李世雄，趙思宇，李 源，何文婧，張喜利*，劉文龍, 3*

中藥復(fù)方配伍理論下生血寶復(fù)方化學(xué)成分溶出規(guī)律研究

李世雄1, 2，趙思宇1，李 源1，何文婧4，張喜利1, 2*，劉文龍1, 2, 3*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208 2. 中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208 3. 中西醫(yī)結(jié)合病原生物學(xué)湖南省點重實驗室，湖南 長沙 410208 4. 長沙醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219

通過檢測7種配伍及7個單味組成藥的單個化學(xué)成分與總響應(yīng)成分的溶出量及變化情況，探討生血寶復(fù)方配伍理論背后的科學(xué)內(nèi)涵。根據(jù)生血寶復(fù)方中君臣佐使組方規(guī)律將各單味藥重新進行配伍分組，建立16種成分（原兒茶酸、原兒茶醛、紅景天苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮苷、二苯乙烯苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮、特女貞苷、白藜蘆醇、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芒柄花素、旱蓮苷A、大黃素、大黃素甲醚）同時含量測定的超高效液相色譜（UPLC）-二極管陣列檢測器（PDA）方法學(xué)，并運用總量統(tǒng)計矩等方法進行定性定量分析。7種配伍分組（君、臣、佐使、君加臣、君加佐使、臣加佐使、復(fù)方）16個成分的總?cè)艹隽壳?位的是E（君＋佐使）、復(fù)方組、C（佐使），分別為2.956 3、2.884 6、2.007 2 mg/g，與復(fù)方指紋圖譜相似度最高前3位是D（君＋臣）、B（臣）和墨旱蓮，其值分別為0.767、0.754、0.711。從中藥化學(xué)成分溶出規(guī)律角度探討了中藥復(fù)方配伍理論科學(xué)內(nèi)涵，研究結(jié)果揭示了生血寶復(fù)方中各成分的溶出度受復(fù)方配伍規(guī)律的影響與支配，同時也為生血寶復(fù)方制劑的現(xiàn)代化研究奠定了基礎(chǔ)。

中藥現(xiàn)代化；中藥復(fù)方；生血寶；配伍理論；溶出規(guī)律；君臣佐使；中藥方劑；原兒茶酸；原兒茶醛；紅景天苷；芍藥苷；毛蕊異黃酮苷；二苯乙烯苷；木犀草苷；毛蕊異黃酮；特女貞苷；白藜蘆醇；木犀草素；蟛蜞菊內(nèi)酯；芒柄花素；旱蓮苷A；大黃素；大黃素甲醚

中藥復(fù)方配伍是中醫(yī)施治的主要方式，為幾千年用藥沿革的鮮明特色[1]。中醫(yī)講究理法方藥、辨證論治，通過中藥合理配伍實現(xiàn)臨床個體化用藥目的[2]?！熬甲羰埂痹从凇渡褶r(nóng)本草經(jīng)》，古人借“君臣佐使”理清中藥復(fù)方中各單味藥的主次和相互關(guān)系，針對不同證候發(fā)揮不同作用以達到辨證論治目的[3]。中藥方劑的“君臣佐使”表現(xiàn)在：以其中的君藥為主要物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)揮主要功效，而臣佐使藥協(xié)助與調(diào)和以達到最佳功效與治療目的[4]。

復(fù)方發(fā)揮功效的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥化學(xué)成分，中藥化學(xué)成分從形成到進入機體發(fā)揮療效歷經(jīng)了幾個階段：第1階段為自然生長或經(jīng)炮制加工所形成中藥及飲片，其物質(zhì)形態(tài)是源頭與基礎(chǔ)，通過采收天然生長或者種植加工后或經(jīng)炮制獲得；第2階段為中藥劑型單元操作所形成的中間體或者制劑，其物質(zhì)形態(tài)通過配伍組方后經(jīng)制劑單元操作而成；第3階段則是進入體循環(huán)至靶點發(fā)揮作用時的中藥成分群（顯效形式），其物質(zhì)形態(tài)通過機體的ADME（吸收、分布、代謝、排泄）過程形成后發(fā)揮功效。中藥復(fù)方配伍理論在中藥成分從第1階段到第2階段的轉(zhuǎn)變過程發(fā)揮了重要的指導(dǎo)作用，亦即復(fù)方中各單味藥在不同的君臣佐使配伍下，其化學(xué)成分群的溶出情況不是簡單的加減變化規(guī)律，與中藥的“七情”配伍、“增溶助溶潛溶”以及形成超分子體有關(guān)。因此，本實驗從不同配伍下中藥湯劑的成分溶出情況探討中藥復(fù)方配伍理論背后的科學(xué)內(nèi)涵。

