張瓊丹 陳朝霞 李芾瑤 張 宇*

（東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院，生物電子學國家重點實驗室，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，南京 210096）

小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），也被稱為沉默RNA、短干擾RNA 或非編碼RNA。siRNA 是生物針對外源侵入基因所表達的雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）進行切割后生成的具有特定長度和序列的小片段RNA，siRNA的特定長度為21～25 bp［1］。這些siRNA 可以通過RNA 干擾作用特異性沉默耐藥相關基因的表達來改善化療藥物的抗癌效果。RNA 干擾于1998年首次在哺乳動物細胞中被發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ire 等［2］向秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）中遞送長片段的dsRNA，結果顯示dsRNA 能有效沉默目標基因表達。此后，逐漸發(fā)現(xiàn)RNA 干擾是由雙鏈RNA 誘導同源mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。這種誘導基因沉默的機制是通過阻礙特定基因的翻譯從而抑制特定基因的表達，是真核生物細胞的一種重要防御機制［3］。2001年，Elbashir等［4］將干擾RNA 應用于人類疾病的治療，用實驗證明了合成的siRNA 可以限制一個基因在哺乳動物的不同細胞系中特異性排列的方式。2004年，第一個以siRNA 為基礎的RNA 藥物（治療濕性年齡相關性黃斑變性）進入I 期臨床試驗［5?6］。2010年，第一次應用于腫瘤患者的有針對性的納米顆粒輸送系統(tǒng)進入I 期臨床試驗，siRNA 開始系統(tǒng)性地應用于實體瘤［7］。從此siRNA 的研究進入全新的領域，開始了快速發(fā)展的階段。

1 RNA干擾

1.1 RNA干擾作用機制

RNA 干擾是一種RNA 分子作用的過程，它通過與目的基因序列的編碼互補，從而誘導降解相對應的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA），阻止mRNA翻譯成蛋白質［8?9］。RNA干擾通過傳遞小RNA發(fā)揮作用， 包 括siRNA、 微 小RNA（microRNA， miRNA）、 短發(fā)卡RNA （small hairpin RNA，shRNA）和內切酶底物RNA（dicer siRNA，dsiRNA）等形式［10］。其中，shRNA 的作用途徑在最上游，其發(fā)揮效用需要細胞核加工；其次是dsiRNA，其發(fā)揮效用需要內切酶處理［11］。而siRNA 和miRNA 是目前研究的核心，其作用途徑是直接輸送到RNA 誘導沉默復合物（RNA?induced silencing complex，RISC），二者不同之處是：miRNA 并不需要完全與目標序列配對，而siRNA則需要完全與目標序列配對，這種差異導致miRNA 和siRNA 發(fā)揮不同的基因沉默效果；同時miRNA 抑制翻譯，而siRNA 誘導Argonaute?2 蛋白降解。哺乳動物細胞中miRNA 與siRNA 介導的RNAi機制如圖1所示［12］。哺乳動物初級miRNA轉錄本（pri?miRNA）在細胞核中轉錄（①）并被微處理器復合體（Drosha?DGCR8）切割以產生約30 bp shRNAs（②），稱為pre?miRNA。輸出蛋白5（Exportin 5） 結 合 并 運 輸pre?miRNA 到 細 胞 質（③），在細胞質中它與Exportin 5 脫離（④）并與Dicer 和TAR RNA 結 合 蛋 白（TAR RNA?binding protein，TRBP）結合（⑤）（也有非Dicer 介導的途徑）。Dicer切割pre?miRNA的末端環(huán)（⑥）并誘導形成RISC 裝載復合物（RISC?loading complex，RLC）， 與Argonaute （Ago1?Ago4） 蛋 白 結 合（⑦）。選擇反義鏈并將其裝載到Ago1?Ago4中，并丟棄正義鏈（⑧）。成熟的RISC 可以通過抑制mRNA 翻譯、誘導mRNA 在細胞質P 體和/或GW體中的螯合、促進mRNA 降解和指導靶基因位點的轉錄基因沉默來調節(jié)基因表達（⑨）。Argonaute、GW182 和反義鏈對于RISC 的mRNA沉默活性至關重要。TRBP 和Dicer 可以在反義鏈裝載后與成熟的RISC 分離。與反義鏈的種子區(qū)域（從5′端開始的第2～8 個堿基）互補的mRNA 即可受到RNAi的影響。合成的siRNA通過胞吞作用進入細胞質，隨后發(fā)生內涵體逃逸（⑩）。siRNA 隨后直接與胞質RNAi 酶（Dicer 和TRBP）相互作用（?），通過Dicer 介導或非Dicer 介導的途徑形成RLC （?） 并進行鏈選擇以產生成熟的RISC（?）。siRNA 反義鏈通常與單個靶標mRNA 具有完全互補性，以誘導有效且靶向范圍窄的基因沉默（?）。Ago2對于RNAi療法尤其重要，因為它具有內在的剪切活性，可以有效地切割mRNA 靶標（?）。

Fig.1 A model for the mechanism of RNAi圖1 RNA干擾作用機制模式圖

1.2 RNA干擾的應用

由于RNA 干擾的有效性和選擇性，它已成為沉默哺乳動物細胞中特定基因表達的首選方法。通過RNA干擾特異性沉默治療，在病毒感染、癌癥、家族遺傳病和自身免疫病等方面有著廣泛的應用［13］。由一個或幾個基因的異常表達引起的各種人類疾病都適合使用基于RNA 干擾干預的治療策略，包括顯性遺傳疾病、病毒感染、癌癥和自身免疫疾病等［14］。首要的RNA干擾治療應用是針對遺傳疾病的治療，如突變等位基因轉錄物中的單核苷酸多態(tài)性可用作RNA 干擾的選擇性靶標。Miller等［15］在實驗中使用siRNA 作為RNA 干擾研究核心，siRNA僅直接選擇性地降解突變轉錄物，盡管突變型與野生型序列只有一個錯配，但實驗中野生型轉錄本仍可保持完整。RNA 干擾也可用于抑制病毒感染。McCaffrey 等［16］首次利用體內RNA 干擾治療乙肝，實驗中使用高壓尾靜脈注射共遞送乙型肝炎復制子和編碼抗乙肝病毒（HBV） 的shRNA，利用其pol III表達體系來治療乙肝，可以實現(xiàn)肝細胞中99%的HBV 核心抗原的敲除。除了上述應用之外，將RNA 干擾用于癌癥治療具有非常廣闊的前景，可以徹底改變這種破壞性疾病的治療方法。

