張澤欽 周朝陽張小蘭

（農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施蔬菜生長發(fā)育調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部作物分子育種國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193）

側(cè)枝是植物的重要性狀之一，影響野生物種在自然環(huán)境中的適應(yīng)性以及農(nóng)業(yè)、園藝和林業(yè)作物的產(chǎn)量（Evers et al.，2011）。作物側(cè)枝起源于腋生分生組織，其生長發(fā)育一般分為兩個階段：側(cè)芽起始（initiation）和伸長（outgrowth）（McSteen &Leyser，2005）。

側(cè)芽起始受到多個基因調(diào)控，其中最為重要的是擬南芥的（）及其在水稻中的同源基因（）和番茄中的同源基因（Schumacher et al.，1999；Grassini et al.，2013；Lu et al.，2015），編 碼1 個GRAS 家族的核蛋白。該基因突變后擬南芥和番茄營養(yǎng)生長階段不產(chǎn)生側(cè)枝；在生殖生長階段，側(cè)生分生組織出現(xiàn)在葉腋，并誘導(dǎo)側(cè)枝和花序的產(chǎn)生，但在水稻中不產(chǎn)生分蘗，花序、小穗明顯減少。此外，水稻（）和及其在玉米中的同源基因（）、擬南芥中MYB 家族成員（）、、以 及CUC2/3-DA1-UBP15 調(diào)控模型等均被報道參與腋生分生組織的起始（Müller et al.，2006；Tabuchi et al.，2011；Yao et al.，2019；Li et al.，2020）。目前對于側(cè)枝伸長的研究主要集中在TCP 基因家族轉(zhuǎn)錄因子。玉米和水稻中的同源基因（）、擬南芥和番茄中的同源基因（）均被報道參與側(cè)枝伸長的負(fù)向調(diào)控（Aguilar-Martinez et al.，2007；Minakuchi et al.，2010；Martin-Trillo et al.，2011；Studer et al.，2011）。/作為植物側(cè)枝伸長的中央調(diào)控因子，整合了（）、（）、（）、（-）等 基因，以及Auxin、CKs（cytokinins）、Gas（gibberellic acids）、SLs（strigolactones）、ABA（abscisic acid）、BRs（brassinosteroids）及光信號等多種調(diào)控途徑共同調(diào)控側(cè)枝伸長（Kotov et al.，2021）。除此之外，糖類物質(zhì)也在側(cè)枝發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要角色：豌豆去除頂端，糖類物質(zhì)會先于生長素重新分配并在腋芽中積累，抑制的表達(dá)，觸發(fā)腋芽釋放與生長；在細(xì)胞中過表達(dá)果糖-1，6-二磷酸酶可提高擬南芥體內(nèi)蔗糖水平，降低基因表達(dá)水平從而促進(jìn)側(cè)枝生長（Otori et al.，2017）。對番茄、高粱和小麥側(cè)枝的研究也表明蔗糖供應(yīng)與表達(dá)降低及腋芽生長密切相關(guān)（Kebrom et al.，2012；Kebrom &Mullet，2015；Xia et al.，2021）。

分枝是黃瓜主要的農(nóng)藝性狀之一，較少的側(cè)枝已成為了馴化過程中選擇的目標(biāo)。目前，黃瓜的（）基因已經(jīng)被克隆，在側(cè)芽起始的部位高表達(dá)，異源表達(dá)可以恢復(fù)擬南芥突變體的腋芽形成缺陷表型（Yuan et al.，2010）。黃瓜基因同樣可以抑制側(cè)枝的伸長（Shen et al.，2019），然而，糖類物質(zhì)是否能調(diào)控黃瓜側(cè)枝的發(fā)育還鮮見報道。本試驗(yàn)中，筆者對華北密刺型黃瓜品系461 外源噴施蔗糖溶液，觀察到黃瓜側(cè)枝明顯伸長，轉(zhuǎn)錄組和real-time PCR分析顯示蔗糖可以調(diào)控側(cè)枝伸長基因的表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明蔗糖調(diào)控黃瓜側(cè)枝的伸長，進(jìn)一步完善了黃瓜側(cè)枝發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及生長條件

供試材料為保存于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的華北密刺型黃瓜品系461（Shen et al.，2019），試驗(yàn)于2021 年9 月初開展。挑選飽滿的種子，55～60 ℃水中浸種3～4 h，隨后放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗條件下萌發(fā)24 h，選取發(fā)芽較為一致的種子播種到裝有進(jìn)口草炭與蛭石的穴盤中。待黃瓜幼苗生長到兩葉一心時定植于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)科學(xué)園塑料大棚中。

