李榮榮，瞿申紅，張少杰，翁敬錦，黃雪穎，鐘自玲，鄭少川

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 南寧 530021)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉頭頸科的常見病多發(fā)病之一，是發(fā)生在鼻黏膜的慢性炎癥[1]，由免疫球蛋白E介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病。AR發(fā)病機制復(fù)雜，與多種免疫細胞和細胞因子密切相關(guān)[2-4]，1型輔助T細胞(type 1 helper cells，Th1)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)減少，2型輔助T細胞(type 2 helper cells，Th2)和17型輔助T細胞(type 17 helper cells，Th17)細胞增多，以及Th1/Th2比例降低均是AR的特征性表現(xiàn)[5-7]。目前已有大量研究證實在AR中Th2分泌的細胞因子IL-4、IL-5和IL-13等升高與AR臨床癥狀呈正相關(guān)，并對AR的診斷有重要指導(dǎo)意義[6，8-9]，同時在靶向治療自身免疫病、過敏性免疫紊亂性疾病中也有卓越成效。IL-14也是一種重要細胞因子，又稱高分子量B細胞生長因子(high molecular weight B cell growth factor，HMW-BCGF)，主要是由T淋巴細胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)活化B細胞的增殖，但對靜止的B細胞無刺激作用[10]，目前與IL-14有關(guān)的研究大多是自身免疫疾病和腫瘤[11]，此次研究通過動物實驗，探討在AR的發(fā)病過程中，IL-14在小鼠的血清和鼻黏膜中表達是否有改變 。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由湖南長沙天勤生物技術(shù)有限公司(實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK湘2019-0014)提供20只5周齡的BALB/c小鼠，體重約為15～18 g，接收小鼠后飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學SPF級動物實驗室(實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2020-0003) ，在飼養(yǎng)實驗動物前經(jīng)過正規(guī)申請及審批(實驗動物使用許可證號：SYXK桂2020-0004)。 飼養(yǎng)條件：獨立通風系統(tǒng)，溫度控制在20～26 ℃，鼠籠及實驗室相對濕度40%～70%，晝夜明暗交替時間為12 h，小鼠根據(jù)生理需求自行攝食及飲水(無菌飼料及無菌水)，由專業(yè)飼養(yǎng)人員進行更換鼠籠墊料、添加飼料及飲用水，SPF級實驗室每周進行一次徹底的清潔消毒。

1.2 實驗試劑和器材 見表1。

表1 實驗試劑及耗材

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立 飼養(yǎng)于SPF級的BALB/c小鼠進行分組造模，AR組和對照組各10只，分別于開始造模的第0天、第7天、第14天腹腔注射150 μL PBS+25 μL OVA+25 μL氫氧化鋁和氫氧化鎂混合液進行基礎(chǔ)致敏，然后于第21～25天以1%OVA連續(xù)5 d滴鼻激發(fā)，每天1次，每側(cè)鼻腔5 μL。對照組用等量的PBS替換進行基礎(chǔ)致敏和激發(fā)。

1.3.2 行為學觀察 在最后一次激發(fā)之后用電子稱對每只小鼠進行稱重并在尾部標記編號，然后雙盲法觀察小鼠的行為學變化，每只小鼠觀察30 min，分別記錄小鼠抓鼻、打噴嚏的次數(shù)。

1.3.3 內(nèi)眥靜脈采集及ELISA檢測 在觀察行為學后12 h之內(nèi)用0.3%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，然后利用真空采血針取內(nèi)眥靜脈血，室溫靜置1 h，待血液分層后離心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)，吸取上清至干凈EP管保存于-80 ℃冰箱待用，使用IgE和IL-14 ELISA試劑盒檢測血清IgE和IL-14，每個標準品和樣本均設(shè)置副孔，酶標儀在吸光度450 nm進行檢測。

1.3.4 鼻組織切片 酒精棉球消毒小鼠胸腹部，沿肋緣做“倒V”形切口，逐層剪開皮膚、肌層，暴露膈肌，仔細分離膈肌與周圍組織，保護心臟及大血管，剪開膈肌，沿著胸骨外側(cè)做縱切口，充分暴露胸腔內(nèi)的心臟、肺臟以及大血管，解剖出左心室和右心耳，眼科剪剪開右心耳，使用灌注裝置從左心室進針，先用PBS灌注全身置換血液，至灌注液由鮮紅血液變?yōu)闊o色液體，再用4%多聚甲醛灌注至全身僵硬，將小鼠斷頸，剔除鼻部周圍皮毛和軟組織結(jié)構(gòu)，僅保留小鼠鼻前部約1 cm范圍內(nèi)的鼻骨組織和鼻腔內(nèi)黏膜等組織，加入4%多聚甲醛浸沒，在4 ℃條件下過夜，次日換EDTA脫鈣液浸沒，隔日換液，直至第7天鼻骨組織透明、質(zhì)軟，再依次進行脫水、透明、包埋、切片、烘干、脫臘、HE染色及封片等處理。

