何曉婷 董潔嫻 沈 興 王 弘 沈玉棟 徐振林**

（1）華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣州 510642；2）深圳清華大學研究院抗腫瘤創(chuàng)新藥物研發(fā)中心，深圳 518057）

駝類動物體內(nèi)含有3種不同亞型的抗體，分別是常規(guī)抗體IgG1、天然缺失輕鏈及CH1恒定域的重鏈 抗 體（heavy?chain antibody，HCAb） IgG2與IgG3?？寺〔⒈磉_重鏈抗體可變區(qū)可得到一個晶體結(jié)構(gòu)為直徑2.5 nm、長4 nm 的橢球形單域抗體（圖1），其分子質(zhì)量小到只有免疫球蛋白的1/10（～15 ku）卻保留了全部的抗原結(jié)合能力，因此也被稱為納米抗體（nanobodies，Nbs）或VHH 抗體（variable domain of the heavy chain of heavy?chain antibody）［1］。與傳統(tǒng)抗體片段如抗原結(jié)合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab） 和單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv）相比，Nbs具有多個明顯的優(yōu)勢，比如免疫原性弱、生產(chǎn)成本低、水溶性好、組織滲透性好、穩(wěn)定性與親和力較高等［2］。正是這些優(yōu)良特性使得Nbs在生物技術(shù)方面得到了非常廣泛的應(yīng)用［3?6］。

對于大多數(shù)應(yīng)用而言，穩(wěn)定性是制約抗體應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。一方面抗體在其生產(chǎn)、運輸、儲存及使用的過程中容易發(fā)生多種物理和化學降解，另一方面抗體的不穩(wěn)定性聚集會潛在地影響產(chǎn)量、保質(zhì)期和免疫原性等應(yīng)用參數(shù)［7］。因此抗體的穩(wěn)定性不僅會影響其生物學和生化評估，還會影響純化、儲存以及配方設(shè)計和生產(chǎn)。在各種類型的抗體中，Nbs顯示出極好的溶解性，并且對高溫和化學變性具有顯著的抗性，可以很大程度地克服傳統(tǒng)抗體片段scFv 的聚集和降解等穩(wěn)定性問題，是許多應(yīng)用的理想選擇。

Fig.1 Structures and molecular mass of three different subtypes of antibodies and antibody fragments in camelid animals圖1 駱駝科動物體內(nèi)3種不同亞型抗體與其抗體片段的結(jié)構(gòu)與分子質(zhì)量大小

雖然Nbs與傳統(tǒng)抗體相比在穩(wěn)定性方面普遍具有明顯的優(yōu)勢，但是不同的Nbs 穩(wěn)定性差異較大，主要與其特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。已經(jīng)有很多研究者基于共有序列的分析基礎(chǔ)上對Nbs進行改造來進一步提高穩(wěn)定性，同時也鑒定出降低Nbs聚集的共有結(jié)構(gòu)特征［8?11］。本文在前人對Nbs的穩(wěn)定性表征以及結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上對其在高溫、有機溶劑以及其他極端條件下的穩(wěn)定性表現(xiàn)進行了系統(tǒng)性總結(jié)，并結(jié)合穩(wěn)定性數(shù)據(jù)和序列信息揭示了高度穩(wěn)定的Nbs具有較高的凈電荷表面、限制構(gòu)象遷移的二硫鍵、親水氨基酸取代較多的框架區(qū)、保守的疏水性口袋以及高度相互作用的結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)特征?；谶@些結(jié)構(gòu)特征，本文還討論了幾種Nbs 的穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略，包括共有序列驅(qū)動的序列修復(fù)、替換易于修飾的氨基酸、凈蛋白質(zhì)電荷的改變、非天然二硫鍵的引入和互補決定區(qū)（complementarity determining region，CDR）的移植。值得注意的是，這些策略不是絕對通用的，有可能以犧牲親和力或者產(chǎn)量為代價，因此在進行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)化時要綜合考慮穩(wěn)定性、親和力以及表達量等多方面的因素。

1 納米抗體結(jié)構(gòu)

Nbs 與常規(guī)抗體可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH）的空間結(jié)構(gòu)相似，其框架是由9個反向平行的β 折疊片層（A?B?C?D?E?F?G?H?I）通過鏈間氫鍵和二硫鍵連接在一起組成（圖2a）［12］。在此結(jié)構(gòu)中，3 個CDR 分別連接BC、DE和HI 鏈，并靠N 端形成連續(xù)表面，與抗原表位的表面互補［13］。連接CDR之間的氨基酸序列相對比較保守，稱為骨架區(qū)（framework region，F(xiàn)R）。幾乎所有Nbs 結(jié)構(gòu)都含有一個連接FR1（C23）和FR3（C104）的保守二硫鍵，該鍵跨越蛋白質(zhì)的內(nèi)部，將兩個β鏈連接起來，增加了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［11］。部分Nbs 還含有一個可限制CDR 環(huán)柔韌性和構(gòu)象自由度的額外二硫鍵［14］。

