張漢清 鄔秀娣（寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波 315211）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種典型自身免疫性疾病，可累及多個(gè)器官與系統(tǒng)。其發(fā)病機(jī)制涉及免疫、遺傳和環(huán)境危險(xiǎn)因素等相互作用［1］。miRNA 是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，長度為19～25 個(gè)核苷酸，通過降解特定靶mRNAs 或抑制其翻譯，轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)［2］。近年來，廣泛研究表明miRNA 異常在SLE 發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，其機(jī)制包括T、B 細(xì)胞自身反應(yīng)性上調(diào)、Ⅰ型干擾素（IFN）通路激活等［3］。Toll 受體（Toll-like receptor，TLR）是一種模式識(shí)別受體，目前認(rèn)為TLR7/9 信號(hào)通路為SLE 患者Ⅰ型IFN 產(chǎn)生的主要機(jī)制（圖1），在SLE 發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位［4］。本文主要闡述miRNA異常對TLR7/9-IFN 通路的影響，希望為尋找與SLE 發(fā)病機(jī)制相關(guān)的新靶向藥物提供思路。

圖1 SLE中TLR7/9-IFN信號(hào)通路［4］Fig.1 TLR7/9-IFN signalling pathway in SLE［4］

1 TLR7/9-IFN通路與SLE

1.1 TLR7/9-IFN 通路與性別差異 2006 年，BERGH?FER 等［5］首次證實(shí)健康人群存在一種性別依賴的IFN-α誘導(dǎo)途徑，即TLR7會(huì)誘導(dǎo)女性外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更多IFN-α，并排除與雌激素信號(hào)、TLR7 基因X 失活逃逸相關(guān)，而TLR9-IFN-α 途徑則無此性別差異。2018年WEBB等［6］采用青春期前與青春期后健康年輕人、接受跨性激素治療的變性人（即出生性別為女性的人服用睪酮，出生性別為男性的人服用雌二醇）及患有特納綜合征的年輕女性組成試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，解除X 染色體數(shù)量與性激素環(huán)境之間的傳統(tǒng)相關(guān)性。這種獨(dú)特的試驗(yàn)?zāi)Ｐ吞崾荆孩倥孕詣e和青春期后階段是人體內(nèi)TLR7誘導(dǎo)IFN-α 產(chǎn)量較高的獨(dú)立相關(guān)因素，具體來說，如果存在兩條X染色體，無論血清性激素水平如何，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）在TLR7 刺激后特異性產(chǎn)生更多Ⅰ型IFN；且僅1條X染色體存在時(shí)，Ⅰ型IFN 水平與睪酮呈正相關(guān)，存在兩條X 染色體時(shí)則與睪酮呈負(fù)相關(guān)；②青春期后女性TLR7 基因表達(dá)上調(diào)；③IFN 刺激后，青春期后志愿者體內(nèi)外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）IFN 誘導(dǎo)基因（IFN-stimulated gene，ISG）表達(dá)上調(diào)，其水平與血清雌二醇濃度呈正相關(guān)。以上發(fā)現(xiàn)可能解釋女性性成熟時(shí)兒童SLE（jSLE）易感性增加的原因。WEBB 等［6］對青春期后健康年輕人及年齡相匹配的低疾病活動(dòng)度jSLE 患者（兩組樣本間血清睪酮、雌二醇濃度、IFN 產(chǎn)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PBMC TLR7 表達(dá)在jSLE 組無性別差異，男性jSLE 患者PBMC TLR7 基因表達(dá)水平顯著高于健康男性志愿者，提示TLR7 過度表達(dá)可能是男性jSLE 發(fā)生的一個(gè)重要因素。SHEN 等［7］證實(shí)東亞人群TLR7 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs3853839（G/C）在SLE 患病風(fēng)險(xiǎn)中有性別差異，男性SLE 患者頻率顯著高于女性對照組，其可通過上調(diào)TLR7-Ⅰ型IFN 通路表達(dá)，參與SLE發(fā)生。