在腫瘤的發(fā)生和后續(xù)發(fā)展過程中涉及到多種基因的非正常表達和功能異?；?。而造成這些基因功能異?；袃蓚€原因：一是由于正?；虻倪^度表達造成的；二是由于正?；虬l(fā)生突變而產生的功能異常的等位基因，因此腫瘤在一定程度上也可被稱為基因疾病。近年來隨著對腫瘤致病機制的深入研究，以腫瘤細胞內信號轉導通路的關鍵激酶為藥物篩選靶點成為抗腫瘤藥物研究的新途徑，通過這種途徑可以獲得高效、低毒及高特異性的新型靶向藥物。目前，正處于研究或臨床應用的新型靶向藥物一般都屬于疾病基因或靶基因的抑制劑，其通過在腫瘤細胞中沉默相關高表達的疾病基因或靶基因，從而有效地抑制腫瘤生長。而RNA 干擾能夠簡單高效地沉默靶基因的表達，因此利用RNA 干擾可以起到與靶向藥物相同的作用。而且，靶向抑制劑主要直接作用于蛋白質，但是通過這種方式可能會干擾其他蛋白質的表達；而siRNA 則主要作用于mRNA，其能夠特異性抑制靶基因的表達，作用位點專一，通常不影響正?；虮磉_，因此siRNA作為靶向藥物應用時，會具有更好的選擇性及特異性。理論上，通過siRNA 幾乎能夠抑制體內任何基因的表達，使得siRNA 比現(xiàn)在廣泛應用的小分子靶向藥物更具有治療和應用潛力［17］。

1.3 siRNA藥物的優(yōu)勢

siRNA 藥物由于其不同于其他藥物的獨特性質，相較于其他藥物，在某些疾病治療上展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢（圖2），主要表現(xiàn)在以下方面：

a. siRNA 可以通過序列設計靶向不同的靶基因［18］，從而實現(xiàn)對不同疾病的治療；同時這種設計是快速的，并且具有高效的沉默效果。除此之外，siRNA的合成不需要細胞表達系統(tǒng)，不用像蛋白質藥物需要經過表達、純化等繁瑣的步驟。

b.siRNA的沉默效果是瞬時的，并不會敲除靶蛋白的表達基因［19］。因此，如果作為研究對象的目的基因是生存所必需的，或是想研究隨時間推移靶蛋白表達降低的影響，siRNA 是非常合適的工具。

c.siRNA的靶點特異性強。對于同一個家族的激酶而言，小分子抑制劑常會出現(xiàn)脫靶效應而產生副作用，而使用siRNA 作為藥物可以通過序列的精確設計盡可能減少脫靶的產生。

d.siRNA的效果容易被檢測。siRNA的作用機理簡單，通過直接降解靶基因的mRNA，達到降低靶基因表達的效果。故檢測降低效果時，可以通過定量反轉錄PCR（qRT?PCR）檢測mRNA 的含量；也可以通過免疫印跡（Western Blot）等方法直接檢測蛋白質水平的表達量。而小分子抑制劑通常是通過結合蛋白質的特定位點，影響蛋白質的活性，但是靶基因本身的mRNA 和蛋白量并沒有發(fā)生變化，需要嘗試其他方法才能檢測小分子的效果。

正是由于siRNA 藥物表現(xiàn)出的一系列優(yōu)勢，近年來，siRNA藥物越來越受到重視，與其有關的研究也越來越多。

Fig.2 The advantage of siRNA drugs圖2 siRNA藥物的優(yōu)勢

2 siRNA納米遞送系統(tǒng)與上市藥物

2.1 siRNA納米遞送系統(tǒng)

siRNA是一種很有前景的治療解決方案，通過轉錄后基因調控解決基因過表達或突變引起的多種病理狀況，如病毒感染、癌癥、遺傳疾病和自身免疫性疾?。ㄈ珀P節(jié)炎）［20］。由于其特異性、適應性和廣泛的靶向能力，它在多種疾病的個性化基因治療中也很有效。然而，裸siRNA 在血流中不穩(wěn)定，除了具有免疫原性外，還不能有效地穿過細胞膜。因此，精確設計遞送系統(tǒng)對于充分發(fā)揮這種療法的潛力至關重要。

藥物遞送系統(tǒng)是用于靶向遞送和/或控制釋放治療劑的工程技術。目前，將納米載體遞送技術與RNA 干擾技術結合，已經成為一種新型基因藥物遞送系統(tǒng)，這種體系能夠有效遞送siRNA 進入人體。納米級尺寸的粒子可通過增強的滲透與滯留效應，從而聚集在腫瘤細胞周圍。納米粒子的尺寸、形狀、表面性質、剛性都會影響藥物對癌癥治療的效率。納米載體通常以納米粒、納米膠束、納米水凝膠和高聚物作為藥物或基因的載體，同時可在表面鍵合靶向性分子，如抗體、核酸適體、靶向肽或葉酸等，通過與細胞表面相互作用進入靶細胞。目前納米載體用來包載的基因主要包括：DNA、 RNA （siRNA）、 反 義 寡 核 苷 酸 藥 物（antisense oligodeoxynucleotides， AODNs） 和microRNA等［21?22］。

2.2 siRNA納米藥物

自從2006年RNA 干擾的研究獲得諾貝爾獎，大型制藥公司已經投入了數(shù)十億美元用于人類基因沉默治療的開發(fā)。對于藥物開發(fā)人員而言，siRNA療法的潛力是不容忽視的。siRNA 具有很強的藥效，功能多樣，能夠對傳統(tǒng)小分子藥物“無成藥性”的蛋白質編碼基因進行抑制，并且具有制備“可編程”藥物的潛力，可以在不改變體內藥代動力學的情況下實現(xiàn)重新靶向［12］。siRNA 療法的治療潛力是深遠的，許多基于siRNA的藥物正在開發(fā)中，用于治療從病毒感染、心血管疾病到遺傳性疾病與癌癥的各類病癥［23?25］（附件表S1）。利用siRNA的這些獨特特性，一些siRNA遞送系統(tǒng)最近已進入臨床試驗階段（表1），并作為一種非常有效和有前景的癌癥治療方法而被研究者廣泛研究。藥物開發(fā)過程極其艱巨，旨在克服復雜的生理障礙，有效、安全地將siRNA遞送到所需的組織和細胞，以及增強siRNA的穩(wěn)定性與特異性，降低其潛在脫靶效應［26］。

