歷 春 王鶴霏 何程遠(yuǎn) 房 惠 裴怡杰 蓋曉東

（北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 132013）

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其五年生存率不超過17%［1-2］。目前，肺腺癌的發(fā)病率逐年上升，已超過肺鱗癌成為肺癌中最常見的組織學(xué)類型［3］。多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，盡管采用手術(shù)、放療和化療等綜合治療措施，腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對(duì)化療藥物不敏感是影響臨床治療和預(yù)后的主要因素［4］。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）是上皮細(xì)胞失去極性轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子波形蛋白（Vimentin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達(dá)上調(diào)，也是肺腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［5-6］。此外，EMT 在腫瘤耐藥中也發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞可通過獲得間質(zhì)細(xì)胞表型產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥［7］。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是目前臨床上廣泛應(yīng)用的化療藥物，其可通過干擾核酸的合成而抑制腫瘤細(xì)胞的增生，還可抑制腫瘤細(xì)胞EMT，多與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療肺腺癌［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，超過50%以上的肺腺癌細(xì)胞具有間質(zhì)表型，且與轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)呈正相關(guān)［10-11］。因此，逆轉(zhuǎn)EMT 是有效治療肺腺癌、改善預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

叉頭蛋白3（forkhead box protein 3，F(xiàn)OXP3）是調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）的特異性標(biāo)志物，可通過發(fā)揮免疫抑制功能參與腫瘤免疫逃逸［12］。近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 在多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［13-15］。課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 在肺腺癌細(xì)胞高表達(dá)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，并可降低順鉑和阿霉素的敏感性，但其在EMT 和5-FU 耐藥性中的作用尚未闡明［16-18］。因此，本研究通過RNAi 技術(shù)抑制FOXP3 在肺腺癌A549 細(xì)胞株中的表達(dá)，旨在明確FOXP3 與EMT 和5-FU 耐藥的關(guān)系，擬為肺腺癌的免疫治療提供潛在的分子靶點(diǎn)，有望改善肺腺癌患者的預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細(xì)胞株購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基購自美國(guó)Hyclone 公司；新生牛血清購自天杭生物科技股份有限公司；FOXP3 siRNA 序列及陰性對(duì)照序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成；LipofectaminTM2000 試劑盒購自 賽 默 飛 世 爾；TRIzol，PrimeScriptTMRT 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa 公司；PCR 引物由生工生物工程有限公司合成；基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9 ELISA 試劑盒、FOXP3 抗體購自武漢博士得生物工程有限公司；Transwell 小室購自美國(guó)Corning公司；Matrigel 膠購自美國(guó)BD公司；RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒、CCK-8 試劑盒以及E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和GAPDH 抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司；5-FU 購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；P-糖蛋白（P-gp）抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺腺癌A549細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%新生牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與5-FU 處理細(xì)胞 選取第3 代細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為3組：陰性對(duì)照組（si-NC）、si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 組。si-FOXP3-1引物序列：5'-CAUGGACUACUUCAAGUUCdTdT-3'；si-FOXP3-2 引 物 序 列：5'-GAGAGAUGGUACAGU?CUCUdTdT-3'。轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000說明進(jìn)行，分別于轉(zhuǎn)染后6 h 更換為含血清的DMEM培養(yǎng)基。

選取第3 代細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后加入12.5 μg/ml 的5-FU 作為5-FU 處理組，0 μg/ml 的5-FU 作為未處理組，48 h 收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h及5-FU 處理48 h 的各組細(xì)胞，TRIzol 裂解法提取總RNA，用PrimeScripTMRT 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，條件如下：95 ℃15 min，95 ℃10 s，60 ℃10 s 退火，40 個(gè)循環(huán)。FOXP3引物序列F：5′-CACAACATGCGACCCCTTTCACC-3′，R：5′-AGGTTGTGGCGGATGGCGTTCTTC-3′；GAPDH 引物序列F：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，R：5′-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3′。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA含量。

1.2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染72 h 及5-FU處理48 h 的各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，每孔加入30 μg 蛋白，行10%SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)方式移至PVDF 膜，5%BSA 室溫下封閉1 h。分別滴加一抗FOXP3（1∶300）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、P-gp（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）于4 ℃過夜。TBST 沖洗后室溫孵育HRP標(biāo)記的IgG抗體（1∶2 000）1 h，加入ECL顯色底物發(fā)光并拍照。以GAPDH作為內(nèi)參，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整密度為5×105個(gè)/ml。遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μl 加入Transwell 上室，下室中加入500 μl 含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基。20 h 后，用4%多聚甲醛固定30 min，蘇木素染色5 min，水洗后用棉簽輕輕拭去Transwell 小室上層未遷移的細(xì)胞，200 倍顯微鏡下隨機(jī)5 個(gè)視野觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：用預(yù)冷的無血清DMEM 培養(yǎng)基以1∶8 稀釋Matrigel，各組上室加入80 μl，置37 ℃孵箱2 h。其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 ELISA 實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染72 h 的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清各1 ml，2 000 r/min 離心10 min，按照MMP-2 和MMP-9 ELISA 說明書步驟嚴(yán)格操作。全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度（OD）值，依標(biāo)準(zhǔn)品值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算MMP-2和MMP-9蛋白含量。

