張國(guó)琴，趙曉然，王冬萍，任曉亮，王 萌，劉 藝*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617)

蟛蜞菊內(nèi)酯屬于香豆草醚類化合物，具有多酚內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，主要存在于菊科醴腸屬植物醴腸全草中[1]，20世紀(jì)50年代，研究人員首次從金盞蟛蜞菊鮮葉中分離出該成分[2]。墨旱蓮主要含有黃酮、三萜、噻吩、香豆草醚、甾體、揮發(fā)油等化合物[3]，其中蟛蜞菊內(nèi)酯為主要活性成分，2020年版《中國(guó)藥典》將其作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[4]，也是二至丸、參鹿補(bǔ)膏、涼血安神片等經(jīng)典中成藥的主要藥效物質(zhì)[5]。研究表明，蟛蜞菊內(nèi)酯具有保肝[6-7]、抗炎[8]、抗氧化[9]、抗菌[10]等藥理作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)該成分還具有抗腫瘤作用[11]，在治療乳腺癌[12]、前列腺癌[13]、腎癌[14]方面有良好的效果。

目前，對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯藥理作用已展開了較全面的研究，但鮮有關(guān)于其穩(wěn)定性的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)考察不同pH、溫度、光照、金屬離子、氧化條件下蟛蜞菊內(nèi)酯含量隨時(shí)間的變化情況，并建立降解動(dòng)力學(xué)模型，以期為墨旱蓮等含有該成分的中藥及相關(guān)制劑的生產(chǎn)、貯存提供參考依據(jù)。

1 材料

Acquity H-class超高效液相色譜(美國(guó)Waters公司)；SB-3200D數(shù)控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AX224ZH電子天平[十萬分之一，奧豪斯儀器(上海)有限公司]；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州金壇良友儀器有限公司)；DELTA 320 PH儀(瑞士Mettler-Toledo公司)。蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)CHB180922，純度>98%，成都克洛瑪生物科技有限公司)。乙腈、甲醇[色譜純，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；鹽酸(分析純，天津化學(xué)試劑一廠)；甲酸(色譜純，美國(guó)Roe Scientific Inc公司)；氯化鐵、氯化亞鐵[分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司]；氫氧化鈉、氯化鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；3%H2O2(分析純，河北吉捷生物科技有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2 方法

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～15%B；5～15 min，15%～17%B；15～30 min，17%～30%B)；體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)照品5.00 mg，置于5 mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得(質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL)，避光，在4 ℃下靜置保存。

2.3 穩(wěn)定性研究

2.3.1 pH值 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，用氫氧化鈉、鹽酸配制的不同pH值溶液定容至刻度，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、5.0、6.2、8.0(實(shí)驗(yàn)室所用純水pH值為6.2)，制成20 μg/mL溶液，置于37 ℃水浴中避光保存，間隔一定時(shí)間取樣，UPLC法測(cè)定蟛蜞菊內(nèi)酯含量，通過R2確定反應(yīng)級(jí)數(shù)，計(jì)算降解半衰期。

2.3.2 溫度 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，純水定容至刻度，制成20 μg/mL溶液，分別置于37、60、80 ℃水浴中避光加熱，間隔一定時(shí)間取樣，UPLC法測(cè)定蟛蜞菊內(nèi)酯含量，通過R2確定反應(yīng)級(jí)數(shù)，計(jì)算降解半衰期。

2.3.3 光照 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，純水定容至刻度，制成20 μg/mL溶液，在室溫下分別置于日光燈(1.55×106lx)、紫外燈(8.16×105lx)、避光處，間隔一定時(shí)間取樣，UPLC法測(cè)定蟛蜞菊內(nèi)酯含量，通過R2確定反應(yīng)級(jí)數(shù)，計(jì)算降解半衰期。

2.3.4 金屬離子 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，分別用0.1 mol/L FeCl3、FeCl2溶液、純水定容至刻度，制成20 μg/mL溶液，置于80 ℃水浴中避光加熱，間隔一定時(shí)間取樣，UPLC法測(cè)定蟛蜞菊內(nèi)酯含量，通過R2確定反應(yīng)級(jí)數(shù)，計(jì)算降解半衰期。

2.3.5 氧化 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，分別用純水、3%H2O2溶液定容至刻度，制成20 μg/mL溶液，在室溫下避光靜置，間隔一定時(shí)間取樣，UPLC法測(cè)定蟛蜞菊內(nèi)酯含量，通過R2確定反應(yīng)級(jí)數(shù)，計(jì)算降解半衰期。