生血寶復(fù)方由制何首烏、墨旱蓮、桑椹、女貞子、白芍、黃芪、狗脊7味中藥組成，其中以制何首烏為君，是補肝腎、益精血的滋補良藥[5]，以墨旱蓮、桑椹、女貞子為臣，滋補肝腎，以白芍、黃芪、狗脊為佐使[6]。目前，臨床主要針對放、化療所致的白細胞減少，缺鐵性貧血、化療后貧血等方向都具有良好的治療效果[7-9]，也有選用生血寶合劑討論輔助治療新型冠狀病毒肺炎的可行性研究分析[10]。近年來有基于質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）理念選擇生血寶合劑進行研究，建立了高效液相色譜-紫外-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-UV-MS）定性定量方法[11]，也有采用HPLC-UV-MS分析法建立生血寶合劑有效含量測定的方法[12]，但并沒有針對生血寶復(fù)方配伍理論以及單味藥的對比性研究。

本研究從中藥復(fù)方配伍理論出發(fā)，將生血寶復(fù)方按照“君臣佐使”的原則重新分成7個配伍，連同7個單味藥一起進行其特征超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜分析，探究“君臣佐使”原則下，生血寶單味藥、不同配伍及復(fù)方中的16種成分在不同配伍下溶出情況及規(guī)律，分析中藥配伍的關(guān)系與作用機制，闡明復(fù)方中君臣佐使關(guān)系的科學(xué)內(nèi)涵[13-14]，助力中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀，PDA檢測器、四元梯度泵、自動進樣裝置、在線真空脫氣裝置、柱溫箱、Empower3色譜工作站，美國Waters公司；MD205DU電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；SB?5200DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZDHW型電熱套，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 試劑與藥材

依據(jù)《中國藥典》2020年版及相關(guān)文獻查詢結(jié)果[15-25]，選取16種對照品分別為毛蕊異黃酮苷（批號DST201220-013）、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-- β--葡萄糖苷（批號DST201021-061）、特女貞苷（批號DSTDT000901）、紅景天苷（批號DST200425- 037）、蟛蜞菊內(nèi)酯（批號DST210319-003）、旱蓮苷A（批號DST200401-021）、木犀草苷（批號DST201102-016）、木犀草素（批號DSTDM003202）、白藜蘆醇（批號DST200308-045）、原兒茶醛（批號DSTDY008001）、毛蕊異黃酮（批號DST200609- 012）、芒柄花黃素（批號DST201025-011）購于湖南樂美天生物科技有限公司；大黃素（批號110756- 200110）、大黃素甲醚（批號16070403）、原兒茶酸（批號110809-200604）購于中國食品藥品鑒定研究院；芍藥苷（批號L07M9Q60533）購于上海源葉生物科技有限公司，所有對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%。甲醇（批號21075141）、乙腈（批號1903517）均為色譜純，美國Tedia公司；磷酸（批號20190629- 2），分析純，湖南匯虹試劑有限公司；水為怡寶純凈水；0.22 μm微孔濾膜（批號Y8101409），上海安譜實驗科技有限公司。

制何首烏、黃芪、桑椹、女貞子、墨旱蓮、白芍、狗脊購于湖南老百姓大藥房，藥材來源均為湖南藥圣堂中藥科技有限公司，批號分別為20201101、20210401、20210401、20201101、20210701、20210701、20201101，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室石繼連教授鑒定，制何首烏為蓼科何首烏屬植物何首烏Thunb.干燥塊根的炮制加工品、黃芪為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Fisch.Bge. var.Bge. Hsiao的干燥根、桑葚為?？粕僦参锷.的干燥果穗、女貞子為木犀科女貞屬植物女貞Ait.的干燥成熟果實、墨旱蓮為菊科鱧腸屬植物鱧腸L.的干燥地上部分、白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根、狗脊為蚌殼蕨科金毛狗屬植物金毛狗脊(L.) J. Sm.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 生血寶復(fù)方及配伍組方供試品溶液的制備 依據(jù)《中國藥典》2020年版，以君臣佐使原則，復(fù)方劑量嚴(yán)格按照藥典“處方”內(nèi)容，參考“制法”內(nèi)容[15]，將生血寶復(fù)方七味藥分為“君一臣三佐使三”后重組的7個配伍組方（表1），按表1進行配伍稱取，剪碎，加8倍量水，浸泡20 min，再煎煮1.0 h，趁熱抽濾藥液，濾渣棄去，濾液減壓濃縮至適量，獲得其含生藥量均為1.0 g/mL，得供試品溶液，備用。