1.2.7 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染24 h 的各組細(xì)胞，5×103個(gè)/孔、100 μl 培養(yǎng)基接種于96孔板，貼壁后分別加入不同濃度的5-FU（0、3.125、6.25、12.5、25和50 μg/ml），每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照。48 h后10 μl/孔加入CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)分析儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔OD 值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組平均OD 值-給藥組平均OD 值）/對(duì)照組OD 值×100%，并進(jìn)一步用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制50%的藥物濃度（IC50）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組差異比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染si-FOXP3后各組細(xì)胞FOXP3表達(dá)情況為驗(yàn)證FOXP3 siRNAs 轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞的效果，采用qRT-PCR 和Western blot 方 法，分 別 在 轉(zhuǎn) 染48 h 和72 h 檢測(cè)各組細(xì)胞中FOXP3 的表達(dá)。結(jié)果顯示，與si-NC 組 相 比，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 組FOXP3 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.01），見圖1。結(jié)果提示成功沉默A549細(xì)胞中FOXP3的表達(dá)。

圖1 轉(zhuǎn)染si-FOXP3后A549細(xì)胞FOXP3表達(dá)Fig.1 Expressions of FOXP3 in A549 cells transfected with si-FOXP3

2.2 FOXP3 沉默對(duì)EMT 的影響 為明確FOXP3與EMT 之間的聯(lián)系，采用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXP3沉默后各組細(xì)胞EMT 相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)，包括間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin 和上皮標(biāo)志物E-cadherin。結(jié)果顯示，與si-NC 組相比，si-FOXP3-1和si-FOXP3-2組Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.01），E-cadherin 蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.01），見圖2。結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3沉默可抑制A549細(xì)胞EMT。

圖2 FOXP3 沉 默 對(duì)Vimentin、N-cadherin 和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of FOXP3 silencing on protein expressions of Vimentin，N-cadherin and E-cadherin

2.3 FOXP3 沉默對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響 為明確FOXP3 在EMT 中的具體作用，Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXP3 沉默后各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 組跨膜和穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)與si-NC 組相比均顯著減少（P<0.01），見圖3。結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3沉默可顯著降低A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖3 FOXP3沉默對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（×400）Fig.3 Effects of FOXP3 silencing on migration and invasion abilities of A549 cells（×400）

2.4 FOXP3 沉默對(duì)MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的影響 為探討FOXP3 促進(jìn)A549 細(xì)胞遷移和侵襲的相關(guān)分子機(jī)制，ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXP3 沉默后各組細(xì)胞上清中MMP-2和MMP-9的表達(dá)。結(jié)果顯示：與si-NC 組相比，si-FOXP3-1和si-FOXP3-2組細(xì)胞上清中MMP-2和MMP-9蛋白含量均顯著降低（P<0.01），見圖4。結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3 沉默可通過抑制MMP-2和MMP-9 表達(dá)進(jìn)而降低A549 細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖4 FOXP3沉默對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白含量的影響Fig.4 Effects of FOXP3 silencing on protein concentra?tions of MMP-2 and MMP-9

2.5 5-FU 作用于A549 細(xì)胞對(duì)FOXP3 表達(dá)的影響 為探討FOXP3 與5-FU 耐藥性之間的聯(lián)系，收集5-FU（12.5 μg/ml）處理48 h 的A549 細(xì)胞，qRTPCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)FOXP3 的表達(dá)。結(jié)果顯示：5-FU處理組FOXP3 mRNA 和蛋白均顯著高于未處理組（P<0.05），見圖5。結(jié)果表明，5-FU作用A549 細(xì)胞可上調(diào)FOXP3 表達(dá)，提示FOXP3 可能參與5-FU誘導(dǎo)的耐藥作用。

圖5 5-FU作用的A549細(xì)胞FOXP3表達(dá)Fig.5 FOXP3 expression in 5-FU treated A549 cells

2.6 FOXP3 沉默對(duì)5-FU 敏感性的影響 為明確FOXP3 在5-FU 耐藥中的作用，選用不同濃度的5-FU 作用于各組細(xì)胞，CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞活性，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和IC50值。與si-NC 組比較，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 組細(xì)胞增殖抑制率均顯著增加，在6.25、12.5、25 和50 μg/ml 濃度時(shí)差異顯著（P<0.05），IC50值也明顯降低。結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3 沉默可顯著增加A549 細(xì)胞對(duì)5-FU 的敏感性，見表1。

表1 FOXP3沉默對(duì)A549細(xì)胞5-FU耐藥性的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of FOXP3 silencing on 5-FU resistance of A549 cells（±s，n=3）

表1 FOXP3沉默對(duì)A549細(xì)胞5-FU耐藥性的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of FOXP3 silencing on 5-FU resistance of A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