與性別差異有關(guān)的TLR7-IFN 通路給SLE 分子發(fā)病機(jī)制帶來新見解，也為男女性患者精細(xì)化治療提供研究方向。

1.2 TLR7/9-IFN 通路與動(dòng)脈粥樣硬化 ROMAN等［8］發(fā)現(xiàn)各年齡段SLE 患者動(dòng)脈粥樣硬化患病率均高于健康對照組，40 歲以下年輕患者尤為突出，其患病率是對照組的5.6 倍，且SLE 患者早期動(dòng)脈粥樣硬化與慢性炎癥相關(guān)。NIESSNER 等［9］采用TLR9配體CpG 誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊pDC 釋放IFN-α，發(fā)現(xiàn)IFN-α 可通過上調(diào)斑塊處髓系樹突狀細(xì)胞與巨噬細(xì)胞TLR4 表達(dá)，使TNF-α、IL-12 和基質(zhì)金屬蛋白酶9等細(xì)胞因子產(chǎn)量升高，介導(dǎo)組織損傷，打破斑塊穩(wěn)定性，發(fā)揮炎癥放大器作用。這說明是遠(yuǎn)處的病毒感染或組織損傷，同樣可通過pDC-TLR7/9-IFN-α途徑增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)，甚至造成血栓形成、發(fā)生急性梗死。2015 年CLEMENT 等［10］利用多色流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)表達(dá)CXCR3+外周血CD4+T 細(xì)胞頻率與SLE 患者頸內(nèi)動(dòng)脈壁厚度呈正相關(guān)，首次證實(shí)T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、髓系樹突狀細(xì)胞、pDC 及B 細(xì)胞中，pDC 是TLR9刺激后IFN-α的主要來源。同時(shí)CLEMENT等［10］利用載脂蛋白E 缺陷（ApoE-/-）小鼠模型，證實(shí)來源于pDC的IFN-α誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生CXCR3 配體，并促進(jìn)CD4+CXCR3+T 細(xì)胞增殖、遷徙入動(dòng)脈壁，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，表明pDC-TLR9-IFN-α通路可加快SLE 患者動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展。GENG 等［11］于2018 年發(fā)現(xiàn)相較于單基因敲除及野生型小鼠，載脂蛋白E 缺陷與FasL 缺陷（gld.）的雙基因敲除C57BL/6 小鼠（gld. ApoE-/-小鼠）正常飲食條件下表現(xiàn)出狼瘡樣疾病加重與動(dòng)脈粥樣硬化加速，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過激活TLR7/9 信號(hào)通路過度表達(dá)的Ⅰ型IFN 可能通過抑制gld.ApoE-/-小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量或功能加速動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展。

1.3 TLR7/9-IFN通路與狼瘡小鼠模型

1.3.1 自發(fā)性狼瘡鼠模型 2006 年P(guān)ATOLE 等［12］發(fā)現(xiàn)5 周齡健康自發(fā)性狼瘡模型MRLlpr/lpr 小鼠除TLR3外，其他TLR mRNA腎臟表達(dá)較脾臟低，20周齡腎炎性MRLlpr/lpr 小鼠腎臟TLR1-9 mRNA 表達(dá)上調(diào)，以上結(jié)果提示免疫復(fù)合物腎小球腎炎加重可能與TLRs 特異性表達(dá)有關(guān)。同年P(guān)AWAR 等［13］通過腎炎性MRLlpr/lpr 小鼠腎臟切片免疫染色發(fā)現(xiàn)TLR7在浸潤ERHR3陽性巨噬細(xì)胞及少量CD11c陽性樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，腎小球系膜細(xì)胞無表達(dá)，且體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TLR7 激動(dòng)劑可誘導(dǎo)MRLlpr/lpr 小鼠單核細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞分泌IFN-α、IL-12p70 等細(xì)胞因子并加重16～18 周齡MRLlpr/lpr 小鼠狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）。CHRISTENEN 等［14］發(fā)現(xiàn)TLR9 缺失時(shí)狼瘡易感小鼠病情加重，淋巴細(xì)胞與pDC激活，血清IgG與IFN-α水平升高，相反TLR7基因缺陷小鼠病情有所改善。