傳統(tǒng)抗體VH 和VL 通過疏水作用力來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并共同構(gòu)成抗原結(jié)合區(qū)。與之相比，Nbs僅含有3 個可變區(qū)，盡管與抗原結(jié)合界面的表面積減少，但其仍具有較高的穩(wěn)定性與親和力。它主要通過以下方式來適應(yīng)輕鏈的缺失：a.大量的親水性氨基酸取代先前與CH1、VL 結(jié)合界面的脂肪族殘基（L12S、V42F/Y、G49E、L50R/C、W52G/L），且部分FR2被拉伸扭轉(zhuǎn)的CDR3環(huán)覆蓋，避免與外界水環(huán)境的接觸［12，15］，從而防止Nbs 的二聚化，其CDR3 環(huán) 越 長，Nbs 越 穩(wěn) 定［7，16?17］。另 外 還 可 在CDR3 末端形成疏水核心，有利于穩(wěn)定Nbs 的折疊結(jié)構(gòu)域［18］。b.Nbs 的CDR1 和CDR3 普遍比VH 的長（圖2b），潛在地增加了互補位構(gòu)象的多樣性，從而以高度的形狀表面互補性與相應(yīng)的抗原結(jié)合，一定程度上彌補了輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降以及因尺寸小而導致的潛在序列多樣性降低［19］。

Fig.2 Structure of Nbs圖2 Nbs的結(jié)構(gòu)

2 穩(wěn)定性表征

抗體的物理和化學穩(wěn)定性的全面表征對于設(shè)計穩(wěn)定的抗體制劑以實現(xiàn)所需的功效和保質(zhì)期至關(guān)重要。在抗體的研究、生產(chǎn)與應(yīng)用中，誘導變性因素有很多，包括溫度、有機溶劑、壓力、化學試劑、酸堿環(huán)境以及蛋白酶等，可以基于這些因素采用互補或獨立的方法來表征Nbs的穩(wěn)定性。

2.1 熱穩(wěn)定性

Nbs的一個固有特性是其熱穩(wěn)定性，包括出色的熱展開抗性以及變性后重新折疊的能力。部分Nbs可以在-20℃、4℃條件下保存幾個月，甚至在37℃條件下溫育幾個月到一年也不會丟失其抗原結(jié)合特性［8，20］，這種長期穩(wěn)定性使其能在室溫下運輸、儲存和使用。當溫度逐漸升高時，抗體會趨于熱變性展開，一般使用解鏈溫度（Tm）推斷抗體的展開傾向。Nbs 的Tm覆蓋了50～80°C 的廣泛范圍，普遍顯示出對熱誘導具有較高的抵抗力［21］。抗葡萄球菌腸毒素B的Nb A3是一個比較經(jīng)典的例子，其Tm高達85℃，是迄今為止報道的最高紀錄［22］。這種熱展開抗性使得Nbs 可以應(yīng)用于相對較高的溫度中，比如在50℃條件下對Nb進行放射性標記，以實現(xiàn)對動脈粥樣硬化炎癥標志物的監(jiān)測［23］。

Fab和scFv等常規(guī)抗體片段的Tm測得值范圍基本與Nbs相似，說明Nbs和常規(guī)抗體片段可能顯示出相當?shù)臒崞胶夥€(wěn)定性［24］，但是使Nbs 區(qū)別于常規(guī)抗體的主要標志是其在極端溫度下的可逆性［25?26］。這種可逆性可以通過檢測高溫孵育一段時間后Nbs 的活性來進行表征。對部分已報道的Nbs 免疫分析文獻進行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)大部分Nbs 在85℃高溫長時間處理后仍可保持結(jié)合活性，而其他常規(guī)抗體則不可逆地失活［27?38］（表1）。例如，抗咖啡因Nb可在90°C的溫度孵育后保留90%的活性，但其單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）在70°C 孵育后會失活［28］。這種耐高溫咖啡因Nb在一次性側(cè)向流動裝置的應(yīng)用中已獲得專利，可用于監(jiān)測熱飲料中的咖啡因［39］。同樣地，針對黃曲霉毒素的Nb 以及抗獨特型抗體（anti?idiotype antibody，Aid）耐熱性也優(yōu)于常規(guī)抗體，在高溫條件下短時間孵育后其多克隆抗體（polyclonal antibody，pAb）與單克隆抗體的結(jié)合活性僅保留20%甚至完全喪失，但在相同溫度條件下孵育20 min甚至1 h后Nbs仍具有高達40%～80%的結(jié)合活性［34，36，38］，這使其可用于涉及高溫過程的黃曲霉毒素檢測，比如需要巴氏滅菌的乳制品等?？偠灾?，這些特性使Nbs在熱變性的復(fù)雜條件下比傳統(tǒng)抗體具有更廣泛的應(yīng)用優(yōu)勢。