表1 按君臣佐使原則重組7種配伍組方

Table 1 Reorganization of seven compatible formulas based on the principle of monarch, minister, assistant

組方制何首烏/g墨旱蓮/g桑椹/g女貞子/g白芍/g黃芪/g狗脊/g A（君藥）645 B（臣藥） 807.5807.5807.5 C（佐使藥） 645645645 D（君＋臣）645807.5807.5807.5 E（君＋佐使）645 645645645 F（臣＋佐使） 807.5807.5807.5645645645 G（復(fù)方）645807.5807.5807.5645645645

2.1.2 單味藥供試品溶液的制備 分別稱取白芍、制何首烏、黃芪、桑椹、女貞子、墨旱蓮、狗脊各4.0 g，剪碎，加8倍量水，浸泡20 min，再煎煮提取1.0 h，趁熱抽濾藥液，濾渣棄去，濾液濃縮至4.0 mL，得單味藥供試品溶液，其生藥量為1.0 g/mL。

2.1.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品毛蕊異黃酮苷2.6 mg、毛蕊異黃酮2.9 mg、芒柄花素3.4 mg，置1 mL量瓶中，加甲醇溶液定容，即得；分別精密稱取對照品2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-- β--葡萄糖苷0.4 mg、特女貞苷2.6 mg、紅景天苷1.0 mg、蟛蜞菊內(nèi)酯0.1 mg、旱蓮苷A 6.2 mg、木犀草素0.7 mg、木犀草苷0.6 mg、白藜蘆醇0.6 mg、原兒茶醛1.7 mg、大黃素3.5 mg、大黃素甲醚3.1 mg、芍藥苷1.3 mg、原兒茶酸0.8 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液定容，即得。取各對照品溶液各200 μL，制成混合對照品溶液。

2.2 同時測定16種成分的方法學(xué)研究

2.2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC C18色譜柱T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～54 min，26%乙腈；54～57 min，26%～35%乙腈；57～59 min，35%乙腈；59～75 min，80%乙腈；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1.0 μL；全波長掃描200～400 nm，圖例顯示選取波長220 nm。

2.2.2 UPLC圖的建立 將配伍后的7個組方按照“2.1”項下方法制備供試品溶液，均按“2.2.1”項下條件進樣，記錄各供試品的色譜圖。本研究初期針對生血寶復(fù)方中共20種對照品（例如芹菜素及山柰酚等）進行研究，但由于對照品數(shù)量巨大且部分對照品在水提液中含量過低等問題，故選取7單味藥、7個配伍組方及16種對照品（木犀草素與毛蕊異黃酮保留時間相近，定量時通過分別選取不同最大吸收波長得以實現(xiàn)）的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度軟件評價系統(tǒng)（2012版）”，得圖1。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.3”項下配制的混合對照品溶液適量進行稀釋，以峰面積為橫坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（）進行線性回歸，其回歸方程和線性范圍見表2。按照“2.2.1”條件進樣，同時測定16個化合物含量，獲得了16種對照品的良好線性方程與線性范圍，線性關(guān)系良好（≥0.999 5），其線性范圍均滿足本研究的含量測/定。

2.2.4 精密度試驗 按照已經(jīng)建立的UPLC分析條件，取“2.1.3”項下配制的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明該方法的精密度符合要求，測得各相對峰面積RSD為2.75%～4.78%，說明儀器精密度良好。

1-原兒茶酸 2-原兒茶醛 3-紅景天苷 4-芍藥苷 5-毛蕊異黃酮苷 6-二苯乙烯苷 7-木犀草苷 8-特女貞苷 9-白藜蘆醇 10-木犀草素 (毛蕊異黃酮，最大吸收波長280 nm) 11-蟛蜞菊內(nèi)酯 12-芒柄花素 13-旱蓮苷A 14-大黃素 15-大黃素甲醚 A～G-各組方（同表1）