1.3.2 誘導(dǎo)性狼瘡鼠模型 降植烷（TPMD）誘導(dǎo)的SLE 小鼠模型適合研究人類SLE 與IFN 相關(guān)發(fā)病機(jī)制，其腎臟疾病與自身抗體的產(chǎn)生嚴(yán)格依賴于Ⅰ型IFN 受體信號(hào)傳遞，Ⅰ型IFN 主要來源于高表達(dá)Ly6C 的未成熟單核細(xì)胞，其產(chǎn)生完全由TLR7-MyD88 信號(hào)介導(dǎo)［15］。2016 年，BOSSALLER 等［16］分別為野生型與TLR9-/-BALB/c 小鼠注射磷酸鹽緩沖液（PBS）或TMPD 后比較腎組織切片，發(fā)現(xiàn)TPMD+-TLR9-/-BALB/c 表現(xiàn)出更嚴(yán)重的腎小球腎炎，伴有新月體形成及硬化，且存活率最低；TPMD+-野生型BALB/c 腎臟病變較輕；PBS 組小鼠均未出現(xiàn)任何腎臟病變跡象，說明TLR9表達(dá)在TMPD誘導(dǎo)的BALB/c小鼠自身免疫中起保護(hù)作用。分別給BALB/c 野生型、TLR9-/-及TLR7-/-小鼠腹腔注射PBS、TMPD，分析第4 天腹膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與注射TMPD 的野生型或TLR7-/-小鼠相比，TMPD+-Tlr9-/-組Ly6Chi炎癥性單核細(xì)胞數(shù)量顯著升高且TLR7 與ISG 高表達(dá)。說明TLR7驅(qū)動(dòng)的SLE模型中，TLR9起負(fù)向調(diào)控作用。

這些發(fā)現(xiàn)揭示盡管有產(chǎn)生IFN 的共同信號(hào)通路，但TLR7 與TLR9 可能存在反作用，TLR9 似乎在SLE 小鼠模型疾病發(fā)展過程中起保護(hù)作用，具體機(jī)制值得進(jìn)一步探索，因此精準(zhǔn)TLR 靶向藥研發(fā)有遠(yuǎn)大前景。

2 miRNA 調(diào)控TLR7/9-IFN 通路在SLE發(fā)病機(jī)制作用

PARADOWSKA-GORYCKA 等［17］在2020 年 的一項(xiàng)研究中首次比較混合性結(jié)締組織病、SLE、系統(tǒng)性硬化癥患者全血TLR3/7/8/9與IFN-α/β/γ表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)僅SLE 患者表達(dá)IFN-γ、TLR3 及TLR8，SLE 患者TLR7、IFN-α 及IFN-β 表達(dá)為三種患者中最高，且亦存在TLR9 表達(dá)。這些結(jié)果再次證實(shí)TLR-IFN 途徑在SLE發(fā)病機(jī)制中有區(qū)別于其他自身免疫性疾病的獨(dú)特地位。健康人和SLE患者部分TLR通路相關(guān)miRNAs 存在差異性表達(dá)，如miR-155、miR-146a、miR-21［18-20］。本文將進(jìn)一步闡述這幾種miRNAs 與SLE TLR7/9-IFN信號(hào)通路的關(guān)系。

2.1 miR-146a

2.1.1 miR-146a 可通過調(diào)節(jié)TLR7/9-IFN 通路參與SLE 發(fā)病 KARRICH 等［21］研究表明pDC 經(jīng)TLR7/9刺激后表達(dá)miR-146a，miR-146a可通過下調(diào)Bcl2-A1，與靶向髓樣分化因子88（myeloid differentiation pri?mary response gene 88，MyD88）/TNF 受體相關(guān)因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）6/IL 受體相關(guān)激酶（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK）1 信號(hào)通路，共同調(diào)控pDC 存活、成熟及表達(dá)Ⅰ型IFN。崔慧娟等［22］研究發(fā)現(xiàn)，SLE 患者外周血miR-146a 表達(dá)下調(diào)，使其對靶基因TRAF6/IRAK1 的負(fù)調(diào)控作用減弱，導(dǎo)致TRAF6/IRAK1 mRNA 表達(dá)上調(diào)，引起下游Ⅰ型IFN 產(chǎn)生，而過度活化的Ⅰ型IFN 通路在SLE發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。2017年，WU 等［23］證實(shí)LN 腎組織miRNA-146a 可直接靶向并負(fù)向調(diào)控TRAF6 表達(dá)。ZHU 等［19］檢測128 例LN 患者與30 例健康對照者PBMC miR-146a 及其靶基因TRAF6 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-146a 與TRAF6 對LN 有診斷價(jià)值，其AUC 分別為0.821 和0.897，生存曲線提示miR-146a 降低與TRAF6 上調(diào)可加快LN 終末期腎病進(jìn)展并提升其1年內(nèi)復(fù)發(fā)的可能性。