2.2 有機溶劑耐受性

在開發(fā)用于親脂分析物的免疫分析方法時，一般采用有機溶劑對分析物進行充分提取，但是有機溶劑會影響抗體的活性，因而在前處理步驟中需要進行蒸發(fā)復(fù)溶或者高倍比稀釋來避免有機溶劑的影響。優(yōu)選有機溶劑耐受性較高的抗體可以省去蒸發(fā)復(fù)溶的步驟或避免高倍數(shù)稀釋導致分析靈敏度的下降。對部分Nbs的有機溶劑耐受性評估進行總結(jié)發(fā)現(xiàn)大部分Nbs 可耐受較高濃度的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或二甲基亞砜［27，34，37，40?43］（表2），而這些溶劑是提取高度親脂性分析物的首選溶劑。例如，從食品基質(zhì)中提取赭曲霉毒素A（OTA）需要用到甲醇，但是甲醇不僅會影響了OTA 與抗體的相互作用，還會抑制免疫測定中的二抗活性［44?45］。在20%的甲醇溶液中，抗OTA的Nb在測定時僅稀釋2.5倍即可消除樣品基質(zhì)干擾，但是其mAb測定需要稀釋30 倍以上才能消除，表明了Nbs 比傳統(tǒng)抗體對樣品基質(zhì)干擾有更高的抵抗力［37］。當高度親脂性的黃曲霉毒素作為目標分析物時，Nb 能在80%的甲醇溶液中保持100%的結(jié)合能力，而其mAb 在相同條件下則會失去50%的活性［34］。這種耐有機溶劑特性不僅有利于檢測需要從樣品中萃取的親脂性分析物，還可以使其應(yīng)用于需要較少稀釋的親和柱開發(fā)［34］。

Table 1 Comparison of heat resistance between Nbs and conventional antibody表1 Nbs與常規(guī)抗體耐熱性的比較

Table 2 Tolerance of Nbs in different organic solutions表2 Nbs在不同有機溶液中的耐受性

2.3 壓力耐受性

在壓力耐受性方面，Dumoulin等［24］報告了針對人溶菌酶與偶氮染料RR6的Nbs在大于400 MPa的壓力條件下才會使其變性展開，說明了Nb 在極端壓力條件下的穩(wěn)定性。另外，在較低的壓力條件（約50～250 MPa）下可以加速解離非共價蛋白化合物，因此可在這個壓力范圍內(nèi)分離抗原?Nbs 復(fù)合物而不會破壞抗體。該策略可用于免疫親和分離，在受控的壓力增加后從免疫吸附劑中洗脫特異性結(jié)合的抗體。此外，這種可耐受極端壓力以及小體積和高溶解的特性還有利于Nbs開發(fā)為霧化吸入制劑用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療。比如現(xiàn)階段已經(jīng)進入臨床II期研究的三聚體Nb ALX?0171可通過氣溶膠遞送方式有效降低住院嬰兒的呼吸道合胞病毒載量［46］。同為三聚體Nb的PiN?21也成功通過噴霧給藥的方式以超低劑量預(yù)防并治療了倉鼠動物模型中的SARS?CoV?2冠狀病毒［47］。

2.4 化學試劑耐受性

一般化學變性劑有鹽酸弧、尿素、硫氰酸銨溶液等。除了壓力穩(wěn)定性測試，Dumoulin等［24］還探究了Nbs的化學誘導展開實驗，實驗表明Nbs的鹽酸弧、尿素變性濃度分別在2.3～3.3 mol/L 和高于6 mol/L 的范圍，明顯高于常規(guī)抗體scFv 片段（1～2 mol/L和2～3 mol/L）。與之類似，針對hCG與RR6 的Nbs 所需的變性硫氰酸銨濃度也比其mAb高，其中最穩(wěn)定的Nb在4 mol/L硫氰酸銨溶液中僅損失20%的生物活性［27，48］。另外，在洗發(fā)劑存在條件下分離出的Nb 不僅可以在含有高濃度表面活性劑的洗發(fā)水中穩(wěn)定結(jié)合抗原馬拉色菌，在高濃度的尿素與鹽酸胍條件下也保持穩(wěn)定，可將該Nb 與洗發(fā)劑混合使用來防止頭皮屑［48］。但是并非所有化學變性劑對抗體反應(yīng)的影響都是消極的，比如抗李斯特菌Nb 在高尿素濃度下會提高抗原結(jié)合力，表明尿素有助于部分Nbs的重新折疊［49］。

2.5 極端pH耐受性

Nbs在不同pH值條件下也具有相似的穩(wěn)定性。比如，Wang 等［41］報道的抗四溴雙酚A 的Nb 抗體在pH 值為7.4～10 之間非常穩(wěn)定。同樣地，針對李斯特菌的Nb在pH為2及12的酸堿極端條件下孵育過夜后仍能保留至少30%的活性［49］。另外，酸堿性條件的變化對抗皮質(zhì)醇Nb 的抗原結(jié)合力也不會有明顯的影響，使得該Nb 抗體在微流體實驗中具有受測試條件可變性影響較小的優(yōu)勢［9］。

2.6 蛋白酶抗性

部分Nbs還具有較強的蛋白酶抗性，可抵抗胃腸道中的蛋白酶解，適于用作口服給藥的治療劑。通過DNA改組和隨機誘變得到的穩(wěn)定性Nb可在腸液或胃液培養(yǎng)后仍分別保持90%和41%的活性［50］。在蛋白酶壓力下淘選出來的Nb 也具有優(yōu)秀的蛋白酶抗性，能顯著減少雞胃腸道中的空腸彎曲桿菌［51］，可作為一種替代抗生素的潛在飼料添加劑加以推廣應(yīng)用。此外，這種可規(guī)避蛋白酶解的特性還有利于開發(fā)靶向細胞內(nèi)抗原的功能性重組抗體Nbs，使其成為對抗細胞內(nèi)病原體或治療神經(jīng)退行性疾病的新型治療劑［52］。