表2 16種對照品的線性方程與線性范圍

Table 2 Linear equations and linear ranges of 16 reference substances

成分線性方程r線性范圍/(μg?mL?1)成分線性方程r線性范圍/(μg?mL?1) 二苯乙烯苷y＝1.03×10?7x＋0.052 90.999 961.9～570.0毛蕊異黃酮y＝5.02×10?6x－1.78×10?30.999 911.3～118.0 大黃素y＝3.81×10?8x＋3.04×10?40.999 91.47～19.00木犀草素y＝7.09×10?6 x＋9.97×10?30.999 9423.0～1210.0 大黃素甲醚y＝4.93×10?8x＋1.35×10?40.999 90.13～10.00毛蕊異黃酮苷y＝1.05×10?7x＋2.17×10?30.999 92.60～23.00 蟛蜞菊內(nèi)酯y＝7.45×10?8x＋1.40×10?40.999 90.13～14.00芒柄花素y＝1.89×10?7x－5.92×10?40.999 99.00～28.00 特女貞苷y＝2.00×10?8x＋0.037 10.999 740.0～100.0木犀草苷y＝2.47×10?7x－0.033 30.999 942.0～190.0 紅景天苷y＝2.40×10?7x－9.51×10?50.999 910.3～128.0原兒茶醛y＝1.43×10?7x＋1.47×10?40.999 913.5～129.0 旱蓮苷Ay＝2.44×10?6x－2.06×10?30.999 910.0～57.0芍藥苷y＝5.00×10?6x＋0.033 50.999 952.0～100.0 原兒茶酸y＝5.48×10?8x＋1.56×10?40.999 92.07～115.00白藜蘆醇y＝4.01×10?6x＋0.026 40.999 99.20～36.00

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.1”項下配制的復(fù)方湯劑供試品溶液，按上述色譜條件下分別于制備后0、4、8、16、24、48 h進樣，獲得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD為1.46%～4.55%，表明在48 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 按“2.1.1”項下方法平行配制復(fù)方湯劑供試品溶液6份，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結(jié)果得質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.98%～4.88%，表明實驗重復(fù)性較良好，結(jié)果表明方法的重復(fù)性在誤差范圍內(nèi)。

2.2.7 加樣回收率試驗 取已測定各指標(biāo)成分含量的復(fù)方湯劑供試品溶液9份，分為3組，分別按照已知濃度50%、100%、150% 3個水平加入各對照品溶液，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，獲得各對照品平均加樣回歸收率為96.4%～102.5%，RSD為0.66%～3.25%。

2.3 單一成分的溶出量測定

同時測定16種化合物在生血寶單味中藥及7種配伍中的溶出量情況，從16種成分總?cè)艹隽靠梢悦黠@看出，E（君＋佐使）的溶出量最大（2.956 3 mg/g），其次為G復(fù)方（2.884 6 mg/g），其結(jié)果列于表3。本研究中白藜蘆醇在單味藥及相應(yīng)配伍中均未檢測到。

從表3可以看出：①用本研究建立的方法從7個單味藥與7種配伍中可以檢出15種成分，分別存在于除桑椹以外的6味中藥及配伍中。②可以明顯看出與單味藥相比，經(jīng)復(fù)方配伍后溶出量明顯減少的成分有：原兒茶酸、紅景天苷、二苯乙烯苷、特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、旱蓮苷A和大黃素；變化不明顯的有：毛蕊異黃酮苷、木犀草素、大黃素甲醚；明顯增加的有：原兒茶醛、芍藥苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素。③從16種成分溶出的總量來看，E（君＋佐使）的溶出量最大（2.956 3 mg/g），復(fù)方次之（2.884 6 mg/g），C（佐使）更次之（2.007 2 mg/g），佐使藥（白芍、黃芪、狗脊）與君藥配伍后有明顯加強溶出量的作用。但同時發(fā)現(xiàn)E（君＋佐使）總?cè)艹隽看笥趶?fù)方約0.07，其原因可能為在復(fù)方的復(fù)雜體系中，臣藥的加入改變了煎煮過程中各化學(xué)成分體系的環(huán)境，在其中起到了調(diào)協(xié)配比的作用。從各單味中藥來看，黃芪的溶出量最大（1.343 0 mg/g），制何首烏（君藥）次之（1.114 7 mg/g），女貞子更次之（0.781 0 mg/g）。

