施歌，石亮，王翠艷，白鷺，褚彥飛，史赫，谷鐵軍，劉大維，包小華

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.長(zhǎng)春百克生物科技股份公司吉林 長(zhǎng)春 130062；3.京天成生物技術(shù)（北京）有限公司，北京 100089；4.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；5.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第964 醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130000

手足口?。╤and，foot，mouth disease，HFMD）是近幾十年在全世界特別是亞太地區(qū)廣泛流行的高傳染性疾病。在我國(guó)HFMD 主要由腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）及柯薩奇病毒A 組16 型（coxsackie virus，CVA16）感染引發(fā)，其中EV71 屬于小核糖核酸病毒科腸病毒屬的一類微小單鏈病毒［1］，該病毒可通過日常接觸傳播，5 歲以下嬰幼兒及學(xué)前兒童極易感染。EV71 感染有不同的臨床表現(xiàn)，部分人可呈隱性感染［2-3］。接種疫苗是預(yù)防EV71 感染的有效手段，目前我國(guó)已有EV71 滅活疫苗上市，但無(wú)EV71 病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）疫苗上市。VLP 與天然病毒有類似結(jié)構(gòu)但不含病毒遺傳信息，具備獨(dú)特的安全性、免疫原性及可被精準(zhǔn)修飾等優(yōu)勢(shì)，因此被用于研制多種疫苗［4-7］，如乙型肝炎病毒VLP 疫苗及人乳頭瘤病毒VLP 疫苗已成功上市，EV71 VLP 疫苗也已成為研究熱點(diǎn)，并初步具備了進(jìn)行臨床研究的條件［7-8］。

ELISA 法是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)免疫學(xué)指標(biāo)最常用的方法，也是疫苗抗原含量檢測(cè)的重要手段，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，且成本低、環(huán)保等其他優(yōu)勢(shì)［9］。本研究參考其他疫苗使用ELISA方法檢測(cè)抗原含量的經(jīng)驗(yàn)［10-12］，通過免疫日本大耳白兔制備抗EV71 VLP 多克隆抗體，并對(duì)多克隆抗體包被濃度和酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，初步建立了檢測(cè)EV71 VLP 抗原含量的雙抗體夾心ELISA法，并且為確保已建立的檢測(cè)方法適用于EV71 VLP疫苗抗原的質(zhì)量控制，對(duì)方法的準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍和定量限進(jìn)行了驗(yàn)證［13-14］，以期為EV71 VLP疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)日本大耳白兔2 只，雌性，100 ~ 110 日齡，體重2.0 ~ 2.3 kg，購(gòu)自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0006。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的進(jìn)行白兔的養(yǎng)殖和使用，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（GB ／ T 35892-2018）。

1.2主要試劑及儀器 EV71 VLP（0.4 mg ／ mL）由長(zhǎng)春百克生物科技股份公司制備；EV71 抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（1 600 U ／ mL，批號(hào)：20101701）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research 公司；抗EV71 P1 HRP 標(biāo)記抗體由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院艾滋病國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室提供；底物A 液、B 液購(gòu)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司；Protein A 親和層析柱購(gòu)自江蘇金斯瑞生物科技有限公司。

1.3EV71 VLP 兔多克隆抗體的制備

1.3.1動(dòng)物免疫 按照京天成生物技術(shù)（北京）有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫程序，以EV71 VLP 作為免疫原，背部皮下免疫日本大耳白兔，6 mL ／ 只，1 周后采用相同方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫3 次，末次免疫1 周后心臟采血。

1.3.2兔血清抗體效價(jià)檢測(cè) 用EV71 VLP 包被酶標(biāo)板（1 μg ／ mL），100 μL ／ 孔，4 ℃過夜；PBS 洗板3 次，加入5% milk-PBS，200 μL ／ 孔，室溫封閉1 h；PBS 洗板1 次，加入兔血清（用5% milk-PBS 按1 ∶1 000、1 ∶5 000、1 ∶10 000、1 ∶50 000、1 ∶100 000 稀釋），100 μL ／ 孔，室溫反應(yīng)1 h；PBS 洗板3 次，拍干，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（1 ∶2 000 稀釋），100 μL ／ 孔，室溫反應(yīng)1 h；PBS 洗板5 次，拍干，加入底物液（底物A 液和B 液等體積混勻），100 μL／孔，室溫避光反應(yīng)20 min；加入終止液，50 μL ／ 孔，混勻，上酶標(biāo)儀，讀取A450值。

1.3.3純化抗體效價(jià)的檢測(cè) 采用Protein A 親和層析純化。取1 mL 偶聯(lián)A 蛋白的柱料加至空柱中，PBS 洗滌后，將1 mL 血清用9 mL PBS 稀釋后上柱，然后將收集的流過液重新上柱1 次；用pH 2.7 的甘氨酸洗脫液洗脫，每1 mL 洗脫液收集1 管；用pH 1.9的甘氨酸洗脫液洗脫，每1 mL 洗脫液收集1 管。上酶標(biāo)儀，讀取A280值，將A280值高于0.5 的洗脫液混合后再重新測(cè)定混合液的A280值，按照1.4 的系數(shù)［15］計(jì)算抗體濃度［A280／ 1.4（mg ／ mL）］。將抗體濃度分別稀釋至1、0.5、0.05、0.005 和0.000 5 μg ／ mL后，按1.3.2 項(xiàng)方法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。