3 穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

Nbs的小分子和單域?qū)傩再x予了其比常規(guī)抗體更為穩(wěn)定的特性，然而并非所有的Nbs都具有很好的熱穩(wěn)定性與化學穩(wěn)定性。在以往研究的多個Nbs中，大約有2/3 的Nbs 在65℃處理后發(fā)生了不可逆的聚集，但是部分Nbs 在90℃高溫處理后仍具有90%的活性［7］。這些穩(wěn)定性差異的根本原因在于Nbs特殊結(jié)構(gòu)的差異，包括氨基酸序列、二硫鍵的數(shù)量與位置、結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象等。

3.1 氨基酸

3.1.1 氨基酸的化學修飾

盡管Nbs可以通過原核生物進行大量表達，沒有翻譯后修飾的過程，但是在抗體儲存、生產(chǎn)與應(yīng)用過程中的一些脅迫條件容易使抗體的一些氨基酸發(fā)生化學修飾。其中天冬氨酸（Asn）與谷氨酰胺（Gln）的脫酰胺反應(yīng)是較為重要的一種化學修飾，以Asn的脫酰胺更為普遍。這些化學修飾的積累會改變抗體的局部疏水性以及空間結(jié)構(gòu)從而影響其生物活性，其中抗體CDR 區(qū)的脫酰胺作用還可能會導致抗原結(jié)合功能的喪失。Akazawa?Ogawa 等［8］還通過實驗驗證了化學修飾是導致Nbs熱誘導不可逆變性的主要驅(qū)動力，其Asn殘基的化學修飾會改變抗體的范德華相互作用和天然結(jié)構(gòu)的氫鍵，從而導致Nbs的穩(wěn)定性和折疊能力發(fā)生變化。除了Asn修飾，熱誘導還會引起半胱氨酸（Cys）的化學修飾與二硫鍵的交換。研究表明對野生型抗hCG Nb進行熱處理，Cys的修飾會導致巰基數(shù)量的減少以及Cys殘基周圍的斷裂，這可能是具有單個二硫鍵的Nbs 變性的原因［53］。這些易于發(fā)生化學修飾的氨基酸是影響Nbs穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸，可能會引起抗體變性后折疊能力的逐漸喪失。

3.1.2 氨基酸的電荷

增加多肽鏈的凈電荷會增強溶解度并導致未折疊狀態(tài)的分子間排斥，提高抗體對聚集的抵抗力［54］。與VH 抗體相比，D62、K65、R67、R72、K76和E89在Nbs結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)得更頻繁，這些帶電荷殘基的普遍使用增加了電荷排斥，降低了Nbs聚集的傾向，使得Nbs蛋白可逆折疊、熱穩(wěn)定性和可溶性的性質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)抗體［17，19］。據(jù)報道［55］，具有抗聚集特性的VHs 與Nbs 的等電點pI 多傾向于酸性，這表明含有大量負電荷殘基可能是Nbs穩(wěn)定性和溶解性進化的內(nèi)在因素。此外，Nbs序列中一些保守性的帶正電荷殘基可增強與介質(zhì)中存在的帶負電荷分子的靜電相互作用，比如皮質(zhì)醇分子被其Nb中幾個帶正電荷的殘基緊密包圍，增加了Nb在惡劣環(huán)境中與抗原的結(jié)合穩(wěn)定性［56］。又比如與糠秕馬拉色菌結(jié)合的Nb 序列中帶正電荷的殘基（R/K44）對于Nb 在高pH、洗發(fā)劑、尿素和鹽酸胍等條件下與真菌的結(jié)合至關(guān)重要［48］。以上表明具有高穩(wěn)定性的Nbs趨于含有更多凈電荷，尤其含有更多帶負電荷的氨基酸，而結(jié)構(gòu)中帶正電的殘基可通過靜電作用來促進抗原與抗體之間的穩(wěn)定性結(jié)合。

3.2 二硫鍵

二硫鍵在分泌蛋白的折疊和穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報道［9，57］，使用大腸桿菌系統(tǒng)表達Nbs時，在還原性細胞質(zhì)中產(chǎn)生Nbs 的Tm要比在周質(zhì)的氧化環(huán)境中產(chǎn)生的Nbs低得多，這種穩(wěn)定性差異主要與二硫鍵的形成有關(guān)［21，58］。在氧化環(huán)境中，Cys殘基的成對氧化將二硫鍵引入多肽鏈中，通過約束蛋白質(zhì)的未折疊構(gòu)象來提高折疊結(jié)構(gòu)域的機械穩(wěn)定性及構(gòu)象穩(wěn)定性［53，59?60］。在Nbs結(jié)構(gòu)中，大多會出現(xiàn)1個及以上的二硫鍵，包括連接FR1（C23）和FR3（C104）的保守二硫鍵以及連接CDR3與其他結(jié)構(gòu)域的額外二硫鍵，這些二硫鍵是固定Nbs三級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一。