2.4 指紋圖譜相似度分析

2.4.1 單味藥與配伍之間的相似度分析 將各單味藥及不同配伍樣品的指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會開發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜相似度軟件評價系統(tǒng)（2012版）”，計算其相似度值。從表4可以看出，①各單味中藥及其配伍的指紋圖譜間的相似度都不大，說明相似度值可以客觀反映其圖譜樣品來源的一致性；②與G（復(fù)方）相似度最高是D（君+臣），其值為0.767，其次是B（臣）、b（墨旱蓮）、A（制何首烏），其相似度分別為0.754、0.711、0.701，其他均小于0.6。

表3 16種成分在原藥材及7種配伍下的溶出情況及含量限度

Table 3 Dissolution and limit of content of 16 reference substances in original medicinal materials and 7 kinds of compatibility

樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1) 原兒茶酸（0.2）原兒茶醛紅景天苷（2.0）芍藥苷（16）毛蕊異黃酮苷（0.2）二苯乙烯苷（7.0）木犀草苷特女貞苷（7.0）木犀草素 A/////1.099 1/// B//0.323 1////0.086 1/ C0.105 40.096 5/0.233 10.067 7/0.175 2/0.861 2 D//0.104 4//0.195 4/0.063 0/ E0.106 60.035 2/0.583 00.102 30.278 50.180 1/1.012 0 F0.089 00.050 10.097 20.305 00.060 8/0.130 00.055 00.608 8 G0.108 40.091 60.154 10.466 20.061 10.170 20.390 40.062 30.873 4 墨旱蓮///////// 桑椹///////// 女貞子//0.616 6////0.163 6/ 白芍///0.158 3///// 黃芪////0.051 3/0.081 8/0.950 1 狗脊0.136 20.063 8///////

續(xù)表3

樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1) 毛蕊異黃酮蟛蜞菊內(nèi)酯（0.4）芒柄花素旱蓮苷A（2.0）大黃素（1.0）大黃素甲醚（1.0）白藜蘆醇總量 A////0.015 20.000 7/1.115 0 B/0.033 2/0.057 1///0.499 5 C0.514 8/0.019 2////2.073 1 D/0.034 0/0.028 10.005 40.001 2/0.431 5 E0.628 8/0.023 0/0.006 80.000 3/2.956 6 F0.155 00.018 70.004 80.003 4///1.577 8 G0.445 10.016 60.016 20.027 30.003 00.000 6/2.886 5 墨旱蓮/0.025 3/0.035 0///0.060 3 桑椹///////0.000 0 女貞子///////0.780 2 白芍///////0.158 3 黃芪0.251 2/0.008 8////1.343 2 狗脊///////0.200 0

“/”為未檢出，各成分后括號中的數(shù)值為原藥材中含量限度（為藥典中所記載的內(nèi)容，經(jīng)過濃度換算獲得）

“/” is not detected, the values in parentheses of each component are the limits of content in original medicinal materials

2.4.2 總量統(tǒng)計矩參數(shù)及相似度評價系統(tǒng) 應(yīng)用本團隊前期創(chuàng)立的總量統(tǒng)計矩參數(shù)及相似度分析方法[26-29]，分析計算生血寶單、復(fù)方總量統(tǒng)計矩三參數(shù)及其相似度值，從表5可以看出總量零階矩參數(shù)值排在前3的依次為F（臣＋佐使）、e（女貞子）和B（臣藥）。表6可知D（君＋臣）/（A＋B）、E（君＋佐使）/（A＋C）、G（復(fù)方）/（A＋B＋C）的相似度分別為0.918，0.953和0.948；表7可知B（臣）/（b＋c＋d）、F（臣＋佐使）/（B＋C）的相似度分別為0.849，和0.925；表8可知C（佐使）/（e＋f＋g）的相似度為0.886。通過相似度可以發(fā)現(xiàn)單味藥與其相應(yīng)配伍指紋圖譜相似度差異性較小，除臣藥配伍總量統(tǒng)計矩中存在相似度值為0.798、0.773、0.747，其余均大于0.800；與復(fù)方相似度最高的為（君＋臣）配伍，為0.767，其次為臣藥，值為0.754，其結(jié)果可以進一步佐證君臣相須的科學(xué)內(nèi)容。其余結(jié)果列于表5～8。