2018年8月標志著RNA 干擾治療的新紀元，美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準了首個基于RNA 干擾的 藥 物 Onpattro （Patisiran， 也 稱 為 ALN?TTR02）［12］，由美國Alnylam 制藥公司（Alnylam Pharmaceuticals）研發(fā)（表2）。Patisiran 的批準為醫(yī)療需求未得到滿足的遺傳性運甲狀腺素蛋白淀粉樣 變 性 （hereditary transthyretin?mediated amyloidosis，hATTR）患者帶來了新希望，并預示了RNA 干擾治療領域的新時代。2019年11月20日，Alnylam 公司的第二種RNA 干擾藥物Givlaari（Givosiran）獲得FDA 批準［27?28］。一年后的11月23日，該公司的第三種藥物Oxlumo（Lumasiran）獲得批準［29］。如今，針對肝臟，腎臟和眼部適應癥的多種候選藥物正在I、II 和III 期臨床試驗中，并且針對中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS） 和其他非肝組織的研究性新藥（investigational new drug，IND）應用有望在未來兩年實現(xiàn)。在接下來的10年中，隨著RNA干擾途徑新功能的發(fā)現(xiàn)、具有增強的特異性和藥效的先進RNA 干擾負載策略的開發(fā)，以及全身和局部RNA干擾遞送方法的持續(xù)創(chuàng)新，RNA 干擾領域新的突破性療法將會不斷涌現(xiàn)。

Patisiran 是這3 種上市藥物中較典型的siRNA納米遞送系統(tǒng)。2018年8月10日，F(xiàn)DA 批準了作用 于 肝 臟 的siRNA 藥 物Patisiran （Onpattro；Alnylam 制藥）［12］。Patisiran 是用于治療運甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）淀粉樣變性的siRNA脂質納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）。hATTR是一種罕見的、遺傳性的、威脅生命的神經退行性疾病，由TTR 淀粉樣蛋白沉積在周圍神經系統(tǒng)、心臟、胃腸道和其他器官中導致?；颊哂羞M行性神經病、心肌病、行動障礙和其他各種衰弱的癥狀，診斷后中位生存期為5～15年。

Table 1 siRNA delivery systems in clinical trials表1 臨床試驗中的siRNA納米遞送系統(tǒng)

Table 2 FDA approved siRNA drugs表2 FDA批準上市的siRNA藥物

大多數(shù)TTR 蛋白在肝臟中產生。TTR 中有超過120 個突變可引起hATTR。在開發(fā)Patisiran 之前，藥物治療的選擇僅限于將TTR 四聚體穩(wěn)定在其天然構象的小分子藥物。盡管這些方法可以減慢疾病的進展，但是仍然迫切需要更有效的治療選擇。

Patisiran siRNA（ALN?18328）通過沉默肝細胞中的野生型和突變型TTR mRNA 來降低TTR 蛋白的血清水平。為了對TTR mRNA 變體實現(xiàn)廣泛的沉默活性，反義鏈靶向mRNA 的3′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），這段序列據(jù)推測在患者人群中變異性較小。與臨床開發(fā)中的大多數(shù)siRNA不同，ALN?18328并非經過完全修飾、代謝穩(wěn)定的siRNA，并且沒有靶向配體來增強肝細胞的攝取，而是通過將ALN?18328 封裝在用于肝細胞攝取的固體脂質納米粒（LNP）中來實現(xiàn)遞送（圖3）。Patisiran 由與脂質賦形劑復合的siRNA 組成。這些成分在酸性pH 值下組裝成LNP，并每3 周（q3w）靜脈注射一次，劑量為0.3 mg/kg，siRNA靶向TTR基因的3′非翻譯區(qū)，該基因編碼運甲狀腺素蛋白，以沉默所有可能存在編碼區(qū)突變的mRNA。RNAi 沉默導致循環(huán)TTR 蛋白含量持續(xù)減少至30% 以下，有效阻止TTR 淀粉樣蛋白的沉積。

Fig.3 The therapeutic mechanism of Patisiran圖3 Patisiran的治療機制

在臨床上測試了兩代LNP 制劑：ALN?TTR01和ALN?TTR02。ALN?TTR02（現(xiàn)在稱為Patisiran）是一種“第二代”聚乙二醇化LNP，包含膽固醇、極性脂質（distearoylphosphatidylcholine，DSPC）、聚乙二醇脂質（PEG2000?C?DMG）和可電離的氨基脂質（DLin?MC3?DMA），在pH 值為7 時呈中性，但在酸性pH值下（最佳pKa為6.44）變?yōu)殛栯x子。siRNA?LNPs通過在酸性pH下（當DLin?MC3?DMA 為陽離子時）siRNA 和脂質賦形劑之間的靜電相互作用組裝。組裝后，LNP表面上的PEG2000脂質在儲存過程中保持顆粒穩(wěn)定性。在全身循環(huán)中，PEG2000?C?DMG 丟失并被血清蛋白，尤其是載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）取代，后者與摻入LNP 脂質基質的膽固醇分子相互作用。在肝臟中，肝細胞吸收被ApoE覆蓋的LNPs，然后將其發(fā)送至內涵體，在內涵體的酸性pH 下引起氨基脂質成分的再離子化，從而導致顆粒分解。解體的脂質小球（借助DLin?MC3?DMA 展開的脂質尾部構型幫助）與內涵體膜之間發(fā)生靜電和疏水相互作用，從而幫助siRNA逃逸到細胞質中。與使用較早的可離子化脂質（DLin?DMA）ALN?TTR01 相比，Patisiran在體內的效力提高了10倍以上。

Patisiran的III期、雙盲、安慰劑對照臨床試驗（APOLLO）于2013年12月開始招募，共招募了225 例hATTR 多發(fā)性神經病患者。在研究過程中，一些患者接受了Patisiran，并將其結果與接受安慰劑的患者進行了比較。18個月后，接受Patisiran治療的患者TTR 蛋白平均降低了84%。從研究開始到第18 個月，與服用安慰劑的患者相比，接受Patisiran的患者神經功能和生活質量顯著改善。在接受Patisiran治療的患者中，56%從研究開始就表現(xiàn)出神經功能的改善，而接受安慰劑的患者中僅有4%；51%從研究開始就表明生活質量得到了改善，而接受安慰劑的患者中僅有10%；對于神經功能未改善的患者，與接受安慰劑的患者相比，神經病變的進展得到減緩。

2.3 siRNA藥物臨床開發(fā)中的困難

siRNA藥物臨床開發(fā)的進步，促進了siRNA藥物開發(fā)過程的日益成熟。但其中遇到的許多挫折，也使藥物開發(fā)過程更加復雜。從中吸取的主要經驗教訓包括：使用正確的動物模型來預測藥物安全性和藥物活性；使賦形劑具有盡可能低的復雜性和毒性，以簡化其制造、儲存和臨床測試過程；降低發(fā)生重大不良反應的風險［12］。使用正確的體外和體內模型準確預測藥物毒性和效力至關重要。不同的模式生物對寡核苷酸和賦形劑可能有不同的反應。RNAi 藥物的一個特殊問題是，它們的毒性和活性在很大程度上取決于動物模型轉錄組中存在或缺失的序列。在小鼠中不會引起脫靶效應的siRNA 很可能在人類中具有無法忍受的脫靶RNAi活性。相反，在沉默小鼠基因方面效果良好的siRNA 可能對人類基因幾乎沒有活性。

