高川，姚宜山，周奎臣，付海洋，王金柱，梁霞霞，王瑜

（1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850；3.長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山西長治 046000）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）和肝硬化，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝細(xì)胞癌［1］。目前全球25%的人患有NAFLD［2］，并隨生活水平的提高NAFLD患病率持續(xù)上升［3-4］。奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA）是一種法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR），能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝的轉(zhuǎn)錄因子，主要作用是通過抑制編碼膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）的細(xì)胞色素P450 基因表達和提高膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白表達而減少膽汁酸［5］。此外，OCA 可有效降低NAFLD 患者脂肪變性，改善肝組織纖維化［6］，但其低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和總膽固醇（total cholesterol，TC）升高，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）降低，增加心血管疾病風(fēng)險等問題較為突出［7-8］。白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是一種抗衰老、抗氧化、抗炎和胰島素敏感的天然多酚化合物，對過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用［9］，可緩解炎癥刺激、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等產(chǎn)生的肝損傷［10］。另外，可通過調(diào)節(jié)脂代謝升高HDL、降低LDL 而降低心血管疾病風(fēng)險［11］，還可降低肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，減少心肌梗死面積而發(fā)揮對心肌梗死的治療作用［12］。本研究旨在探索OCA與RSV 聯(lián)用對NAFLD 的治療作用及其可能的作用機制，以期為OCA 聯(lián)合RSV 治療NAFLD 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

OCA，純度98%，廈門海樂景生化有限公司；白藜蘆醇，純度98%上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；SOD 和MDA 測試盒，南京建成生物工程研究所；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、甘油三酯（triglycerides，TG）、TC、HDL 和LDL 檢測試劑盒，美國貝克曼庫爾特有限公司；白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒，上海炫雅生物科技有限公司；兔抗小鼠沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirtuin 1，Sirt1）、NF-κB 和磷酸化NF-κB（p-NF-κB）單克隆抗體（一抗）及IRDye 800CW 熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（二抗），美國Cell Signaling Technology 公司；紫外可見分光光度計（型號UV-26001），津島儀器（蘇州）有限公司；全自動生化分析儀（型號AU5800），美國貝克曼庫爾特有限公司；多功能微孔板讀板機（型號Spectra Max i3x），美國Molecular Devices公司。

1.2 動物、NAFLD模型制備和分組

42 只SPF 級雄性C57BL/6N 小鼠〔許可證號：SCXK（京）2016-0006〕，6周齡，體重16～18 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。小鼠自由飲水和進食，定期更換墊料，在環(huán)境安靜、溫度23～25℃、相對濕度40%～60%和12 h晝夜交替條件下飼養(yǎng)。小鼠隨機分為正常對照組（8 只）和建模組（34 只），建模小鼠每周1 次ip 給予1% 四氯化碳（CCl4）5 mL·kg-1，同時飼喂高脂飼料（由15%豬油、2.8%膽固醇、0.28%甲硫氧嘧啶、0.7%膽酸鈉和81.2%普通飼料組成），持續(xù)28 d。隨機選取2 只小鼠，處死后觀察肝體積略增大，包膜緊張光滑，邊緣變鈍，質(zhì)地柔軟，色黃，有油膩感；切片觀察有大量脂滴視為NAFLD 模型制備成功。將建模小鼠隨機分為模型組、模型+RSV 組、模型+OCA 組和模型+OCA+RSV 組，OCA 和RSV 均30 mg·kg-1（參考文獻［13］），每組8 只；每天ig 給藥1 次，連續(xù)給藥28 d；正常對照組和模型組ig 給予等體積0.5%羧甲纖維素鈉混懸液。

1.3 樣本制備

給藥28 d 后，禁食不禁水12 h，次日對各組小鼠稱量體重，處死后取血于1.5 mL 離心管中，制備血清，-20℃冰箱中保存。取肝并稱重，于肝左葉切取2塊5 mm×5 mm×5 mm 肝組織，4%多聚甲醛固定，其余-80℃凍存。

1.4 計算肝指數(shù)

據(jù)1.3 體重和肝重計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝重（g）/體重（g）×100。

1.5 HE染色觀察肝組織病理變化

取1.3 制備的肝組織，經(jīng)石蠟固定、HE 染色后于200倍鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤、脂肪空泡、纖維化和組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 油紅O染色觀察肝組織脂質(zhì)沉積和脂滴面積

取1.3 制備的肝組織，OCT 包埋，冰凍切片，進行油紅O 染色，吸水紙吸干水分后甘油明膠封片。油紅O 染色后脂肪呈紅色，正常肝組織顯示青藍色。于顯微鏡鏡下（×200）觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變化，并用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0定量分析脂滴面積。脂滴面積百分比（%）=紅色脂滴覆蓋面積/總測量面積×100%。