3.2.1 保守二硫鍵

Nbs的穩(wěn)定性高度依賴于這個幾乎所有Nbs結(jié)構(gòu)共有的保守二硫鍵。該域內(nèi)二硫鍵埋藏在Nbs折疊域的疏水核內(nèi)部，將兩個β折疊連接在一起，使Nbs 肽鏈的空間結(jié)構(gòu)更為緊密［60］。通過定點誘變除去野生型Nbs的天然保守二硫鍵可以顯著降低其Tm（15～25°C）［9，53，59，61］，表明了該鍵是影響Nbs平衡熱力學穩(wěn)定性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。但是該鍵不是Nbs結(jié)構(gòu)與功能所必需的，如果Nbs具有較強的固有穩(wěn)定性或已通過蛋白質(zhì)工程進行穩(wěn)定性改造，則該鍵的缺失與替換不會影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合能力［60］。比如衍生自單峰駱駝的通用Nbs 框架cAbBCII10在去除保守的二硫鍵后仍具有良好的表達水平與穩(wěn)定性［62］。此外，還有文獻報道了部分無二硫鍵的Nbs突變體可以折疊成原生結(jié)構(gòu)，保留其抗原結(jié)合能力，也不會影響其抗體抗原結(jié)合復(fù)合物的剛性［53，59，61，63］。

3.2.2 額外二硫鍵

除了保守二硫鍵，部分Nbs還含有一個可以穩(wěn)定可變區(qū)空間構(gòu)象的額外二硫鍵［64］。在研究中發(fā)現(xiàn)，在兩種同源Nbs中，含有雙二硫鍵的Nbs要比僅含有保守二硫鍵的Nbs具有更高的熱穩(wěn)定性與構(gòu)象穩(wěn)定性［59］。同樣地，對大量的Nbs 序列對比分析發(fā)現(xiàn)具有額外二硫鍵的Nbs 的Tm值平均會高5.2℃［65］。這些額外的二硫鍵約束并穩(wěn)定增大的CDR3環(huán)，限制構(gòu)象遷移并防止其熱誘導聚集，提高了其構(gòu)象穩(wěn)定性［11?12，14，66］。此外，額外二硫鍵會通過降低Nbs的聚集速率來減少不可逆聚集，提高了動力學穩(wěn)定性［20］。主流觀點認為這個額外二硫鍵還可以通過降低其與抗原結(jié)合的熵損失來提高結(jié)合親和力［14］。但是，Mendoza等［17］對此進行了反駁，他們分離出一種對親和力沒有明顯變化的二硫鍵突變體。由此可見，這個額外的二硫鍵可能已經(jīng)進化成為穩(wěn)定Nbs結(jié)構(gòu)域的生物物理特性，在特定情況下可在抗原結(jié)合中發(fā)揮一定的作用，但是這種作用不具有廣泛的普遍性。

根據(jù)編碼Cys的位置可以將其額外二硫鍵大致分為3 種不同類型（圖3），分別是連接CDR3 與CDR1 或CDR2/FR2 邊界的環(huán)間二硫鍵以及CDR3的環(huán)內(nèi)二硫鍵［12］。不同駝類在額外二硫鍵的位置與豐度上有很大的差異。據(jù)報道［17］，駱駝中額外二硫鍵的出現(xiàn)頻率約30%，比羊駝（～12%）和美洲駝（～3.5%）高。這是因為大部分羊駝Nbs 因其CDR3 環(huán)相對較短而不存在這種額外的二硫鍵［67］，只有小部分羊駝Nbs 在FR2（C55）和CDR3 間存在額外增多的Cys［66，68］。另外，美洲駝抗體僅一個特殊亞科VHH3 含有延伸的CDR3，該CDR3 被一個位于FR2（C50）的二硫鍵連接，但是這個亞科的Nbs很少被分離出來，因此文獻中報道的絕大多數(shù)來自美洲駝的Nbs 僅在保守位置出現(xiàn)二硫鍵［11，69］。而駱駝Nbs 中延伸的CDR3 則一般是被位于CDR1（C31/33/34）的二硫鍵約束［11，70］，其另一個Cys 出現(xiàn)在位置FR2（C50）或CDR3 上的Nbs 也曾見于報道［67，71］。這說明了這個額外的二硫鍵不是維持其穩(wěn)定性的必要結(jié)構(gòu)，具有不同生態(tài)適應(yīng)性的駝種Nbs根據(jù)其序列及其長度的差異采用不同數(shù)量以及不同位置的二硫鍵來豐富其穩(wěn)定性機制。

Fig.3 Three different types of additional disulfide bonds in Nbs圖3 Nbs中三種不同類型的額外二硫鍵

根據(jù)以上分析可以看出在CDR1、FR2、CDR2區(qū)域出現(xiàn)的Cys 一般出現(xiàn)在保守位置上，而CDR3的Cys位置是隨機的，這是因為前者是由駱駝的種系基因編碼，而CDR3中第二個Cys密碼子出現(xiàn)在V?D?J重排后或之后的體細胞超突變［72］。大量序列分析發(fā)現(xiàn)，Nbs的Cys總是成對出現(xiàn)的，這是由于Nbs 在B 細胞受體成熟期間進行陽性選擇的結(jié)果［14，59，73］。含有未配對Cys 的Nbs 容易自發(fā)氧化形成二聚體而失去抗原結(jié)合能力，即便這種克隆被成功分離出來也會因為長時間儲存而導致二聚化［74］。但是，存在一種特殊情況允許這種單Cys的存在，最近報告了一種含有金屬離子結(jié)合位點的Nb，該Nb 結(jié)構(gòu)中沒有配對的Cys 與其他3 個殘基形成了一個與金屬離子Zn2+配位的幾何結(jié)構(gòu)，其中Zn2+代替二硫鍵充當CDR1 和CDR3 環(huán)之間的橋，為CDR3環(huán)構(gòu)象提供了更大的剛性［72］。