1.3.5 剝離鼻黏膜及基因擴增 剝離小鼠鼻黏膜組織，運用Trizol法提取鼻黏膜RNA。首先去除基因組DNA雜質(zhì)，分別加入以下試劑：5×gDNA Eraser Buffer，2.0 μL；gDNA Eraser，1.0 μL，使用基因擴增儀設(shè)置程序，條件為42 ℃ ，2 min；然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再加入PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0 μL；RT Primer Mix，1.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2，4.0 μL；RNase Free dH2O，4.0 μL，體系中總 體積為20.0 μL，在基因擴增儀設(shè)置程序，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。然后進行擴增，配備反應(yīng)體系：PCR Forward Primer和PCR Reverse Primer各0.8 μL，cDNA 模板，2.0 μL；DEPC無酶水，6.0 μL；ROX Reference Dye II(50X)，0.4 μL；TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)，10.0 μL，反應(yīng)體系總共20.0 μL；運用實驗室所配備儀器Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System設(shè)置條件進行擴增基因：①第一步進行預(yù)變性：95 ℃反應(yīng)30 s，1個循環(huán)；②PCR反應(yīng)：95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)34 s(當進行miRNA擴增時設(shè)置為31 s)，一共40個循環(huán)；③95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)1 min，95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)15 s，1個循環(huán)。運用2-△△CT法統(tǒng)計分析AR小鼠與對照組小鼠鼻黏膜的IL-14基因表達量，此次實驗所用引物，見表2。

表2 PCR所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學觀察 最后一次激發(fā)后雙盲法觀察記錄30 min內(nèi)小鼠抓鼻、打噴嚏次數(shù)，AR組小鼠和對照組小鼠體重無明顯差異(P>0.05)，故體重對實驗指標無明顯影響，兩組間有可比性；抓鼻次數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，打噴嚏次數(shù)差異亦有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，見表3。

表3 各組小鼠體重及行為學表現(xiàn)比較

2.2 小鼠鼻部組織病理切片 對照組鼻黏膜上皮細胞及纖毛完整，排列整齊，纖毛有節(jié)律的擺動有助于分泌物順利排出，杯狀細胞分泌黏液保持鼻黏膜濕度，鏡下可見少許嗜酸性粒細胞浸潤，見圖1A。AR組由于過敏原的長期反復(fù)刺激，鼻黏膜發(fā)生慢性病變，鼻黏膜上皮細胞的微觀結(jié)構(gòu)紊亂，柱狀細胞參差不齊，纖毛結(jié)構(gòu)缺損紊亂，并且鏡下可見大量紫紅色的嗜酸性粒細胞浸潤，見圖1B、圖1C。

圖1A：對照組小鼠鼻黏膜病理切片，可見少量嗜酸性粒細胞浸潤，纖毛完整，排列整齊；圖1B、圖1C：實驗組小鼠鼻黏膜切片可見大量嗜酸性粒細胞浸潤，纖毛結(jié)構(gòu)紊亂、缺損，上皮細胞參差不齊。

2.3 小鼠血清IgE和IL-14濃度 根據(jù)血清IgE和IL-14濃度，計算得出每個樣本濃度，利用SPSS 25.0進行正態(tài)分布檢驗，得出該數(shù)據(jù)酶標儀檢測每個樣本OD450吸光符合正態(tài)分布，行獨立樣本t檢驗統(tǒng)計學分析得出AR組血清的IgE平均濃度較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.024)，如圖2A所示；AR組血清的IL-14濃度亦較對照組升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.029)，如圖2B所示。

*P<0.05。

2.4 小鼠鼻黏膜IL-14表達量 利用2-ΔΔCT(Livak)公式計算得出兩組小鼠鼻黏膜中IL-14的相對表達量，可以得出AR組相比對照組小鼠鼻黏膜的IL-14基因表達量明顯升高， 并且兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.015)，如圖3所示。

*P<0.05。

3 討論

AR是以鼻癢、噴嚏、水樣涕及鼻塞等臨床癥狀為主的一種鼻部慢性炎癥[12]。隨著化工業(yè)的飛速發(fā)展和人們生活習慣的改變，免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年增加[13]，AR的發(fā)病率也呈逐年增長趨勢[14]，已經(jīng)成為全球性的公共健康問題，嚴重影響患者的生活、工作和學習，不僅增加家庭負擔，同時加重醫(yī)療資源的損耗[15]，兒童的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，是AR的高發(fā)群體[16]。