1.2 植株處理及側(cè)枝測量方法

待黃瓜第5 片真葉展開后，用0、20、40、60 mmol·L蔗糖水溶液分別對黃瓜植株進(jìn)行全株均勻噴施至噴濕不滴落，分別記為CK、E20、E40、E60，每日1 次，處理直至黃瓜15 節(jié)位結(jié)束。每個處理噴施10 株。試驗(yàn)結(jié)束后用刻度尺及游標(biāo)卡尺測量植株各節(jié)位側(cè)枝長度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個處理統(tǒng)計(jì)5 株作為5 個重復(fù)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

待植株長到12 節(jié)位高度時，取40 mmol·L蔗糖處理組（E40）和對照組（CK）第11 節(jié)位2 mm 腋芽用于轉(zhuǎn)錄組測序分析，對照組和處理組各3 個生物學(xué)重復(fù)，測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。利用基因表達(dá)差異倍數(shù)大于1.5，P-value低于0.01 來確定蔗糖處理前后差異表達(dá)基因并在百邁客云平臺（www.biocloud.net）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR 分析

取40 mmol·L蔗糖處理組及對照組植株相同節(jié)位腋芽用RNA 提取試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司，LS1040）提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化科技有限公司，KR118-02）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用TB Green? Premix Ex TaqII（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RR820A）熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，以黃瓜基因（Csa000874）為內(nèi)參基因，采用2計(jì)算方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。試驗(yàn)進(jìn)行3 個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖促進(jìn)黃瓜側(cè)枝伸長

用不同濃度的蔗糖溶液對黃瓜品系461 進(jìn)行噴施處理，對各節(jié)位側(cè)枝長度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與對照組相比，20 mmol·L蔗糖溶液處理組，第3、5節(jié)位的側(cè)枝有顯著伸長；40 mmol·L蔗糖溶液處理組，第2～6 節(jié)位的側(cè)枝均有顯著伸長；60 mmol·L蔗糖溶液處理組，第4～5 節(jié)位的側(cè)枝有顯著伸長（圖1）。以上結(jié)果表明外源噴施蔗糖可以促進(jìn)黃瓜側(cè)枝生長，且40 mmol·L蔗糖溶液促進(jìn)側(cè)枝伸長的效果最為顯著。

圖1 不同濃度蔗糖溶液對黃瓜側(cè)枝發(fā)育的影響

2.2 蔗糖處理后黃瓜腋芽轉(zhuǎn)錄組分析

為了進(jìn)一步研究蔗糖促進(jìn)黃瓜側(cè)枝伸長的分子機(jī)制，選取40 mmol·L蔗糖溶液處理組（E40）及對照組（CK）第11 節(jié)位2 mm 腋芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，共得到40.45 Gb Clean Data。各樣品的Clean Data Q30 堿基百分比均不小于93.08%。分別將各樣品Clean reads 與指定黃瓜參考基因組進(jìn)行序列比對，各樣品的reads 比對效率在95.96%～96.59%之間。主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果顯示對照組和E40處理組的重復(fù)性較好（圖2）。以上結(jié)果表明RNAseq 數(shù)據(jù)可用于下一步分析。以蔗糖溶液處理組與對照組相比基因表達(dá)差異倍數(shù)大于1.5，P-value 低于0.01 來篩選差異表達(dá)基因，共得到568 個差異表達(dá)基因，其中150 個基因表達(dá)上調(diào)，418 個基因表達(dá)下調(diào)（圖3-A）。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（gene ontology）富集分析，差異表達(dá)基因主要富集在生物節(jié)律、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄因子活性、電子轉(zhuǎn)運(yùn)載體、催化活性等生物學(xué)過程（圖3-B）。

圖2 樣本主成分分析

目前已報道的參與植物側(cè)枝發(fā)育的基因大部分為轉(zhuǎn)錄因子，因此選取具有轉(zhuǎn)錄因子活性且與植物側(cè)枝發(fā)育相關(guān)的部分基因繪制熱圖，差異表達(dá)基因主要集中在AP2/ERF、MYB、NAC、TCP 基因家族中。其中，相對于對照組，E40 處理組中與側(cè)芽起始相關(guān)的基因CsaV3_3G003590（）上調(diào)表達(dá)1.62 倍；另外，響應(yīng)糖信號的生物鐘組分CsaV3_5G020710（）以及與遠(yuǎn)紅光反應(yīng)相關(guān)的基因CsaV3_6G009090（）表達(dá)均有差異（圖3-C）。