除此之外，需要考慮的重要因素是賦形劑（如納米顆粒、聚合物、肽和蛋白質）的復雜性、均一性、穩(wěn)定性、遞送效率和毒性。脂質體和聚合物納米顆粒已被廣泛用于提高siRNA 的穩(wěn)定性并改善藥代動力學特性，但它們仍然面臨一些生理屏障而導致遞送效率降低，同時其規(guī)?；圃炀哂泻艽筇魬?zhàn)性，并且所得產品通常在顆粒組成、顆粒特性和載藥量方面具有一定程度的異質性，從而更難以在臨床開發(fā)過程中建立治療窗口。此外，顆粒在儲存或給藥后會變得不穩(wěn)定，并釋放分解產物，從而導致難以追蹤的毒性。同樣，盡管內涵體溶解賦形劑，如蜂毒肽，可以顯著改善RNAi試劑的內涵體逃逸，但它們也可能具有潛在的毒性。2016年，Arrowhead公司報告稱，他們的EX1賦形劑是一種修飾以聚乙二醇的GalNAc（N?乙酰半乳糖胺）偶聯(lián)的蜂毒肽樣內涵體溶解肽，但是在安全性研究中，高劑量給藥導致了幾種非人類靈長類動物的死亡［12］。雖然試驗動物死亡的確切原因尚未披露，但使用EX1 的3 種藥物（ARC?520、ARC?521 和ARC?AAT）的臨床開發(fā)已停止，盡管它們的初步臨床試驗結果頗具前景。

3 siRNA納米藥物遞送的主要挑戰(zhàn)

RNA 干擾途徑可以調控人類細胞中幾乎所有mRNA的穩(wěn)定性以及翻譯過程。siRNA分子可以有效觸發(fā)特定基因的RNA 干擾沉默，但是其治療用途卻面臨著安全性和有效性的眾多挑戰(zhàn)［12］。高效與無毒的遞送是siRNA 藥物發(fā)揮作用的關鍵，并且是siRNA技術與其治療應用之間的最大障礙。

siRNA遞送的難易程度部分取決于體內靶器官或組織的可到達性［30］。局部siRNA 遞送，即直接將siRNA 治療應用于靶組織，具有許多好處，包括在接近靶組織的情況下，藥物具有更高的生物利用度，以及與全身性給藥相關的不良反應會大大減少。相比之下，全身遞送意味著靜脈注射遞送納米藥物顆粒，然后在整個體內傳播至靶器官或組織，這要求顆粒具有避免被非靶組織吸收和清除的能力。用于全身給藥的siRNA 制劑在到達靶細胞的細胞質之前，在體內面臨著一系列生理障礙。注射后，siRNA 復合物必須在機體的循環(huán)系統(tǒng)中航行，同時避免腎臟過濾、吞噬細胞攝取、血清蛋白聚集以及內源核酸酶的酶促降解。所以必須對遞送系統(tǒng)進行改造，以具備對血清核酸酶的穩(wěn)定性、逃避免疫系統(tǒng)、避免與血清蛋白和非靶細胞的非特異性相互作用、預防腎臟清除、從血管中出來到達靶組織、進入細胞和整合入RNA 干擾機制的能力（圖4）［23，31?32］。

siRNA遞送首先要面臨的挑戰(zhàn)是血液循環(huán)中的降解及清除。在血管中，存在血清核酸酶降解、調理素介導的吞噬作用；此外，腎小球濾過以及siRNA與血清組分的非特異性結合都會導致siRNA在血液循環(huán)中不穩(wěn)定，從而使其半衰期縮短（＜10 min），最終阻礙siRNA在所需組織中的積累。裸露的siRNA 進入血液后，會被RNAase A 型血清核酸酶降解并刺激先天免疫系統(tǒng)［33?36］。未經修飾的siRNA太大（～13 ku）且?guī)в羞^多負電而無法穿過細胞膜［30，37?38］。納米顆粒載體具有克服血管內降解的潛力，并且可以安全有效地遞送siRNA，通過被動或主動靶向增強藥物在腫瘤部位的積累［39?42］。與血清成分的相互作用可以多種方式影響siRNA 的遞送。進入血液后，納米粒子會遇到充滿血漿蛋白和免疫細胞的復雜環(huán)境。循環(huán)中的免疫細胞（例如單核細胞、白細胞、血小板和樹突狀細胞）對納米顆粒的攝取會通過各種途徑發(fā)生，并且調理素在顆粒表面的吸附會促進納米顆粒被攝?。?3］。具有高表面正電荷的遞送粒子可能會與紅細胞發(fā)生不利的聚集［44］。血清調理素蛋白可能會吸附在遞送載體顆粒的表面上，標記它們以供單核吞噬細胞系統(tǒng)（mononuclear phagocytic system，MPS）攝?。?5］。MPS 的調理作用和隨后的攝取是一種常見的途徑，通過該途徑可以清除血液中的遞送系統(tǒng)并阻止其達到靶標［37］。另外，納米顆粒表面的物理和化學性質，例如大小與表面電荷，可導致溶血、血栓形成和補體激活，從而導致生物分布改變以及潛在的毒性［43］。

Fig.4 Overcoming the biological barriers of RNAi delivery圖4 克服siRNA遞送過程中的生理屏障

siRNA離開血液的一種主要途徑是通過腎臟清除。腎小球提供了物理過濾屏障，可以使水和小分子進入新生尿液中，而大分子則保留在循環(huán)中［46］。腎小球濾過屏障的孔徑約為8 nm［47?48］。裸露的siRNA 長度約為7～8 nm，直徑約為2～3 nm。該分子太大，無法穿過細胞膜，但又小到足以被腎小球清除［49］。因此，一旦siRNA 離開血液，它們將在膀胱中積聚，并在幾分鐘至半小時內迅速從體內排出，從而阻止了它們在靶組織或細胞中的積累［26，50］。同時，一些納米顆粒遞送系統(tǒng)易在腎小球中發(fā)生分解。例如，當與腎小球基底膜的帶負電荷的蛋白聚糖接觸時，由靜電相互作用形成的顆粒可能會破裂，從而使siRNA“貨物”被過濾到尿液中［51?52］。