3.3 結(jié)構(gòu)域

3.3.1 單體結(jié)構(gòu)

對于Nbs來說，其小分子和單域?qū)傩允瞧淠褪軠囟鹊闹饕獧C制。已經(jīng)證明了同源的常規(guī)IgG1抗體、HCAb、Nbs片段熱穩(wěn)定性依次遞增［26，75］，這可能由于Nbs只有1個免疫球蛋白折疊域，沒有輕鏈、CH1、鉸鏈區(qū)以及Fc片段，其分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)復(fù)雜性要比分別具有6與12個免疫球蛋白折疊域的HcAb、IgG1抗體要低。在應(yīng)對高溫等變性條件時，理論上具有較少折疊形式的蛋白質(zhì)片段更容易重新折疊從而具有更高的耐受性［76］。此外，常規(guī)抗體的二級結(jié)構(gòu)很容易形成增加聚集傾向的β 折疊結(jié)構(gòu)，且其重輕鏈疏水結(jié)合界面的暴露在不可逆聚集中起著核心作用，這些結(jié)構(gòu)特征都導致了駱駝血清中的重輕鏈抗體IgG1在熱處理后其結(jié)合活性嚴重損失［26，77］。在構(gòu)建scFv文庫時，VH與VL的結(jié)合容易出現(xiàn)錯配，導致其在重組表達系統(tǒng)中表達不佳，出現(xiàn)無法識別抗原以及結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等問題［20］。相比之下，只含1個結(jié)構(gòu)域的Nbs不受重鏈與輕鏈配對的限制，避免了這種結(jié)構(gòu)解離導致的不可逆聚集以及重組表達的錯配，大大提高其在變性后或者表達的折疊效率，從而提高了理化穩(wěn)定性。

3.3.2 FR框架區(qū)

CDR 主要決定了Nbs 對靶標的特異性和親和力，但是針對化學變性劑、熱、蛋白酶和極端pH的穩(wěn)定性主要取決于結(jié)構(gòu)域中保守的FR 序列。在傳統(tǒng)抗體中，F(xiàn)R 區(qū)含有大量的疏水殘基（L12、V42、G49、L50、W52、Y95和W117），介導了重鏈與CH1、輕鏈的結(jié)合［19，67，78］。當其孵育溫度高于Tm時，這個疏水界面會隨著常規(guī)抗體天然結(jié)構(gòu)的解離而暴露在外，可能引起分子間的相互作用，導致不良的非特異性聚集與沉淀［24］。Nbs 的聚集需要蛋白質(zhì)展開，從而強調(diào)了天然Nbs 的高溶解度［7］。在駱駝科動物Nbs中，為防止重鏈聚集，框架區(qū)內(nèi)的一些殘基突變?yōu)楦H水的殘基（L12S、G49E、L50R和W117R/G），而其他突變（V42F和W52F/G）則被較長的CDR3 環(huán)覆蓋從而屏蔽了溶劑［19，67，78?79］。特別地，V42F 突變可以填充VH 中由Y95、W117 和CDR3 的側(cè)鏈形成的疏水口袋，而Nbs中的W117R取代允許F42較大的側(cè)鏈向Y95和R117轉(zhuǎn)移［80］，增強結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水堆積，從而增強其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［81］。除此，F(xiàn)R1 的5V 和6E 殘基是很多穩(wěn)定Nbs的共有氨基酸序列，已經(jīng)成為引入負突變工程化的通用殘基［82］。此外，對人VH片段的氨基酸進行“駱駝化”突變，其熔點高于野生VH片段的實驗也證明了Nbs框架序列中的特定氨基酸有助于提高溫度穩(wěn)定性［83］。以上研究表明，特定的氨基酸取代和重新定向的側(cè)鏈可以重塑Nbs結(jié)構(gòu)域并增加其親水性。

3.3.3 CDR超變區(qū)

Nbs與常規(guī)抗體的另一個區(qū)別特征是明顯延伸的CDR3 環(huán)。序列分析驗證了Nbs 的CDR3 平均長度比常規(guī)抗體多5 個氨基酸［84］，尤其是單峰駱駝具有更長的CDR3環(huán)［85］。這些長CDR3環(huán)可以增加抗體與抗原的接觸面積，在一定程度上彌補輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降的不足［69］。理論上，這個增大的CDR3環(huán)表明其具有更大的柔韌性，這可能會降低結(jié)合親和力和抗體穩(wěn)定性。但是在實際的研究中發(fā)現(xiàn)，CDR3長度和熱穩(wěn)定性之間并沒有預(yù)期的負相關(guān)性，而是隨著CDR3長度的增加，穩(wěn)定性略有增加的趨勢更加明顯［7］。較為合理的解釋是長的CDR3環(huán)更有利于通過與殘基的相互作用屏蔽VH 與VL 結(jié)合的疏水界面，增加其親水性并防止二聚化。同時，這種非共價相互作用也穩(wěn)定了這個長CDR3環(huán)，補償了長環(huán)CDR3區(qū)可能引起的不穩(wěn)定效應(yīng)。