IC50/（μg·ml-1）13.90 8.52 9.09 Groups si-NC si-FOXP3-1 si-FOXP3-2 Inhibition rate of various concentrations of 5-FU/%3.125/（μg·ml-1）27.7±1.76 32.6±2.08 31.7±1.51 6.250/（μg·ml-1）33.9±2.12 43.4±1.621）41.5±2.051）12.500/（μg·ml-1）45.1±1.45 54.5±1.571）53.7±2.201）25.000/（μg·ml-1）61.7±3.61 72.8±2.561）71.7±2.511）50.000/（μg·ml-1）72.5±2.50 79.1±3.121）78.5±3.551）

2.7 FOXP3 沉默對(duì)P-gp 表達(dá)的影響 為探討FOXP3 促進(jìn)5-FU 耐藥的分子機(jī)制，Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXP3 沉默后各組細(xì)胞中P-gp 的表達(dá)。結(jié)果顯示，與si-NC 組相比，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2組P-gp 表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），見圖6。結(jié)果提示，F(xiàn)OXP3 沉默可通過抑制A549 細(xì)胞P-gp 表達(dá)進(jìn)而影響5-FU的耐藥性。

圖6 FOXP3沉默對(duì)P-gp表達(dá)的影響Fig.6 Effects of FOXP3 silencing on P-gp expression in A549 cells

3 討論

研究報(bào)道，F(xiàn)OXP3 可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖，可通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞從G1期向S 期轉(zhuǎn)化從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)［19］。本課題組前期報(bào)道，F(xiàn)OXP3 在肺腺癌細(xì)胞的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期呈正相關(guān)，還可通過抑制免疫抑制因子IL-10 和TGF-β 的分泌抑制T 淋巴細(xì)胞增殖，表明FOXP3 與肺腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，但其作用的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明［16-17，20］。

EMT 是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，是腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞間黏附和突破細(xì)胞外基質(zhì)（extra?cellar matrix，ECM）獲得遷移和侵襲能力的動(dòng)態(tài)過程［21］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，具有EMT 表型的肺腺癌細(xì)胞，其侵襲性和轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)［10-11］。因此，本研究通過RNA 干擾（RNAi）技術(shù)沉默人肺腺癌細(xì)胞FOXP3基因的表達(dá)，探究其在EMT 過程中的作用。本課題組發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 表達(dá)下調(diào)可顯著增強(qiáng)上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin 表達(dá)，抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vimentin 和N-cadherin 表達(dá)，表明FOXP3 基因沉默可逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞EMT 表型。Transwell 小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)FOXP3 在促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲過程中的重要作用。LIU等［22］探究FOXP3在宮頸癌侵襲的作用中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 沉默可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力、并上調(diào)E-cadherin和下調(diào)Vimentin的表達(dá)，表明FOXP3可通過EMT促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲，與本研究中的結(jié)果一致。ECM 和基底膜的降解是EMT 過程的關(guān)鍵步驟，MMP-2 和MMP-9 是降解ECM 和基底膜最主要的基質(zhì)金屬蛋白酶，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［23］。本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞FOXP3 基因沉默后MMP-2 和MMP-9 表達(dá)顯著降低，表明FOXP3可能通過調(diào)控MMP-2和MMP-9的表達(dá)促進(jìn)ECM 降解，進(jìn)而增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，參與EMT過程。

臨床上，5-FU 多與阿霉素等化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療肺腺癌［9］。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 可降低阿霉素和順鉑的敏感性［17-18］。另有研究報(bào)道5-FU 可通過抑制腫瘤細(xì)胞EMT 發(fā)揮抗腫瘤作用［8］。結(jié)合本研究結(jié)果FOXP3可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞EMT，推測(cè)FOXP3 可能與5-FU 耐藥有關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了本研究的推測(cè)，F(xiàn)OXP3的表達(dá)在5-FU處理肺腺癌細(xì)胞后顯著上調(diào)，表明5-FU 的耐藥作用可能與FOXP3 的表達(dá)水平有關(guān)。為明確FOXP3 在5-FU 耐藥中的具體作用，本研究通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXP3基因沉默后5-FU對(duì)肺腺癌細(xì)胞的殺傷效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXP3表達(dá)下調(diào)后，5-FU作用下的細(xì)胞抑制率顯著增加，IC50也明顯降低，提示抑制FOXP3 表達(dá)可改善肺腺癌細(xì)胞對(duì)5-FU 的耐藥性?；熌退幍闹鲗?dǎo)機(jī)制之一是細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加從而導(dǎo)致化療藥物的外排［24-25］。P-gp 具有ATP 依賴的藥物外排泵功能，能將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度［26］。本研究發(fā)現(xiàn)FOXP3 基因沉默可顯著抑制P-gp 表達(dá)，提示FOXP3可能通過調(diào)控P-gp表達(dá)增加5-FU外排導(dǎo)致耐藥。

綜上所述，F(xiàn)OXP3 基因沉默可以抑制肺腺癌細(xì)胞EMT，改善肺腺癌細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性。本研究結(jié)果為阻斷肺腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移以及改善肺腺癌的耐藥提供新的研究思路。