從血液中流出并穿過血管內皮屏障對將siRNA遞送至體內許多組織提出了重大挑戰(zhàn)。沒有被腎臟降解、吞噬或清除的siRNA遞送系統(tǒng)必須通過穿越血管內皮到達其他組織而離開血流。毛細血管孔尺寸限制了外滲顆粒的尺寸上限。通常，直徑大于5 nm 的分子不易穿過毛細血管內皮，因此將保留在循環(huán)系統(tǒng)中，直到從身體清除為止［30］。但是，某些內皮不連續(xù)的組織允許較大的分子進入，包括肝臟、脾臟和一些腫瘤［23］。這些器官允許直徑高達200 nm 的分子通過，可以容納典型的藥物遞送納米載體。肝內皮的窗孔使直徑為100～200 nm 的分子從血流中擴散出來，并進入肝細胞［53?54］。

組織滲透也是siRNA給藥的困難所在。納米藥物在腫瘤部位的穿透性差主要是由于腫瘤微環(huán)境，同時也與納米顆粒的性質有關。為了將siRNA安全有效地遞送至目標mRNA，必須協(xié)調許多變量。盡管納米顆粒的大小在1～1 000 nm 范圍變化，但已經清楚的是，直徑大于100 nm 的靜脈內注射顆粒很可能會被網狀內皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）截留在肝、脾、肺和骨髓中，導致被活化的單核細胞和巨噬細胞降解。與正常毛細血管相比，腫瘤血管的形狀不規(guī)則，存在缺陷，滲漏且寬度不等［55］。腫瘤周圍有足夠的異源血供，但腫瘤中心的異源血供減少，這就要求納米顆粒向腫瘤中心移動的距離增加［56］。實體瘤中較高的組織液壓力也會對納米顆粒的擴散提出挑戰(zhàn)。組織液壓力（interstitial fluid pressure，IFP）從腫瘤外周向腫瘤中心升高，阻礙了納米顆粒從外周血管滲出后向腫瘤深部擴散［57］。

腫瘤微環(huán)境中的細胞外影響因素也對siRNA遞送提出挑戰(zhàn)。siRNA復合物離開血流后，必須穿過復雜的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）才能到達癌細胞。細胞外基質是由多糖和纖維蛋白組成的致密網絡，可對大分子和納米顆粒的運輸產生抵抗力［58?61］。這會減緩甚至停止藥物遞送過程，并為納米顆粒被駐留巨噬細胞攝取提供了額外的機會。吞噬作用在血流中與組織的細胞外基質中都是重要的免疫屏障。吞噬細胞（例如巨噬細胞和單核細胞）從體內清除異物，以防止病毒、細菌和真菌感染。但與此同時，吞噬細胞也會從體內有效地去除某些治療性納米復合物和大分子，所以在設計藥物輸送載體時必須采取措施以避免調理作用［31］。與胰腺癌有關的結締組織增生是復雜的腫瘤微環(huán)境在達到藥物治療濃度方面提出挑戰(zhàn)的一個很好的例子［62］。ECM的生物學、化學和物理特性可能導致納米顆粒提前解體并釋放其內含物。與中性納米顆粒相比，帶有正電荷或負電荷的粒子更常發(fā)生巨噬細胞的吞噬作用，例如被肝臟中的庫普弗細胞或淋巴結中的樹突狀細胞攝?。?3］。除了巨噬細胞的吞噬作用之外，嗜中性粒細胞也會捕獲納米顆粒［63］。

細胞內運輸是siRNA 遞送的最后一道關卡。大多數(shù)siRNA 遞送系統(tǒng)通過內吞作用進行細胞內化。顆粒被靶細胞攝取后，必須逃逸內涵體以到達細胞質［64］。如果siRNA 納米復合物無法逃逸出內涵體，它將通過pH不斷降低的內膜隔室進行運輸，并在溶酶體中發(fā)生降解［65］。一旦被內吞，胞內運輸即開始于早期的內吞囊泡。這些囊泡隨后與早期內涵體融合，并進一步成熟為晚期內涵體［66］。這些晚期內涵體會被膜結合的質子泵ATPase 酸化（pH5～6）。晚期內涵體的內容物被重新分配到溶酶體中，然后被進一步酸化（pH4.5）。并且溶酶體中含有可降解siRNA 的核酸酶。因此，如果在這些后期事件之前未發(fā)生內涵體逃逸，則不會發(fā)生RNA 干擾［67］。siRNA 必須有效地從內涵體和溶酶體逃逸到細胞質，隨后將siRNA 的反義鏈裝載到RISC中。

最后，到達細胞質后，必須將siRNA 從載體釋放，并整合入RISC中以觸發(fā)RNA干擾。優(yōu)先將5'端雜交最不穩(wěn)定的siRNA 鏈裝入RISC，另一條鏈被降解。在siRNA 遞送系統(tǒng)中，通常避免將遞送材料附著到反義鏈的5'端，因為該端對于RISC裝載至關重要。必須謹慎選擇siRNA 骨架修飾和siRNA 序列，以確保RISC 能夠正確選擇鏈，并避免與非靶標mRNA 部分雜交，這可能會導致基因沉默脫靶［37］。

因此，如何克服siRNA 藥物在體內的運輸困難并成功發(fā)揮作用也成為siRNA 藥物開發(fā)中的一個重要課題。其中，開發(fā)有效的siRNA 藥物納米載體進行輔助是一個可行的解決方案，在此方面已有不少siRNA納米藥物載體被成功研制［68］。

4 設計siRNA藥物納米載體的主要策略

siRNA 作為藥物存在半衰期短、血漿穩(wěn)定性差、易被核酸酶降解，且siRNA 帶負電荷不易透過帶負電荷的細胞膜進入腫瘤細胞，容易被細胞內的溶酶體降解［69］。因此，siRNA 作為藥物很難直接用于疾病治療，需要采取一定的手段實現(xiàn)其在生物體內的有效遞送并達到治療疾病的目的。其中，利用納米載體構建siRNA 藥物納米遞送系統(tǒng)進行siRNA藥物的遞送是實現(xiàn)siRNA藥物進行治療時的常用手段。

