal／mol，說明α-番茄堿與HIF-1α 蛋白具有結(jié)合能力。

圖4 α-番茄堿與HIF-1α 蛋白對接

3.7 MCT4 在肝細胞癌中高表達 由圖5A 可知，MCT4 在肝細胞癌中高表達，在正常組織中低表達。圖5B 是MCT4在肝細胞癌中的生存曲線，從圖中可知高表達組的病人比低表達組的病人生存時間短，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MCT4 蛋白的免疫組化結(jié)果見圖5C，在正常組織中MCT4 主要呈低表達，而在腫瘤組織中MCT4 主要呈高表達；MCT4 蛋白在肝細胞癌中表達高于正常肝細胞組織（P＜0.01）。最后通過String 數(shù)據(jù)庫找到了MCT4 的共表達基因LDHA，為肝細胞癌的治療提供了新線索，見圖5D。

圖5 MCT4 在腫瘤里的表達情況和生存曲線

3.8 α-番茄堿對HuH-7 細胞糖酵解相關(guān)蛋白的影響 如圖6 所示，與0 μmol／L α-番茄堿組比較，不同濃度α-番茄堿均能降低HuH-7 細胞中HIF-1α 蛋白、糖酵解關(guān)鍵酶LDHA及相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白MCT4 表達（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 α-番茄堿對HuH-7 細胞糖酵解相關(guān)蛋白的影響

4 討論

目前，雖然已經(jīng)有很多的化學合成類抗腫瘤藥物問世并進入臨床，但這類藥物副作用較強，限制了抗腫瘤藥物的應(yīng)用范圍。α-番茄堿在體外可抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡［9，16］，是易獲得、療效穩(wěn)定、毒副作用低，具有抗腫瘤等多種生物活性的天然產(chǎn)物。本實驗結(jié)果顯示α-番茄堿對HuH-7 細胞的增殖抑制作用，且能有效抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。

腫瘤代謝過程的抑制已在一些實體瘤的臨床前研究中顯示出一定的效果。糖酵解作為腫瘤細胞重要的能量來源，即使在氧氣存在的情況下也通過糖酵解快速生成ATP［17］。ATP 作為能量的最直接載體，是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體，與各器官的能量代謝水平密切相關(guān)，參與生物體內(nèi)的多種代謝過程。瓦伯格（Warburg）效應(yīng)在腫瘤細胞中主要表現(xiàn)在葡萄糖的消耗，乳酸以及ATP 的生成，因此，通過檢測細胞消耗的葡萄糖水平，生成的乳酸及細胞內(nèi)ATP 水平，可以判斷藥物是否對糖酵解過程產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，α-番茄堿能降低HuH-7 細胞葡萄糖的攝取，降低乳酸的生成，降低細胞內(nèi)ATP 水平，提示α-番茄堿能抑制HuH-7 細胞糖酵解水平。

HIF-1α 在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達量升高，是腫瘤細胞糖酵解的過程中重要調(diào)控因子，且在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移方面起著重要作用［18］。HIF-1α 的激活參與癌細胞中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，包括血管生成、細胞存活、葡萄糖代謝和細胞侵襲等［19］。MCT4 對于適應(yīng)腫瘤特異性代謝過程至關(guān)重要，并且對腫瘤生長也很重要［20］，HIF-1α 直接或間接調(diào)節(jié)MCT4 表達以增強癌細胞的糖酵解和能量代謝［21-22］。研究發(fā)現(xiàn)，MCT4 表達也影響腫瘤細胞中HIF-1α 活化，并且抑制MCT4 可誘導HIF-1α 的失活，抑制腫瘤細胞葡萄糖代謝和轉(zhuǎn)移［23］。葡萄糖進入細胞后，在LDHA 的催化下生成乳酸，并產(chǎn)生ATP 供應(yīng)腫瘤細胞增殖的過程，最后由MCT4把胞內(nèi)乳酸轉(zhuǎn)運出去。本研究發(fā)現(xiàn)，α-番茄堿處理HuH-7細胞會降低MCT4、HIF-1α、LDHA 蛋白表達，同時通過數(shù)據(jù)庫挖掘發(fā)現(xiàn)，MCT4 在肝癌組織中表達高于正常組織，并且與LDHA 表達密切相關(guān)。PI3K／Akt 信號通路是激活Warburg 效應(yīng)的機制之一，大量研究發(fā)現(xiàn)MCT4、HIF-1α 和LDHA 作為參與Warburg 效應(yīng)的蛋白，受到PI3K／Akt 信號通路的調(diào)控［24-26］。另有研究表明，α-番茄堿可以抑制PI3K／Akt 信號通路的激活［9，27-28］，提示α-番茄堿可能通過抑制細胞中PI3K／Akt信號通路或HIF-1α 蛋白，調(diào)控Warburg 效應(yīng)相關(guān)蛋白的表達，抑制腫瘤細胞的糖酵解和能量代謝，從而抑制細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。但是，α-番茄堿對肝細胞癌的抑制機制還有待進一步研究。