此外，CDR3 環(huán)N/C 端附近的Y93、F/Y117 、W118 等保守氨基酸形成的疏水簇也有助于穩(wěn)定CDR3 環(huán)的構(gòu)象［18，67］。因此，CDR 區(qū)殘基可以與FR 區(qū)殘基相互作用，并且這種相互作用具有中和潛在聚集點和對互補位施加結(jié)構(gòu)剛性的雙重作用，其穩(wěn)定性與CDR3長度正相關(guān)，通過二硫鍵或者其他非共價相互作用穩(wěn)定長CDR3環(huán)可進一步增強其穩(wěn)定效應(yīng)。

4 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性優(yōu)化

Nbs穩(wěn)定性信息與結(jié)構(gòu)信息的合并揭示了高度穩(wěn)定納米抗體所特有的結(jié)構(gòu)特征?；谶@些結(jié)構(gòu)特征可以對Nbs采用合理的設(shè)計方法來進行結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性優(yōu)化，包括共有序列驅(qū)動的序列修復(fù)、替換易于修飾的氨基酸、凈蛋白質(zhì)電荷的改變、非天然二硫鍵的引入和CDR 的移植。通過這些策略開發(fā)出在極端條件下仍能保持結(jié)合能力的穩(wěn)定Nbs，從而為生物技術(shù)、檢測、診斷和治療應(yīng)用提供高性能的試劑。

4.1 點突變

4.1.1 基于共有序列的誘變

同一個對象可以篩出多株序列不同的Nbs，這些序列的FR 區(qū)的某些位置基本保守不變，如果這些保守殘基發(fā)生變化可能會導致同源Nbs 的Tm出現(xiàn)重大差異［86?87］，當恢復(fù)這些保守序列有可能導致Tm的增加。例如，一株抗蓖麻毒蛋白Nb 在第117位殘基發(fā)生偏差從共有序列Trp變?yōu)锳rg，恢復(fù)此突變可使其Tm增加而不會降低其抗原親和力以及產(chǎn)量［10］。但是該方法也有例外，比如有研究者通過I122T 突變來恢復(fù)抗肉毒桿菌神經(jīng)毒素Nb E7在位置122的共有序列IIe，雖然可以提高產(chǎn)量，但是突變體Tm并沒有發(fā)生變化［76］。雖然該策略將穩(wěn)定的高概率歸因于蛋白質(zhì)家族特定序列位置上最常見的殘基，具有一定的物種依賴性與偶然性，但是可以作為一個穩(wěn)定性優(yōu)化的重要方向。

4.1.2 易修飾殘基的替換

對抗體序列中易受化學修飾的位點進行結(jié)構(gòu)改造也是其穩(wěn)定性優(yōu)化的重要方向之一。據(jù)報道［8］，用其他的氨基酸取代Nb 序列中所有易于修飾的Asn 殘基（N57S/N82S/N92T）所得到的突變體比野生型Nb 更能抵抗熱誘導的不可逆變性。此外，替換未配對的Cys不僅可以提高產(chǎn)量，還可能提高其Tm［10］。Asn和Cys的修飾是引起Nbs變性的關(guān)鍵因素之一，替換這些易于修飾的殘基有利于提高Nbs的耐熱性。

4.1.3 負突變殘基的引入

通過用帶電殘基替換暴露于溶劑的殘基來增加蛋白質(zhì)的凈電荷，可以顯著降低其聚集特性。由于穩(wěn)定性Nbs的等電點傾向于酸性，因此在某些Nbs的序列中引入負電荷突變或者在其C端引入一段負電荷序列以降低等電點，不僅可以提高產(chǎn)量，還可以提高溶解度、熔解溫度與抗聚集能力，改善變性后的折疊，利于Nbs 在高濃度條件下的儲存［10，65，76，82］。添加電荷可以防止聚集，但也會破壞抗體的折疊狀態(tài)，選擇要突變的殘基要同時保留Nbs 天然結(jié)構(gòu)，在非抗原結(jié)合區(qū)的框架1 中引入負突變Q1E/D、K3Q、Q5V、A6E基本成為了優(yōu)先考慮的負突變位點［10，65，82，88］。