AR的發(fā)病主要與遺傳和環(huán)境密切相關(guān)。在免疫性疾病中起重要作用的是表觀遺傳學[17-18]，是指在不改變基因序列的堿基數(shù)量及排序的前提下，由環(huán)境因素影響后可使相關(guān)的表型遺傳至下一代[15]，再者，AR本身就是與環(huán)境密切相關(guān)的疾病，使得環(huán)境與表觀遺傳學因素相互促進疾病的發(fā)展[18-20]。作為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的典型代表的AR，主要以CD4+T細胞中的Th1、Th2 、Th17和Treg亞群為主發(fā)生免疫應(yīng)答[7，21]，以及IL-2和IFN-γ等典型的Th1類細胞因子[22]，代表性的Th2 類細胞因子IL-4、IL-5和IL-13等[8，23]。同時AR還激活B型淋巴細胞為漿細胞，然后合成并釋放IgE[16]。

IL-14是一種主要由活化的T淋巴細胞、濾泡樹突狀細胞(follicular dendritic cells，F(xiàn)DC)和一些惡性B淋巴瘤細胞產(chǎn)生，對活化的B淋巴細胞有刺激作用的細胞因子[24]，IL-14是由IL-14基因正向鏈上的3～10外顯子編碼的細胞因子[10]。有研究者認為IL-14可以選擇性地作用于記憶B細胞來增強免疫記憶，通過將低親和力自身反應(yīng)性轉(zhuǎn)化為高親和力記憶B細胞來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[25]，有轉(zhuǎn)基因小鼠實驗和臨床實驗發(fā)現(xiàn)IL-14在促進抗體產(chǎn)生、B細胞生長和存活以及B細胞記憶中起著重要作用[26]。近年來，大量動物實驗和臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)IL-14是一種與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、伯基特淋巴瘤以及原發(fā)性干燥綜合征等自身免疫病和腫瘤疾病的特異性抗體聯(lián)系緊密的細胞因子[27]。也有研究發(fā)現(xiàn)IL-14可以誘導(dǎo)IFN-α的產(chǎn)生，而不是IFN-γ，而IFN-α屬于Ⅰ型干擾素，主要參與機體抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)過程，而IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素，IFN-γ可誘導(dǎo)病毒感染的細胞表達病毒抗原，增加免疫系統(tǒng)識別和殺傷感染細胞的能力，還可作為免疫佐劑參與機體的免疫反應(yīng)，其抗病毒作用弱于Ⅰ型干擾素[28]，IFN-α在過敏性疾病、狼瘡性腎炎以及肝炎等感染性疾病中，過敏性紫癜以及IFN-α過敏患者進行抗過敏治療后癥狀及IgE、IL-4、IFN-α均有下降，IL-2升高[29-30]，由此推斷IL-14可能通過T淋巴細胞分泌，調(diào)節(jié)B淋巴細胞活性，同時可以誘導(dǎo)IFN-α生成，對免疫系統(tǒng)疾病發(fā)揮調(diào)節(jié)和影響。

本研究認為IL-14發(fā)揮著聯(lián)系T淋巴細胞和B淋巴細胞之間的橋梁作用，并且還可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素IFN-α的生成，參與機體免疫系統(tǒng)的反應(yīng)與調(diào)節(jié)，而AR就是一種與天然免疫和獲得性免疫均相關(guān)的免疫系統(tǒng)疾病。本研究通過建立BALB/c小鼠AR動物實驗來探究IL-14在AR中的變化趨勢，通過觀察小鼠抓鼻和噴嚏的行為學改變發(fā)現(xiàn)，AR組的過敏癥狀更加明顯，同時，AR組的鼻黏膜組織病理學中嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)量和纖毛上皮的破壞較對照組更嚴重。除外這些主觀性的觀察之外，還進行檢測小鼠血清中IgE濃度和IL-14濃度，IgE作為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的特異性免疫球蛋白，在AR組的小鼠血清中濃度顯著高于對照組，AR組小鼠血清的IL-14的濃度相比對照組亦明顯升高，IL-14在血清中的存在形式是蛋白質(zhì)分子，同時在基因水平進行研究，通過擴增小鼠鼻黏膜IL-14發(fā)現(xiàn)，在AR組小鼠的鼻黏膜中IL-14的相對表達量較對照組增加。

因此，可以初步猜測IL-14可能是先由T淋巴細胞合成和分泌，然后IL-14激活B淋巴細胞為漿細胞，漿細胞進行分泌IgE，進而參與AR的發(fā)病過程。本實驗研究初步探討了IL-14在變應(yīng)性鼻炎小鼠中的表達變化，隨著近年來單克隆抗體在基礎(chǔ)科研和檢驗技術(shù)中的發(fā)展和應(yīng)用[31]，未來可以通過此項技術(shù)進一步探究IL-14在AR等免疫系統(tǒng)疾病中更深層面的作用和機制。