1.7 全自動生化儀檢測血清GPT，GOT，TG，TC，HDL和LDL水平

取1.3 制備的血清，用全自動生化儀檢測小鼠血清GPT，GOT，TG，TC，HDL和LDL水平。

1.8 檢測血清SOD活性和MDA含量

取1.3 制備的小鼠血清，按試劑盒說明書檢測血清SOD活性和MDA含量。用紫外分光光度儀分別于550和532 nm波長檢測各孔吸光度值。

1.9 ELlSA檢測血清lL-1β，lL-6和TNF-α含量

取1.3 制備的血清，用ELISA 試劑盒檢測血清IL-1β，IL-6和TNF-α含量。

1.10 Western 印跡法檢測肝組織Sirt1，NF-κB 和p-NF-κB蛋白水平

取1.3 凍存肝組織，各組稱取50～100 mg 提取總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量。取等量蛋白，加入等體積上樣緩沖液，混勻后99℃恒溫金屬浴10 min。每孔上樣15 μL，80 V，電泳30 min，再用120 V 電壓電泳100 min。冰浴，200 mA 電流，轉(zhuǎn)膜100 mim。按1∶500 稀釋一抗，4℃孵育過夜；按1∶5000 稀釋二抗，室溫孵育120 min。以目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白相對表達水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯(lián)用對NAFLD 模型小鼠肝指數(shù)的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠肝指數(shù)明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+OCA 組、模型+RSV 組和模型+OCA+RSV 組小鼠肝指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。與模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV組肝指數(shù)明顯降低（P＜0.05），但與模型+OCA 相比，其肝指數(shù)降低不明顯。表明OCA與RSV聯(lián)用比RSV單用可更有效降低肝指數(shù)。

Tab.1 Effect of obeticholic acid（OCA）combined with resveratrol（RSV）on liver indexes of model mice with non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）

2.2 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯(lián)用對NAFLD 模型小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果如圖1顯示，正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞無脂變。模型組肝小葉界限不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，出現(xiàn)彌漫性脂肪變性，可見大小不等、數(shù)量不一的脂滴空泡。模型+OCA 組和模型+RSV 組肝小葉不清晰，肝細(xì)胞形態(tài)大致正常且大小較一致，部分肝細(xì)胞輕度水樣變性，脂滴空泡減少。模型+OCA+RSV 組肝小葉清晰，肝細(xì)胞大小較一致且形態(tài)正常，脂滴空泡減少，脂質(zhì)沉積程度減輕。

2.3 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯(lián)用對NAFLD 模型小鼠肝細(xì)胞中脂質(zhì)沉積的影響

如圖2A 所示，正常對照組小鼠肝細(xì)胞幾乎無紅染，無脂變。模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴被染成紅色，大小不一，廣泛分布在胞質(zhì)中，提示大量肝細(xì)胞內(nèi)存在脂質(zhì)沉積。模型+OCA 組和模型+RSV 組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴減少，脂質(zhì)沉積程度有所減輕。模型+OCA+RSV 組肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴減少，脂質(zhì)沉積程度減輕。如圖2B 所示，與正常對照組相比，模型組脂滴面積百分比明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+OCA 組、模型+RSV 組和模型+OCA+RSV 組脂滴面積百分比明顯降低（P＜0.01）。與模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV組脂滴面積百分比明顯減低（P＜0.01）。

2.4 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯(lián)用對NAFLD 模型小鼠肝功能和血脂的影響

由表2 可知，與正常對照組相比，模型組血清GPT，GOT，TG，TC 和LDL 水平明顯升高，HDL 水平明顯降低（P＜0.01），提示模型小鼠發(fā)生肝損傷和血脂紊亂。與模型組相比，模型+OCA 組血清GPT，HDL 和LDL 水平變化均不明顯，GOT，TG 和TC 水平明顯下降（P＜0.05）；模型+RSV 組血清GPT，GOT和HDL水平變化不明顯，TG，TC和LDL水平明顯下降（P＜0.01）；模型+OCA+RSV 組血清GPT，GOT，TG，TC 和LDL 水平均明顯下降（P＜0.01），HDL 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型+OCA 組相比，模型+OCA+RSV 組GPT，TC 和LDL水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV組GPT和GOT水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL水平明顯升高（P＜0.05）。

2.5 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯(lián)用對NAFLD 模型小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

由表3可知，與正常對照組相比，模型組小鼠血清SOD 活性明顯降低，MDA 含量明顯升高（P＜0.01），提示模型小鼠肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激。與模型組相比，模型+OCA 組SOD 活性明顯升高（P＜0.01），MDA 含量下降（P＜0.05）；模型+RSV 組SOD 活性明顯升高（P＜0.01）；模型+OCA+RSV 組SOD 活性明顯升高，MDA 含量明顯下降（P＜0.01）。與模型+OCA 組和模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV 組SOD 活性變化不明顯，但MDA 含量明顯降低（P＜0.01）。表明兩者聯(lián)合用藥比兩者單用具有更好的抗氧化應(yīng)激作用。

Tab.2 Effect of OCA combined with RSV on levels of serum glutamic pyruvic transaminase（GPT）, glutamic oxaloacetic transaminase（GOT）, triglyceride（TG），total cholesterol（TC），high-density lipoprotein（HDL）and lowdensity lipoprotein（LDL）of model mice with NAFLD