4.2 二硫鍵的工程化

在Nbs中進行二硫鍵的工程化是提高其穩(wěn)定性最為廣泛使用的方法之一，大量文獻集中研究比較了引入不同數(shù)量與位置的Cys對Nbs的穩(wěn)定性和親和力的影響（表3）。在數(shù)量上，Saerens等［59］分別在3 個不同的Nbs 中通過突變獲得了含有0～3 個二硫鍵的突變體。實驗表明，去除保守二硫鍵大多會導致其Tm的急劇下降，而引入一個工程化二硫鍵則基本可以提高其穩(wěn)定性，但是當Cys 數(shù)量達到8個甚至10 個時則容易導致突變體形成無功能多聚體。此外，目前也鮮見具有多于4 個天然Cys 的Nbs 的報道，說明過多Cys 容易導致二硫鍵的異常配對，無法形成正確穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)。在位置上，Hagihara等［9］首次使用Cys取代Nbs中的埋藏殘基A54（FR2）和I78（FR3），插入的二硫鍵在抗原親和力基本不變的情況下使其Tm提高了10°C。其中殘基A54 和I78 在Nbs 中高度保守，并跨越β 折疊之間的疏水內(nèi)部。隨后有不少研究人員相繼對不同抗體的相同位置進行了突變，加入第2個二硫鍵的突變體可使其Tm增加4～20°C，甚至在多次加熱冷卻循環(huán)處理后仍保持接近100% 的結(jié)合能力［10?11，89］。此外，引入這個連接FR2與FR3的二硫鍵還可以在酸性pH 和存在化學變性劑的情況下提高Nbs熱穩(wěn)定性和蛋白酶抗性，使其具有更高的胃腸道穩(wěn)定性［51，89?91］。另外，也有學者比較了其他不同二硫鍵插入位點（C4～117、C36～110、C53～112以及C44～50）對其穩(wěn)定性的影響，但是發(fā)現(xiàn)盡管大部分突變體都可以提高親本的Tm，但卻犧牲了部分親和力、產(chǎn)量或者變性重折疊能力［11，92］。以上實驗表明通過蛋白質(zhì)工程在A54 和I78 處引入額外的二硫鍵已經(jīng)成為提高Nbs平衡熱力學穩(wěn)定性的通用方法。

Table 3 Disulfide bond engineering of Nbs表3 Nbs二硫鍵的工程化

通過定點誘變加入工程化的二硫鍵是穩(wěn)定Nbs的有效方法，但是此方法也會對其應(yīng)用性能產(chǎn)生一定的影響。a.在需要高溫長時間孵育的應(yīng)用中，添加的額外二硫鍵甚至天然存在的二硫鍵可能會由于熱誘導的二硫鍵改組和Cys殘基的修飾，顯示出影響Nbs復(fù)性的能力［20?21，53］。b.在某些情況下，二硫鍵的引入會對親和力以及特異性產(chǎn)生難以預(yù)測的負面影響［59，90］。c.由于在折疊過程中可能形成錯誤的二硫鍵，Nbs在大腸桿菌中的表達會受到二硫鍵的影響［14，21］。因此，在進行抗體的二硫鍵工程化時應(yīng)該綜合考慮穩(wěn)定性、親和力與表達量等方面的影響。

4.3 CDR超變區(qū)的移植

由于部分Nbs序列高度保守，可以通過移植不太穩(wěn)定的抗原特異性Nb的CDR到一些高度穩(wěn)定的Nbs 框架上以獲得具有環(huán)供體Nb 的抗原結(jié)合特性與支架受體Nb的穩(wěn)定性的嵌合體，這種CDR移植技術(shù)已用于常規(guī)抗體片段的穩(wěn)定改造［94?95］。在Nbs的應(yīng)用中，已經(jīng)報道了多個可以實現(xiàn)相應(yīng)功能的保守框架，例如人源化框架cAbBCII10［96］、hs2dAb［97］、C8WT［98］以及針對細菌表達優(yōu)化的人工設(shè)計CF支架［99］。其中框架cAbBCII10是一種具有較高構(gòu)象穩(wěn)定性的單峰駝通用框架，將家族2 Nbs 的CDR 移植到該框架上保留了CDR 供體抗原結(jié)合能力的同時顯示出了增加的穩(wěn)定性［62］。此外，Zabetakis 等［100］此前曾報道，將CDR2 從具有高熔點的抗葡萄球菌腸毒素B的Nb A3移植到具有低熔點的抗蓖麻蛋白Nb中可以使嵌合體克隆Tm提升15℃。雖然CDR 移植比較局限于Nbs 亞家族的限制［62］，且還可能導致Nbs 與靶標結(jié)合能力的下降［100］，但是利用具有特定特性的支架進行CDR超變區(qū)交換是一種嘗試增加抗體穩(wěn)定性的可行方法。

5 展 望

雖然目前已經(jīng)有很多研究者通過定點突變、引入二硫鍵等工程化的方法制備出很多相對親本更穩(wěn)定的Nbs，但是大多數(shù)的工程化是基于共有序列分析與經(jīng)驗值的基礎(chǔ)上，鮮有報道涉及晶體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性分析，這可能導致得出的穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)信息具有一定的片面性。蛋白質(zhì)晶體的制備與X?射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最直觀、準確的技術(shù)，可以在分子水平上闡明分子間相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。未來的研究可以更多地綜合利用蛋白質(zhì)結(jié)晶、X?射線晶體結(jié)構(gòu)解析、分子動力學等技術(shù)建立Nbs與抗原的三維空間結(jié)構(gòu)模型，明確重鏈抗體識別方式、關(guān)鍵氨基酸殘基、結(jié)合位點、作用力類型等關(guān)鍵信息，全面探討Nbs的一級序列結(jié)構(gòu)、二級折疊結(jié)構(gòu)、三級空間結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的關(guān)系與規(guī)律。鑒于Nbs在臨床應(yīng)用上取得的成果，未來Nbs在復(fù)雜基質(zhì)與環(huán)境的檢測等方面具有較為廣闊的應(yīng)用前景，值得進行深入的系統(tǒng)研究。