siRNA藥物納米遞送系統(tǒng)成功發(fā)揮作用的關鍵在于其能通克服遞送過程中的生理屏障以及內源性核酸酶降解，使siRNA 藥物成功遞送進靶細胞并有效發(fā)揮治療效果?；谏鲜鲎饔脵C制，siRNA藥物納米遞送系統(tǒng)的設計主要分為兩部分：一是采取不同的方式構建不同材料、尺寸與結構的siRNA藥物納米遞送系統(tǒng)，實現(xiàn)siRNA 藥物遞送系統(tǒng)對siRNA藥物的裝載；二是對納米遞送系統(tǒng)進行表面修飾、分散與保存，對siRNA 藥物納米遞送系統(tǒng)進行優(yōu)化，使其能實現(xiàn)更好地siRNA 藥物遞送。目前，表面修飾是對包括siRNA 藥物納米遞送系統(tǒng)在內的納米遞送系統(tǒng)進行優(yōu)化的常用手段，例如，利用PEG［70］進行親水修飾以延長siRNA藥物輸遞體系的血液循環(huán)時間；利用富含精氨酸（arginine，Arg）的細胞穿透肽進行修飾用以增強細胞對siRNA 藥物的內吞，因為在生理條件下，每個精氨酸殘基都含有一個帶正電荷的胍基，胍基可以通過其平面結構與細胞膜相互作用，從而促進膜的滲透；利用含有咪唑環(huán)的組氨酸進行修飾，并利用其在微酸環(huán)境中產生的“質子海綿效應”促進siRNA 藥物溶酶體逃逸［71］等。為增強這種逃逸作用，許多遞送系統(tǒng)采用pH 敏感單元來響應內涵體和溶酶體中的pH變化，遞送材料會吸收H+，在表面上呈現(xiàn)正電荷。隨后，內涵體或溶酶體中的滲透壓將增加，導致Cl-和H2O 的內流。最后，這些變化會導致膜滲透性增加，使siRNA 釋放到細胞質中，這種設計可以很好地幫助siRNA藥物實現(xiàn)內涵體或溶酶體逃逸。同時根據(jù)不同組織的不同特性，可以采取相應的措施增強siRNA 藥物的有效遞送。例如，在腫瘤中，高滲透性內皮細胞伴隨著不良的淋巴引流，導致惡性組織中循環(huán)納米顆粒的積累更多，這被稱為增強的滲透和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應，可以利用和增強該特性來改善納米顆粒的遞送［72?73］。直徑小于100 nm 的納米顆粒被認為是腫瘤內遞送和避免RES 清除的最佳選擇［74］。與此類似，針對不同組織的不同生理特征可以設計不同的優(yōu)化策略。

納米遞送系統(tǒng)的優(yōu)化手段根據(jù)不同的生理組織特異性和遞送要求具有不同的方法。目前，siRNA藥物納米載體的構建主要有4種不同的策略，本節(jié)將對這4種siRNA藥物納米載體的構建思路及方式進行介紹。

4.1 納米載體表面裝載siRNA藥物

先設計合成納米載體，之后將siRNA藥物裝載到載體表面構建siRNA 藥物納米遞送系統(tǒng)是幫助siRNA藥物突破生理限制，成功發(fā)揮作用的常用方法之一。此種方法主要通過靜電作用實現(xiàn)納米載體對siRNA 藥物的裝載，由于siRNA 帶有負電荷，因此一般要求納米載體表面帶正電。目前可用于表面裝載siRNA的納米載體主要有自身帶有正電荷的納 米 載 體 和 利 用 精 氨 酸 、 乙 二 胺（ethylenediamine，EDA）或N，N?二甲基乙二胺（N,N’?Dimethylethylenediamine，DMA）等進行修飾形成的表面帶有正電荷的納米載體。

自身帶有正電荷的納米載體包括帶正電荷的聚合物、樹狀分子［75］、陽離子膠束［76］和一些自身帶有正電荷的蛋白質［77］等。如，Liu等［78］利用聚酰胺?胺類樹狀分子（PAMAM）遞送siRNA：陽離子PAMAM樹形分子表面大量的胺基基團可以通過靜電相互作用結合siRNA并形成穩(wěn)定納米粒，從而有效保護siRNA，避免其被核酶降解；然后，siRNA/樹狀分子復合物納米粒經內吞途徑被細胞攝取，被內化的納米粒主要聚集在酸性細胞器中，如內涵體和溶酶體；樹狀分子結構中存在大量叔胺基團，使其具備很強的pH 緩沖能力，可通過“質子海綿”效應實現(xiàn)內涵體或溶酶體逃逸，從而促進siRNA的釋放，達到基因沉默效果。

自身不帶電荷或帶負電荷的納米載體，可以用精氨酸、乙二胺等物質進行修飾使其表面帶正電荷，進而進行siRNA 藥物的遞送，發(fā)揮其治療效果。如，Kara等［79］利用精氨酸修飾磷酸鈣（CaP）納米顆粒，使納米顆粒表面帶正電荷，提高納米顆粒對帶負電荷siRNA 的負載（圖5）。他們合成了兩種不同化學和形態(tài)特征的精氨酸修飾的CaP納米顆粒，作為針對survivin （凋亡抑制基因） 和cyclin B1 （周期素B1 基因） 沉默的兩種特定siRNA 載體。survivin 和cyclin B1 在癌癥發(fā)生發(fā)展中起促進作用，Kara 等［79］利用A549 非小細胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）細胞進行實驗，發(fā)現(xiàn)CaP?Arg?siRNA介導抑制這些基因導致細胞生長明顯減少，誘導細胞凋亡。CaP 作為載體，具有生物相容性好、制備簡單、對RNA 的親和力高等優(yōu)點。此外，在細胞早期溶酶體內，CaP經內吞后在低pH下降解為離子，導致滲透壓升高。這種壓力的增加也支持siRNA 進入細胞質的逃逸。所有這些原因使CaP 納米顆粒成為合適且安全的siRNA藥物載體［80］。

4.2 siRNA藥物與納米載體共組裝

為了進一步提高siRNA負載量、穩(wěn)定性以及調控其內涵體或溶酶體內釋放，可以將siRNA與載體共組裝成納米遞送系統(tǒng)。共組裝的主要原理是基于siRNA與載體的各種相互作用，其中靜電相互作用是一種利用較多的組裝方式。因為siRNA帶有較高的負電荷，所以此種方法使用的載體材料多為聚陽離子載體，例如陽離子化金納米簇、陽離子脂質載體等。

利用聚陽離子脂質可以靜電結合siRNA的能力形成納米大小的復合物，從而增強細胞的吸收。Akin等［81］開發(fā)了以一種新型類脂材料98N12?5（1）為載體，用于在體內向肝細胞遞送siRNA的siRNA遞送系統(tǒng)。首先利用脂質體的自組裝能力以及與siRNA的靜電相互作用進行共組裝，將siRNA包載在納米復合物中。隨后在外部修飾PEG，這樣有助于防止聚集，促進納米載體的穩(wěn)定性，并增加血液循環(huán)時間。得到的球狀納米復合物通過內吞作用進入細胞，然后會破壞內涵體膜或通過內涵體“質子海綿”［82］機制引起內涵體破裂，使siRNA 成功在細胞內釋放，并且通過調控復合物中各組分的比例，可以使得最多的siRNA被負載與遞送。