表4 所有單味藥與配伍之間的相似度分析結(jié)果

Table 4 Similarity analysis results of all single herbs and compatibility

樣品相似度 制何首烏墨旱蓮桑椹女貞子白芍黃芪狗脊BCDEFG對照 制何首烏1.0000.7540.3030.0490.0040.4910.0290.6310.3010.7180.4210.5840.7010.773 墨旱蓮0.7541.0000.3180.0670.0080.6540.0490.8110.2300.8350.3950.6520.7110.833 桑椹0.3030.3181.0000.0690.0660.2050.1750.3270.1830.4800.2500.4600.4980.487 女貞子0.0490.0670.0691.0000.0140.0790.0490.4400.1070.0670.1010.1050.2940.380 白芍0.0040.0080.0660.0141.0000.0230.0430.0200.0160.0100.0120.0290.0160.203 黃芪0.4910.6540.2050.0790.0231.0000.0620.5580.2130.5500.3040.4770.4650.590 狗脊0.0290.0490.1750.0490.0430.0621.0000.0790.1290.0350.0860.0830.0770.186 B0.6310.8110.3270.4400.0200.5580.0791.0000.3180.6630.3920.5600.7540.866 C0.3010.2300.1830.1070.0160.2130.1290.3181.0000.2420.4150.1820.6400.468 D0.7180.8350.4800.0670.0100.5500.0350.6630.2421.0000.4080.6740.7670.815 E0.4210.3950.2500.1010.0120.3040.0860.3920.4150.4081.0000.5990.5080.583 F0.5840.6520.4600.1050.0290.4770.0830.5600.1820.6740.5991.0000.5720.725 G0.7010.7110.4980.2940.0160.4650.0770.7540.6400.7670.5080.5721.0000.888 對照0.7730.8330.4870.3800.2030.5900.1860.8660.4680.8150.5830.7250.8881.000

3 討論

生血寶復(fù)方是滋補肝腎、益氣活血的良藥。生血寶顆粒劑因其療效顯著被收錄于《中國藥典》2020年版中[15]，為湖南省中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要品種之一。其以制何首烏為君，墨旱蓮、桑椹、女貞子為臣，白芍、黃芪、狗脊為佐使，7味藥互相配伍共起滋補肝腎、生津養(yǎng)血之效，常用于肝腎不足、氣血兩虛所致的神疲乏力、腰膝痠軟、頭暈耳鳴等癥狀。本研究基于化學(xué)成分、藥效等方面，嚴(yán)格考察《中國藥典》2020年版及相關(guān)文獻查詢最終選取了7味藥中16個單一化合物作為溶出情況研究對象，例如制何首烏中大黃素具有對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的保護作用[30]；桑葚中的白藜蘆醇能夠調(diào)控細胞炎癥因子水平，修復(fù)細胞損傷[31]；墨旱蓮中木犀草素具有明顯的抗炎抗氧化作用等[32]。眾所周知，單一化合物的溶出情況不僅與本身及溶媒體系的理化性質(zhì)有關(guān)，還與其所處的化學(xué)成分微環(huán)境有關(guān)。單純的溶質(zhì)與溶劑的關(guān)系遵循“相似相溶”規(guī)律，其溶解度大小由溶質(zhì)與溶劑的溶度參數(shù)、溶劑的介電常數(shù)等綜合決定；但倘若為復(fù)雜溶質(zhì)或者混合溶劑，就會出現(xiàn)“增溶、助溶、潛溶”等復(fù)雜相互作用情況，其溶解情況將會偏離“相似相溶”理論[33-35]。因此，中藥復(fù)方湯劑中檢出很多中等極性或弱極性的成分，諸如本研究在生血寶湯劑中檢出有蟛蜞菊內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮苷等脂溶性成分。

表5 生血寶單、復(fù)方總量統(tǒng)計矩三參數(shù)

Table 5 Single herb and compound prescription of Shengxuebao, three values of total statistical moment

藥材總量零階矩/(×107μV·s)一階矩/min二階矩/min2組方總量零階矩/(×107μV·s)一階矩/min二階矩/min2 制何首烏4.62618.713272.890A4.62618.713272.890 墨旱蓮3.6889.959279.266B8.50223.243345.076 桑椹3.22418.307219.144C4.56920.302186.892 女貞子9.70337.767330.223D4.59619.224431.141 白芍5.21723.609177.004E5.70920.980204.171 黃芪1.01013.213305.753F13.14722.215291.751 狗脊5.39321.684143.254G7.04319.213267.609

表6 君藥配伍的總量統(tǒng)計矩相似度分析結(jié)果

Table 6 Results of total statistical moment similarity analysis of monarch drug compatibility