Tab.3 Effects of OCA combined with RSV on serum superoxide dismutase (SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content of model mice with NAFLD

2.6 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯(lián)用對NAFLD模型小鼠血清lL-1β，lL-6和TNF-α水平的影響

由表4可知，與正常對照組相比，模型組小鼠血清IL-1β，IL-6 和TNF-α 水平明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，模型+OCA 組IL-1β 水平變化不顯著，IL-6和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；模型+RSV 組IL-1β，IL-6 和TNF-α 水平明顯降低（P＜0.01）；模型+OCA+RSV組IL-1β，IL-6和TNF-α水平均明顯降低（P＜0.01）。與模型+RSV 組相比，模型+OCA+RSV 組IL-6 水平明顯降低（P＜0.01）。與模型+OCA 組相比，模型+OCA+RSV 組IL-1β 和IL-6明顯降低（P＜0.01）。

Tab.4 Effect of OCA combined with RSV on serum interleukin-1β（lL-1β），lL-6 and tumor necrosis factor-α（TNF-α）levels of model mice with NAFLD

2.7 奧貝膽酸與白藜蘆醇聯(lián)用對NAFLD模型小鼠肝組織Sirt1，NF-κB和p-NF-κB蛋白表達水平的影響

由圖3可知，與正常對照組相比，模型組肝組織Sirt1 蛋白表達水平明顯降低，NF-κB 和p-NF-κB 表達水平明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，模型+OCA組Sirt1，NF-κB和p-NF-κB蛋白表達水平無明顯變化；模型+RSV 組Sirt1 蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01），NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；模型+OCA+RSV 組Sirt1 蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01），NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），且p-NF-κB 蛋白表達水平較模型+OCA組明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，OCA 與RSV 聯(lián)用可降低NAFLD 模型小鼠血清MDA 水平，同時Sirt1 蛋白表達水平升高，NF-κB 表達水平降低，IL-6，IL-1β 和TNF-α 分泌降低。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑的消耗和炎癥反應(yīng)在NAFLD 形成中具有重要作用，是對肝“二次打擊”的主要形式，隨后肝細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡，促使NAFLD 向NASH 進展［14］，過氧化產(chǎn)物MDA 含量可體現(xiàn)細(xì)胞受氧自由基損傷程度［15］。NF-κB是至關(guān)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，促進炎癥因子IL-6，IL-1β 和TNF-α 分泌［16］。高脂飲食可激活NF-κB，升高肝組織IL-6，IL-1β 和TNF-α 水平［17］。Sirt1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性酶［18］，Sirt1 可使NF-κB 亞基去乙?；⒁种破滢D(zhuǎn)錄活性［19］，減少炎癥因子分泌，抑制炎癥對NAFLD 的肝損傷，而阻止從NAFLD 進展為NASH。本研究結(jié)果表明，OCA 與RSV 聯(lián)用清除體內(nèi)MDA 能力增加，減輕肝脂質(zhì)過氧化，提高抗氧化能力，同時增加Sirt1 表達并抑制NF-κB 激活，提示OCA 與RSV 聯(lián)用可能通過Sirt1/NF-κB 途徑減少IL-6，IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子分泌，降低NAFLD 氧化應(yīng)激對肝“二次打擊”和炎癥因子對肝的損傷。

本研究結(jié)果表明，OCA 與RSV 聯(lián)用在改善NAFLD 組織和血清指標(biāo)的同時，可更顯著降低TC和LDL 水平，升高HDL 水平，與前期相關(guān)研究結(jié)果［20］一致。有研究表明，OCA 在降低NAFLD 患者肝脂肪水平時，血清LDL 和TC 升高，HDL 降低，從而使心血管疾病風(fēng)險增加［8］。TC 增加會導(dǎo)致動脈硬化，誘發(fā)心血管疾病，可作為準(zhǔn)確預(yù)測心血管風(fēng)險的指標(biāo)［20-21］，同時HDL降低和LDL升高也是心血管疾病發(fā)病的重要因素［22］。本研究結(jié)果表明，OCA與RSV 聯(lián)用還改善了OCA 在脂蛋白和血脂調(diào)節(jié)能力的不足，從而降低了OCA 單用時TC 和LDL 升高、HDL降低導(dǎo)致的心腦血管等風(fēng)險。

綜上所述，OCA 與RSV 聯(lián)用可提高抗氧化應(yīng)激能力，并通過調(diào)節(jié)Sirt1 和NF-κB 蛋白表達及NF-κB 活化減少炎癥因子分泌，從而減輕NAFLD模型小鼠肝損傷，阻止NAFLD 進一步發(fā)展；還可調(diào)節(jié)血脂和脂蛋白，降低OCA單用帶來的心血管疾病風(fēng)險。本研究結(jié)果為OCA 與RSV 聯(lián)用治療NAFLD提供了實驗依據(jù)。