Fig.5 Schematic diagram of the process of three different CaP-Arg nanoparticles delivering siRNA for the treatment of NSCLC［80］圖5 三種不同CaP-Arg納米粒子遞送siRNA治療NSCLC的過程示意圖［80］

利用陽離子載體與siRNA帶有負電的特性，胡獻麗等［83］設計了熒光陽離子化金納米簇（cationic gold nanocluster，CGN）與siRNA通過靜電作用共組裝形成納米遞送系統(tǒng)。其設計原理為以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為模板，通過還原四氯金酸（HAuCl4），合成可發(fā)射近紅外熒光的GN。隨后在1?乙基?3?（3?二甲基氨丙基）?碳化二亞胺（EDC）和N?羥基琥珀酰亞胺（NHS）的活化作用下， 乙二胺或二甲基乙酰胺（dimethylacetamide，DMA）能與GN 表面BSA 上的谷氨酸等殘基反應，使BSA?GN陽離子化，并與siRNA通過靜電相互作用進行共組裝。形成的納米復合物經細胞攝取后進入酸性內涵體，內涵體的酸性pH 環(huán)境使EDA或DMA上的胺基質子化，利用“質子海綿”效應［83］使內涵體破裂并釋放siRNA，實現(xiàn)siRNA 的有效遞送，并高效沉默目標基因。這種納米復合物的尺寸遠大于單獨的siRNA 尺寸，避免被腎臟在短時間內清除，并且利用質子海綿效應可以成功在細胞內釋放。

為進一步提高siRNA 納米藥物在病變組織內的累積，設計構具有靶向性的siRNA 納米藥物載體具有重要的價值。Yang等［84］研究設計了球形納米復合物HA?PEG/MDR1 siRNA。該復合物使用能夠靶向CD44（cluster of differentiation 44）的透明質酸（hyaluronic acid，HA）作為載體。CD44 是一個多功能跨膜糖蛋白家族，是HA的主要細胞表面受體，在乳腺癌等惡性腫瘤細胞膜上高表達。對HA修飾PEG和PEI（聚乙烯亞胺），PEG能夠延長siRNA 的體內循環(huán)時間和防止聚集，PEI 帶有高密度正電荷和siRNA 之間形成靜電相互作用，包裹抗MDR1?siRNA基因用于乳腺癌疾病的靶向遞藥。多藥耐藥基因1 （multidrug resistance gene 1，MDR1）以及P 糖蛋白（P?glycoprotein，Pgp）的過表達是多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）發(fā)展重要原因，將這種藥物成功轉入癌細胞中，可以抑制MDR1和Pgp的表達，使得治療乳腺癌的藥物如紫杉醇等能夠長時間對病人產生效果，抑制MDR 現(xiàn)象。并且這種納米復合物包裹siRNA 防止其在人體內被降解、被清除，提高siRNA 的整體遞送效率。

4.3 納米載體包裹siRNA藥物

為了更好地保護siRNA、增加體內循環(huán)時間及在腫瘤組織內的累計，將siRNA 直接包裹在納米膠囊、高分子膠束等納米載體內部，也是一個值得開發(fā)的納米遞送系統(tǒng)［85］。下文將詳細介紹如何利用這種方法構建siRNA納米遞送系統(tǒng)，提高基因沉默的效率。

利用陽離子脂質體與siRNA 的經典相互作用力，Zhao 等［86］使用表面修飾聚乙二醇?聚乳酸?羥基 乙 酸 共 聚 物（polyethylene glycol?block?poly（D，L?lactide?co?glycolide）?block， PEG?b?PLGA）陽離子脂輔助納米顆粒（cationic lipid?assisted nanoparticle，CLAN） 封裝靶向布魯頓酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK） 的siRNA（siBTK）用于治療類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）。BTK已經被證實是有效治療RA的一個靶點，然而有效抑制BTK 需要高劑量的BTK抑制劑，所以這就要求遞送BTK 抑制劑的體系需要盡量減少人體內免疫系統(tǒng)的清除作用以及腎小球的濾過作用等對藥物遞送效率的影響。而使用CLAN 封 裝 靶 向 BTK 的 siRNA （CLAN?encapsulated siRNA that targets BTK，CLANsiBTK）遞送體系可以實現(xiàn)BTK 抑制劑的有效遞送。利用靜電相互作用力，陽離子脂質體將帶有負電荷的siRNA 包裹在內部，而表面具有親水修飾的PEG，這樣可以延長siRNA 藥物輸遞體系的血液循環(huán)時間，成功抑制BTK活性，為RA治療提供了一個很好的替代方案。

類似地，利用脂質體的親水內核與疏水脂質雙層特性，Yadav 等［87］制備構造了納米球狀結構脂質載體，包被抗IL17A?siRNA 與丙酸氯倍他索（clobetasol propionate，CP）藥物用于治療銀屑病。IL?17A 基因與銀屑病的發(fā)病密切相關，其會促進和加速表皮角質形成細胞的增殖，導致表皮增生、表皮內嗜中性微膿腫等病變。利用磷脂雙層自組裝形成的球形內核具有親水性將抗IL17A?siRNA包裹在內部，脂質雙層分子之間具有的親脂性將脂溶性CP 藥物成功搭載在納米脂質體上。這種納米脂質復合物有效克服了裸露siRNA遞送中皮膚產生的阻礙、不良的物理化學特征以及內源性酶降解傾向，并且具有雙重輸送核酸和抗炎皮質類固醇的能力，可實現(xiàn)多靶點治療并通過多種機制發(fā)揮作用，最終達到治療效果的增強。

利用前面提到的共組裝策略將siRNA與兩親性陽離子分子或藥物復合形成疏水納米復合物，從而可利用兩親性聚合物膠束將其包裹在內部而形成納米遞送系統(tǒng)。Saw 等［85］首先設計合成基于MTO（具有陽離子特性的抗腫瘤藥物米托蒽醒，mitoxantrone）的兩親性陽離子前藥SA?MTO，隨后通過靜電作用與siRNA形成疏水納米復合物（圖6）。這些siRNA/SA?MTO 復合物可被包裹在由腫瘤組織弱酸微環(huán)境響應的兩親性高分子材料Meo?PEG?b?PPMEMA（甲氧基?聚（乙二醇）?b?聚（2?（五亞甲基亞胺）甲基丙烯酸乙酯）形成的納米膠束的疏水性內核中。該納米載體用于siRNA的體內遞送時具有“多級逐步遞送”（multistaged delivery）的特性。首先納米載體通過血液循環(huán)并利用腫瘤增強滲透滯留效應，富集在荷瘤小鼠的腫瘤部位。隨后腫瘤組織弱酸微環(huán)境會引起PPMEMA鏈的質子化，導致納米載體結構的解散和siRNA/SA?MTO 復合物的快速釋放。然后siRNA/SA?MTO 復合物利用其尺寸較小的特性，深度穿透腫瘤組織并進入腫瘤細胞，減小致密的細胞外基質對于藥物遞送的影響。最后腫瘤細胞中高表達的脂酶會降解SA?MTO，使得siRNA和MTO在胞漿內快速釋放，siRNA 可以用于沉默癌基因，MTO 可以抑制DNA鏈復制，實現(xiàn)siRNA 與化療藥物在細胞內的成功共遞送。