2.5 數(shù)據(jù)處理 通過Origin 9.65軟件進(jìn)行線性回歸分析，并繪制圖表。

3 結(jié)果

3.1 pH值對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性的影響 表1、圖1顯示，一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大，表明擬合效果最優(yōu)，并且降解屬于偽一級(jí)反應(yīng)；半衰期分別為51.34、27.62、18.10、10.30 h；在pH值為3.0時(shí)，加熱48 h后蟛蜞菊內(nèi)酯殘留率為53.46%，表明該成分在酸性條件下較穩(wěn)定。

表1 不同pH值下蟛蜞菊內(nèi)酯降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under different pH values

圖1 pH值對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性影響Fig.1 Effect of pH value on the stability of wedelolactone

3.2 溫度對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性的影響 表2、圖2顯示，在37、80 ℃下一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大，50 ℃下二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大；為了統(tǒng)一比較半衰期，將蟛蜞菊內(nèi)酯在各溫度下的降解均歸屬為偽一級(jí)反應(yīng)，結(jié)果分別為18.10、3.10、1.71 h；在37 ℃下加熱48 h后蟛蜞菊內(nèi)酯殘留率為14.40%，而在80 ℃下加熱6.5 h后僅為6.34%，表明該成分在低溫下更為穩(wěn)定。

表2 不同溫度下蟛蜞菊內(nèi)酯的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under different temperatures

圖2 溫度對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of wedelolactone

3.3 光照對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性的影響 表3、圖3顯示，在紫外光下一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大，避光下二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大，日光下零級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大；為了統(tǒng)一比較半衰期，將蟛蜞菊內(nèi)酯在不同光照下的降解均歸屬為偽一級(jí)反應(yīng)，結(jié)果分別為693.15、26.06、43.05 h；蟛蜞菊內(nèi)酯在避光下放置12 h后殘留率為88.49%，高于日光、紫外光下，表明該成分應(yīng)在避光條件下保存。

3.4 金屬離子對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性的影響 表4、圖4顯示，在Fe2+溶液中一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大，降解屬于偽一級(jí)反應(yīng)；半衰期分別為0.01、0.14、2.30 h；蟛蜞菊內(nèi)酯在Fe3+溶液中加熱約10 min后基本全部降解，在Fe2+溶液中加熱1 h后殘存率僅為0.65%，表明該成分在含F(xiàn)e3+、Fe2+溶液中穩(wěn)定性較差，即應(yīng)避免接觸含鐵容器。

表3 不同光照下蟛蜞菊內(nèi)酯降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.3 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under different illuminations

圖3 光照對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性影響Fig.3 Effect of illumination on the stability of wedelolactone

3.5 氧化對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性的影響 表5、圖5顯示，蟛蜞菊內(nèi)酯在水中一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大，在3%H2O2中二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合的R2最大；為了統(tǒng)一比較半衰期，將蟛蜞菊內(nèi)酯在氧化下的降解均歸屬為偽一級(jí)反應(yīng)，結(jié)果分別為693.15、12.88 h；蟛蜞菊內(nèi)酯在3%H2O2中加熱10 h后殘存率僅為8.29%，表明該成分在上述溶液中的穩(wěn)定性較差。

表4 不同金屬離子下蟛蜞菊內(nèi)酯降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.4 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under different metal ions

表5 氧化下蟛蜞菊內(nèi)酯的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.5 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under oxidation

圖4 金屬離子對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性影響Fig.4 Effect of metal ion on the stability of wedelolactone

圖5 氧化對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of oxidation on the stability of wedelolactone

4 討論

中藥制劑生產(chǎn)過程涉及從原材料選擇到加工多個(gè)環(huán)節(jié)，其有效成分在生產(chǎn)、貯存期間可能由于環(huán)境的變化而影響自身穩(wěn)定性[15-16]，進(jìn)而影響藥物安全性和有效性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蟛蜞菊內(nèi)酯在多種物理、化學(xué)環(huán)境中均不穩(wěn)定，而且在不同條件下的降解均符合偽一級(jí)反應(yīng)，它具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，呈弱酸性，F(xiàn)e2+可與其結(jié)構(gòu)部分螯合，形成穩(wěn)定的五環(huán)配合物[17]，其分子結(jié)構(gòu)被破壞可能是由于高溫，或者其結(jié)構(gòu)中含有的酚基團(tuán)具有還原性，可與部分氧氣發(fā)生反應(yīng)[18]，因此，該成分應(yīng)在低溫避光環(huán)境下保存，并避免接觸堿性環(huán)境、氧化劑、鐵離子。今后，將對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯降解產(chǎn)物及其機(jī)理進(jìn)行深入研究，以期為更合理有效地開發(fā)利用墨旱蓮等含有該成分的中藥提供依據(jù)。