圖3 蔗糖處理后黃瓜腋芽轉(zhuǎn)錄組分析

進(jìn)一步通過real-time PCR檢測CsaV3_3G003590（）的表達(dá)，相對于對照組，E40 處理組中CsaV3_3G003590（）表達(dá)上調(diào)超過了20 倍（圖4-A）。已有研究結(jié)果表明蔗糖可以抑制基因的表達(dá)促進(jìn)側(cè)枝的伸長（Shen et al.，2019），雖然在轉(zhuǎn)錄組中下調(diào)不明顯，但real-time PCR 試驗(yàn)結(jié)果顯示，蔗糖處理后基因下調(diào)表達(dá)0.6 倍（圖4-E）。此外，熒光定量結(jié)果表明，分生組織維持相關(guān)基因、以及花器官發(fā)育相關(guān)基因均有不同程度表達(dá)量的變化（圖4-B、4-C、4-D）。以上結(jié)果表明蔗糖通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)側(cè)枝的伸長。

圖4 側(cè)枝發(fā)育相關(guān)基因相對表達(dá)量分析

3 討論與結(jié)論

側(cè)枝是黃瓜的主要農(nóng)藝性狀，已有研究表明生長素調(diào)控黃瓜側(cè)枝伸長（Shen et al.，2019），而其他調(diào)控因子尚未見報道。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)黃瓜側(cè)枝的伸長。

糖類物質(zhì)不僅可以作為營養(yǎng)物質(zhì)也可以作為信號物質(zhì)調(diào)控植物的生長發(fā)育（Rolland et al.，2006；Wind et al.，2010）。分枝已經(jīng)逐漸成為了研究糖信號調(diào)控植物發(fā)育的模型（Yadav et al.，2014），外源施加蔗糖可以快速誘導(dǎo)側(cè)枝的發(fā)育。之前的研究表明在豌豆側(cè)芽中糖通量以及側(cè)枝的伸長與的表達(dá)量降低在時間上相吻合（Mason et al.，2014）。本試驗(yàn)對黃瓜幼苗外施蔗糖顯著地增加了側(cè)枝的長度（圖1），熒光定量PCR 結(jié)果顯示蔗糖同樣可以抑制黃瓜基因的表達(dá)（圖4），表明在黃瓜中蔗糖通過抑制的表達(dá)促進(jìn)側(cè)枝的伸長。最近研究發(fā)現(xiàn)外源噴施細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)分枝的伸長，并且蔗糖通過細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)芽的伸長（Salam et al.，2021），暗示蔗糖可能通過促進(jìn)細(xì)胞的分裂調(diào)節(jié)側(cè)枝的伸長。

非常有趣的是，轉(zhuǎn)錄組和熒光定量PCR 結(jié)果顯示蔗糖促進(jìn)了側(cè)芽起始基因的表達(dá)。與對照組相比，很多參與分生組織維持的基因表達(dá)量也發(fā)生了改變。在蔗糖處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，CsaV3_1G001430（）表達(dá)明顯上調(diào)（圖3-C），突變后分生組織發(fā)育有缺陷（Belles-Boix et al.，2006）。蔗糖處理后，與CLAVATA3 信號傳導(dǎo)及STM 維持相關(guān)的CsaV3_6G007770（）和CsaV3_5G027900（）基因分別上調(diào)和下調(diào)表達(dá)（圖3、4）（Müller et al.，2008；Kinoshita et al.，2010；Durbak &Tax，2011），暗示著蔗糖也可能參與調(diào)控黃瓜側(cè)枝的起始。

除此之外，光信號也會影響側(cè)枝發(fā)育。光敏色素B（）突變會降低植物感知紅光與遠(yuǎn)紅光的比率（R/FR），促進(jìn)的表達(dá)，從而抑制側(cè)枝生長（Finlayson et al.，2010；González-Grandío et al.，2013）。本試驗(yàn)中蔗糖處理后CsaV3_6G009090（）基因表達(dá)明顯下調(diào)（圖3）?？梢砸种苝hyA 介導(dǎo)的遠(yuǎn)紅光反應(yīng)（Oh et al.，2020），這暗示著糖信號可能與植物光信號通路互作調(diào)控植物側(cè)枝的發(fā)育。

綜上所述，蔗糖通過調(diào)控一些與側(cè)枝發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控黃瓜側(cè)枝的長度。