樣品相似度 DEGA＋BA＋CA＋B＋C D1.0000.8180.8850.9180.8500.897 E0.8181.0000.9230.8880.9530.916 G0.8850.9231.0000.9310.9640.948 A＋B0.9180.8880.9311.0000.9060.971 A＋C0.8500.9530.9640.9061.0000.933 A＋B＋C0.8970.9160.9480.9710.9331.000

表7 臣藥配伍的總量統(tǒng)計矩相似度分析結(jié)果

Table 7 Results of total statistical moment similarity analysis of minister drug compatibility

樣品相似度 BDFG墨旱蓮＋桑椹＋女貞子A＋BB＋CA＋B＋C B1.0000.9070.9550.8950.8490.9630.9550.942 D0.9071.0000.8910.8850.7730.9180.8910.897 F0.9550.8911.0000.9260.8190.9720.9250.979 G0.8950.8850.9261.0000.7470.9310.9260.948 墨旱蓮＋桑椹＋女貞子0.8490.7730.8190.7471.0000.8130.8190.798 A＋B0.9630.9180.9720.9310.8131.0000.9720.971 B＋C0.9550.8910.9250.9260.8190.9721.0000.979 A＋B＋C0.9420.8970.9790.9480.7980.9710.9791.000

表8 有關(guān)佐使藥配伍的總量統(tǒng)計矩相似度分析結(jié)果

Table 8 Results of total statistical moment similarity analysis of assistant drug compatibility

樣品相似度 CFGe＋f＋gB＋CA＋B＋C C1.0000.8840.9100.8860.8840.892 F0.8841.0000.9260.8570.9250.979 G0.9100.9261.0000.9300.9260.948 e＋f＋g0.8860.8570.9301.0000.8570.878 B＋C0.8840.9250.9260.8571.0000.979 A＋B＋C0.8920.9790.9480.8780.9791.000

3.1 單一成分的溶出情況

本研究建立了同時測定16個單一化合物的方法學(xué)，作了相應(yīng)含量測定，各組樣品和含量測定在同樣的提取、檢測環(huán)境下，進行了3組重復(fù)驗證，以保證其實驗結(jié)果的正確性。

通過復(fù)方和單味藥各化學(xué)成分對比可以發(fā)現(xiàn)，芍藥苷、毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素溶出量都有了明顯的增加，其中芍藥苷具有促進造血功能、抗血栓作用[36]；毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素作為黃芪主要化學(xué)物質(zhì)，具有顯著的保護心腦血管、抗氧化等作用[37-38]，說明經(jīng)過配伍煎煮后，相較于單味藥，藥理效應(yīng)有了明顯的加強。而各配伍組、單味藥化學(xué)成分的變化更說明了中藥化學(xué)成分在煎煮過程中的溶出情況會隨著配伍變化而變化，其原因是中藥復(fù)方配伍的變化直接改變了復(fù)雜溶質(zhì)的構(gòu)成比，從而改變了煎煮過程分散體系的化學(xué)微環(huán)境，使生血寶復(fù)方中16種成分溶出情況表現(xiàn)為以上3點規(guī)律，進而對復(fù)方配伍的藥效產(chǎn)生了變化。

3.2 總響應(yīng)成分的溶出情況

本研究從中藥指紋圖譜相似度定量分析總響應(yīng)成分的溶出情況，采用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件評價系統(tǒng)（2012版）進行分析，針對各單位中藥及其配伍進行相似度研究，發(fā)現(xiàn)相似度可以客觀反映各配伍組方與其對應(yīng)中藥的一致性。觀察可知君臣藥與總復(fù)方的相似度最高，說明其與復(fù)方相似度的貢獻率最大，而君藥A的相似度低于臣藥B，可能是因為A的效應(yīng)指數(shù)（效量比）高，也暗示君臣藥對比單用效果強得多；而同為臣藥的桑葚、女貞子的相似度與墨旱蓮的相似度為何相差如此之大，可能正是說明了對復(fù)方總?cè)艹龀煞值呢暙I不一樣，但最終對臨床療效的貢獻還需要做進一步研究。本研究用總響應(yīng)成分溶出定量數(shù)據(jù)初步證明了君臣相須、佐使相輔的科學(xué)內(nèi)涵；