2.1.2 miR-146a 在SLE 中有調(diào)控IFN 通路下游途徑的作用 TANG 等［24］采用TaqMan PCR 檢測47 例SLE 患者血液樣本白細(xì)胞miR-146a 表達(dá)，結(jié)果表明SLE 患者miR-146a 表達(dá)顯著低于對照組，且與SLE疾病活動(dòng)性呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示過表達(dá)miRNA-146a 可靶向TLR 信號(hào)通路關(guān)鍵級(jí)聯(lián)蛋白IRF（IFN-regulatory factor）-5 與STAT（signal trans?ducer and activator of transcription）-1，下調(diào)狼瘡患者ISG 表達(dá)，對Ⅰ型IFN 通路起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。而SLEⅠ型IFN 亦可抑制miRNA-146a 成熟，導(dǎo)致SLE 炎癥持續(xù)發(fā)展并上調(diào)其炎癥基因表達(dá)［25］。

以上研究表明miR-146a 可能參與SLE 多系統(tǒng)發(fā)病機(jī)制，有作為疾病活動(dòng)性指標(biāo)及診斷生物標(biāo)志物的潛力，也可將通過調(diào)節(jié)TLR7/9-IFN 信號(hào)通路及其下游信號(hào)途徑作為治療SLE的潛在靶點(diǎn)。目前已有學(xué)者嘗試開發(fā)miRNA 療法。PAN 等［26］應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備含miR-146a 的噬菌體MS2 病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP），將其注入BXSB 狼瘡易感小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MS2-miR146a VLP 療法致自身抗體、總IgG及包括IFN-α在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子表達(dá)顯著下調(diào)。

2.2 miR-155 miRNA 生成過程中，通常miRNA 前體（pre-miRNAs）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后被核酸內(nèi)切酶Dicer加工成雙鏈miR-miR*，隨后分離為成熟的前導(dǎo)鏈miRNA 與過客鏈miRNA*［27］。ZHOU 等［28］首次證實(shí)miRNA 及其伴侶miRNA*在同一生理過程中的合作效應(yīng)。應(yīng)用TLR7 刺激從健康人PBMC 中提純的pDC，發(fā)現(xiàn)其可通過JNK 途徑顯著誘導(dǎo)miR-155 及其伴侶miR*-155 表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-155*通過靶向TLR 通路負(fù)向調(diào)控因子IRAKM 促進(jìn)IFNα/β 產(chǎn) 生，隨 后miR-155 通 過 靶 向TAB2 抑 制IFNα/β 產(chǎn)生，二者合作發(fā)揮對TLR7-Ⅰ型IFN 通路的動(dòng)態(tài)微調(diào)作用。TANG等［29］證實(shí)MyD88是miR-155的靶基因。CHARRIERD 等［30］2012 年發(fā)現(xiàn)人臍血pDCsTLR9-MyD88/IRAK1/IRF7 通路轉(zhuǎn)錄后被高表達(dá)的miR-146a 與miR-155 抑制，降低了IFN 產(chǎn)量。以上研究說明miR-155 可通過多靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控TLR7/9-IFN信號(hào)通路的作用。

KAGA 等［31］2015 年發(fā)現(xiàn)與健康人相比，未治療的SLE 患者PBMC IFN-α 表達(dá)上調(diào)，且與顯著下調(diào)的miR-155、miR-17 及miR-181b 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-155 可能通過抑制IFN-α 表達(dá)參與SLE 發(fā)生發(fā)展。關(guān)于SLE miR-155與TLR7/9-IFN 信號(hào)通路的關(guān)系仍需深入研究。