Fig.6 Schematic illustration of the TME pH-responsive polymer-prodrug hybrid nanoplatform for multistage siRNA delivery and combination cancer therapy［85］圖6 構建的納米載體用于siRNA體內遞送時利用其腫瘤組織弱酸微環(huán)境響應性促進基因沉默和聯(lián)合抑制腫瘤生長示意圖［85］

為了提高納米遞送系統(tǒng)的靶向能力和腫瘤微環(huán)境響應釋放能力，通過響應性載體設計策略，并在納米載體表面修飾特定肽段，得到更加高效的siRNA 納米遞送藥物。例如，Li 等［88］設計制備了一種響應腫瘤微環(huán)境活性氧（reactive oxygen species，ROS）的納米載體用于血管內皮生長因子siRNA （vascular endothelial growth factor siRNA，siVEGF）的體內遞送和結腸癌治療（圖7）。首先制備由苯硼酸修飾的聚N,N?二乙基丙烯酸氨基乙酯（PDP）與siRNA共同組裝的納米復合物，在利用 二 油 酰 基 卵 磷 脂（1,2?dioleoyl?sn?glycero?3?phosphocholine，DOPC）、二油?；字幔?,2?dioleoyl?sn?glycero?3?phosphate，DOPA）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺?聚乙二醇（1,2?distearoyl?sn?glycero?3?phosphoethanol?amine N?［methoxy（polyethylene glycol）?2000］，DSPE?PEG）形成脂質包裹。其中聚陽離子高分子材料PDP 可通過靜電作用將siRNA包載在納米載體中，而DSPE?PEG上的PEG 鏈段能夠延長siRNA 的體內循環(huán)時間。最后，為了增強上述納米載體的腫瘤細胞靶向能力和內涵體逃逸性能，將具有腫瘤細胞靶向和膜穿透功能的1 型人免疫缺陷病毒轉錄激活因子（human immunodeficiency virus?1 transcription activator，HIV?1 TAT）修飾到納米載體表面。在腫瘤組織中，納米載體會利用其表面修飾的TAT 肽靶向腫瘤細胞并攜帶siRNA 進入胞漿。在腫瘤細胞內高濃度ROS 會導致聚陽離子材料PDP 的分解，從而釋放siRNA，從而能夠顯著提高siVEGF 在胞漿內的釋放和沉默靶基因的效率。

Fig.7 Schematic illustration of a lipid-coated ROS-responsive assembly for siRNA delivery圖7 用于siRNA遞送的脂包覆ROS響應組裝體示意圖

4.4 siRNA自組裝實現(xiàn)siRNA藥物的高效遞送

近年來，一種新的siRNA藥物遞送策略逐漸受到關注——核酸自組裝體用于siRNA藥物遞送，主要有3種方法。一是通過siRNA之間偶聯(lián)自組裝形成負電荷密度較高siRNA多聚體，再借助陽離子載體實現(xiàn)siRNA藥物高效遞送。二是由寡核苷酸自組裝構建載體，并通過與siRNA藥物雜交形成納米核酸藥物，這種方法的優(yōu)點是大多不需要借助陽離子載體即可被細胞攝取。三是設計包含有siRNA模板序列的環(huán)狀DNA，通過滾環(huán)轉錄技術形成Poly?RNA。Poly?RNA 再進一步自組裝成RNA 納米微球，該方法能夠大大提高siRNA的裝載量，降低由于陽離子載體和siRNA藥物過量使用而引起的細胞毒性，同時緊湊致密的納米結構增強了siRNA的核酸酶穩(wěn)定性［89］。

5 總結與展望

siRNA 作為一種新型藥物，由于其高效［90］、特異性強、治療效果易檢測等一系列優(yōu)勢正在逐漸受到研究人員的重視，設計合適的siRNA藥物納米載體是實現(xiàn)siRNA藥物成功遞送并發(fā)揮作用的重要一環(huán)，有關研究也在逐年增加。現(xiàn)階段，利用納米載體實現(xiàn)siRNA 藥物遞送已經取得了很大的發(fā)展，但仍存在一些問題需要研究人員進一步攻克。siRNA藥物應用于臨床時，依然存在靶向藥物結構設計不精準、脫靶效應嚴重、內涵體逃逸難以實現(xiàn)、納米載體大規(guī)模制備困難等問題。

siRNA 作為藥物通過RNA 干擾特異性誘導基因沉默而發(fā)揮作用，在病毒感染、癌癥、家族遺傳疾病和自身免疫性疾病等方面被廣泛應用。siRNA單獨使用或與化療等抗腫瘤藥物共遞送用于癌癥治療相對于傳統(tǒng)藥物表現(xiàn)出更大的應用潛力，具有可設計靶向、合成方便、瞬時沉默、靶點特異性強等優(yōu)勢，但其遞送也面臨著在血液循環(huán)中易被降解、被腎臟清除、難以突破血管內皮/細胞膜/溶酶體屏障等問題。設計合適的納米載體達到siRNA藥物的成功遞送是siRNA 藥物領域的研究熱點，目前siRNA藥物納米載體的設計主要有納米載體表面裝載siRNA藥物、siRNA藥物與納米載體共組裝、納米載體包裹siRNA 藥物以及siRNA 自組裝4 種策略。但由于siRNA藥物普遍存在大批量制備困難的問題，目前僅有3種siRNA藥物獲批上市。

如何進行siRNA 藥物大規(guī)模制備是siRNA 藥物應用于臨床面臨的一大難題并將成為研究熱點。同時隨著計算機技術的發(fā)展，結合人工智能、機器學習等技術，借助大數(shù)據(jù)分析進行藥物設計正在成為新的研發(fā)趨勢。對siRNA納米藥物進行智能設計和精準調控，設計集靶向、示蹤、與其他藥物共遞送于一體的多功能siRNA 納米藥物實現(xiàn)協(xié)同增效，同樣是未來siRNA納米藥物的發(fā)展方向之一。

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