再者，本研究采用團隊建立的總量統(tǒng)計矩及相似度分析方法進行了相關(guān)研究，生血寶復(fù)方G的總量零階矩參數(shù)值并未排入前3，說明單味藥單提溶出的成分在配伍時不會全部溶出，再經(jīng)配伍組方后根據(jù)組方理論與用藥目的選擇性地溶出，且復(fù)方總成分溶出量并不一定是最多的；根據(jù)總量統(tǒng)計矩相似度分析方法具有加和性的特點，如果配伍前后溶出成分是一致的，通過加和性分析其相似度應(yīng)該很高。這些實驗數(shù)據(jù)進一步表明配伍前后中藥成分溶出情況是不一致的，且與君臣佐使配伍規(guī)律有關(guān)。

總?cè)艹隽磕軓目傮w上反映復(fù)方的總體溶出情況，根據(jù)Hill量效關(guān)系，針對同一個中藥復(fù)方，不同的總?cè)艹隽靠梢詮目傮w上反映出整個復(fù)方的效應(yīng)變化情況的，故本研究具有一定的現(xiàn)實意義。此外，本研究建立了運用UPLC法同時檢測16種中藥單一成分的定性定量方法，該方法簡便易操作，重復(fù)性好，為生血寶復(fù)方質(zhì)量綜合評價提供了保障。本研究從中藥成分溶出情況的角度闡釋了中藥復(fù)方生血寶配伍理論的科學(xué)內(nèi)涵，揭示了不同配伍組方影響了其化學(xué)成分溶解度，七味中藥通過君臣佐使配伍所得的生血寶復(fù)方實現(xiàn)了最大溶出度，以達到臨床辨證論治的用藥目的。故本研究為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的提供了新思路與新方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on dissolution law of chemical constituents of Shengxuebao compound under compatibility theory of TCM compound

LI Shi-xiong1, 2, ZHAO Si-yu1, LI Yuan1, HE Wen-jin4, ZHANG Xi-li1, 2, LIU Wen-long1, 2, 3

1. College of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Hunan Key Laboratory of Druggability and Preparation Modification of TCM, Changsha 410208, China 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Changsha 410208, China 4. College of Traditional Chinese Medicine, Changsha Medical University, Changsha 410219, China

The scientific connotation behind the compatibility theory of the Shengxuebao compound was explored by detecting the dissolution and changes of a single chemical component and the total response component of seven compatibilities.According to the prescription rules of monarch and minister assistants in the Shengxuebao compound, the single herbs were regrouped. The UPLC-PDA method was established for the simultaneous determination of 16 components (protocatechuic acid, protocatechuic aldehyde, salidroside, paeoniflorin, calycosin, stilbene glycoside, luteolin, calycosin, ligustrum lucidum glycoside, resveratrol, luteolin, wedelolactone, formononetin, ecliptin A, emodin and physcion) and the total statistical moment method was used for qualitative and quantitative analysis.The top three of the total dissolution of 16 components in 7 compatibility groups (monarch, minister, assistant, monarch plus minister, monarch plus assistant, minister plus assistant and compound) were E (monarch plus assistant), compound and C (assistant), which were 2.956 3, 2.884 6 and 2.007 2 mg/g, and the top three fingerprints with the highest similarity to the compound fingerprints were D (monarch + minister), B (minister) and, and their values were 0.767, 0.754 and 0.711.The scientific connotation of the compatibility theory of traditional Chinese medicine compounds was discussed from the perspective of the dissolution law of chemical components of traditional Chinese medicine. The research results revealed that the dissolution of each component in the Shengxuebao compound was affected and controlled by the compatibility law of the compound, and laid the foundation for the modernization of Shengxuebao compound preparation.

TCM modernization; TCM compound; Shengxuebao; compatibility theory; dissolution law; Junchenzuoshi; TCM prescription; protocatechuic acid; protocatechuic aldehyde; salidroside; paeoniflorin; calycosin; stilbene glycoside; luteolin; calycosin; ligustrum lucidum glycoside; resveratrol; luteolin; wedelolactone; formononetin; ecliptin A; emodin; physcion

R283.6

A

0253 - 2670(2022)14 - 4298 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.009

2022-02-08

國家自然科學(xué)基金資助項目（81874344）；湖南省自然科學(xué)基金資助項目（2021JJ30514）；湖南省中醫(yī)藥管理局項目（2021073）；湖南省中醫(yī)藥管理局項目（2021204）

李世雄，男，碩士研究生，從事中藥質(zhì)量研究。Tel: 15339772189 E-mail: 576555387@qq.com

張喜利，女，副高，碩士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量研究。Tel: 18229764227 E-mail: xiaoli610@126.com

劉文龍，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量與藥劑學(xué)等研究工作。Tel: 13974821547 E-mail: dragon5240@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]