2.3 外泌體miR-21

2.3.1 SLE 外泌體miR-21 可能有病理作用 外泌體是一種細(xì)胞外囊泡（EVs），因其有傳遞核酸、蛋白等生物活性物質(zhì)，進(jìn)而溝通細(xì)胞間通訊的特殊作用，成為近年來腫瘤及自身免疫性疾病的研究熱點(diǎn)［32-33］。2019 年TANGTANATAKUL 等［34］發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期LN 患者尿液外泌體miR-21 表達(dá)顯著下調(diào)，且與蛋白丟失及腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān)。同年SOLé等［35］發(fā)現(xiàn)LN 尿液外泌體miR-21、miR-150、miR-29c表達(dá)與腎臟纖維化指數(shù)呈正相關(guān)。這些研究可提供一種部分替代腎穿刺的LN 疾病進(jìn)展預(yù)測方法及早期腎纖維化無創(chuàng)檢驗(yàn)方法。2020 年LI 等［20］分離38例SLE患者與18例健康對照者的血清外泌體，采用RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-21表達(dá)上調(diào)，與蛋白尿呈正相關(guān)、與抗SSA/Ro抗體呈負(fù)相關(guān)。以上研究表明外泌體miR-21存在于多種體液中，有可能作為監(jiān)測SLE疾病活動(dòng)度、指導(dǎo)LN臨床分期的標(biāo)志物。

2.3.2 外泌體miR-21 可通過激活TLR7-IFN 通路參與SLE發(fā)病 CHEN等［36］證實(shí)miR-21可在轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)控TLR信號(hào)通路MyD88與IRAK1，抑制IFN-α產(chǎn)生。2017 年YOUNG 等［37］發(fā)現(xiàn)SLE 存在一種新的固有炎癥信號(hào)通路，EVs包裹的miR-21可作為TLR8的內(nèi)源性配體誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)。以上結(jié)果說明miR-21 不僅可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)TLR，亦可作為TLR 配體發(fā)揮作用。SALVI 等［38］在2018 年的一項(xiàng)研究進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，其采用超速離心與密度梯度離心法從SLE 患者血漿中提純外泌體，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)人pDC 產(chǎn)生Ⅰ型IFN。將包含miR-21 在內(nèi)的含IFN 誘導(dǎo)基序（IFN induction motif，IIM）的miRNA利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至pDC，可使IFN 大量產(chǎn)生，且誘導(dǎo)IRF7（使Ⅰ型IFN 產(chǎn)生的主要轉(zhuǎn)錄因子）發(fā)生核轉(zhuǎn)位。免疫熒光法發(fā)現(xiàn)這種IIM mRNA 定位于早期內(nèi)體，且以劑量依賴方式減少TLR7 配體R848 誘導(dǎo)的IFN-α產(chǎn)量。

以上研究結(jié)果表明SLE miRNA數(shù)量異常且部分miRNAs 功能異常。外泌體miR-21可作為分泌型炎癥介質(zhì)參與外泌體細(xì)胞間通訊過程，通過激活TLR7大量表達(dá)IFN，參與SLE病理過程。提示靶向miR-21及任何可能作為TLR 配體的miRNA 是抑制SLE 炎癥的一種新治療策略。未來可應(yīng)用小鼠模型進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21病理機(jī)制。

2.4 其 他miRNAs DENG 等［39］發(fā) 現(xiàn) 白 種 人SLE PBMC miR-3148 與TLR7 mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)。rs3853839 是TLR7-TLR8 區(qū)域內(nèi)唯一顯示與SLE 一致且獨(dú)立關(guān)聯(lián)的SNP，其G 等位基因及轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)與SLE 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)，而miR-3148 下調(diào)導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)G等位基因降解較慢，引起TLR7 mRNA水平升高。KAGA 等［31］發(fā)現(xiàn)SLE 患者PBMC IFN-α 表達(dá)上調(diào)，miR-181b 顯著下調(diào)，二者呈負(fù)相關(guān)，螢光素酶基因分析顯示miR-181b可靶向IFN-α。以上研究說明miRNA 可通過調(diào)節(jié)TLR7/9-IFN 通路多個(gè)關(guān)鍵分子在SLE中發(fā)揮病理作用。

3 結(jié)語

綜上所述，盡管目前SLE發(fā)病機(jī)制不明確，但越來越多的研究證實(shí)miRNA 在SLE 發(fā)病機(jī)制中的重要性。miRNA 可對TLR7/9 分子本身及TLR7/9-IFN通路關(guān)鍵信號(hào)級(jí)聯(lián)分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，亦可作為TLR 配體直接激活信號(hào)通路。未來的研究需進(jìn)一步探討SLE、miRNA 及TLR7/9-IFN 通路三者間聯(lián)系，挖掘miRNA 在預(yù)測疾病進(jìn)展、早期診斷、疾病活動(dòng)性評(píng)價(jià)方面作為標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)的潛力。