1.4方法的建立

1.4.1純化多克隆抗體的篩選 將10 μg ／ mL 多克隆抗體包被酶標(biāo)板，100 μL ／ 孔，4 ℃反應(yīng)16 h；甩干，1 × PBS 洗滌3 次，加入封閉液，200 μL ／ 孔，室溫反應(yīng)1 h；拍干，分別加入EV71 抗原樣品（1 000、100、1 ng ／ mL）及抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（1 ∶10、1 ∶40、1 ∶160 稀釋），100 μL ／ 孔，37 ℃反應(yīng)1 h；1 × PBS洗滌3 次，拍干，加入酶標(biāo)抗體（1 ∶2 000 稀釋），100 μL ／ 孔，37 ℃反應(yīng)1 h；1 × PBS 洗滌3 次，拍干，分別加入底物A 液和B 液，各50 μL ／ 孔，室溫避光反應(yīng)10 min；加入終止液，50 μL ／ 孔，上酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。

1.4.2包被濃度與酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的篩選 用多克隆抗體包被酶標(biāo)板，包被濃度分別為5 和10 μg／mL，酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為1 ∶4 000 和1 ∶10 000，采用方陣滴定法交叉檢測(cè)不同濃度EV71 抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品及EV71 VLP［12］，確定多克隆抗體包被濃度及酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)。

1.5方法的驗(yàn)證

1.5.1線性范圍 將EV71 抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至16、8、4、2、1、0.5、0.25 U ／ mL，用建立的方法檢測(cè)A450值，以抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，扣除空白背景的A450值的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，選取5點(diǎn)以LogX- LogY擬合方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2準(zhǔn)確度 用建立的方法檢測(cè)不同濃度（16、8、4、2 U ／ mL）EV71 抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，讀取A450值，以測(cè)定值和理論值的比值計(jì)算回收率。

1.5.3定量限 將EV71 VLP 稀釋至濃度范圍為0.5 ～65 ng ／ mL，以PBS 溶液作為陰性對(duì)照，用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。以陰性對(duì)照A450值的2.1 倍確定方法的定量限。

1.5.4精密度 選擇3 個(gè)濃度（31.250、15.625、7.813 ng ／ mL）的EV71 VLP，用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度檢測(cè)3 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié) 果

2.1兔血清抗體效價(jià) 初次免疫后第30 天血清樣品效價(jià)檢測(cè)結(jié)果見表1，1 和2 號(hào)兔血清中識(shí)別EV71 抗原的抗體效價(jià)超過1 ∶100 000，A450值＞陰性對(duì)照值的2.1 倍。

表1 初次免疫后第30 天兔血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（A450）Tab.1 Serum antibody titer of rabbits on day 30 after primary immunization（A450）

2.2純化抗體效價(jià) 純化后1 和2 號(hào)兔多克隆抗體濃度分別為1.96 和2.18 mg ／ mL。稀釋后多克隆抗體ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，1 和2 號(hào)兔多克隆抗體在0.005 μg ／ mL 濃度下，A280值＞陰性對(duì)照值的2.1 倍，表明獲得的多克隆抗體已達(dá)到相應(yīng)濃度，見表2。

表2 純化抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（A280）Tab.2 Titer of purified antibody（A280）

2.3純化多克隆抗體的篩選 不同梯度抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品及EV71 抗原樣品測(cè)得的A450值呈良好的梯度關(guān)系，2 號(hào)兔多克隆抗體空白A450值更低，優(yōu)于1 號(hào)兔多克隆抗體，見表3。

表3 不同純化抗體對(duì)不同抗原測(cè)試結(jié)果（A450）Tab.3 Test results of different purified antibodies against different antigens（A450）

2.4最佳包被濃度、酶標(biāo)抗體濃度及方法建立 包被濃度5 μg ／ mL、酶標(biāo)抗體濃度1 ∶10 000 稀釋條件下，測(cè)定EV71 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、EV71 VLP 的A450值，結(jié)果顯示本方法具有良好的陽(yáng)性反應(yīng)吸收值及線性規(guī)律，為最佳工作參數(shù)，見表4 和表5。建立的方法為：5 μg ／ mL 抗EV71 多克隆抗體包被酶標(biāo)板，100 μL ／ 孔，4 ℃反應(yīng)過夜；甩干，1 × PBS 洗滌3 次，加入封閉液，200 μL ／ 孔，室溫反應(yīng)1 h；拍干，加入不同濃度國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品及稀釋后待測(cè)樣品，100 μL／孔，37 ℃反應(yīng)1 h；1 × PBS 洗滌3 次，拍干，加入1 ∶10 000 稀釋的酶標(biāo)抗體，100 μL ／ 孔，37 ℃反應(yīng)1 h；1 × PBS 洗滌3 次，拍干，加入底物A 液和B 液，各50 μL／孔，暗處反應(yīng)10 min；加入終止液，50 μL／孔，于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A值。采用LogX- LogY擬合方式進(jìn)行線性擬合。

表4 EV71 抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品交叉測(cè)試結(jié)果（A450）Tab.4 Cross test results of national standard for EV71 antigen（A450）

表5 EV71 VLP 交叉測(cè)試結(jié)果（A450）Tab.5 Cross test results of EV71 VLP（A450）

2.5方法驗(yàn)證

2.5.1線性范圍 抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.5 ～8 U／mL范圍內(nèi)，其對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)的A450值對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，Y= 1.063 2X- 1.106，R2= 0.992 7，見圖1。

圖1 EV71 抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線Fig.1 Reaction curve of national standard for EV71 antigen

2.5.2準(zhǔn)確度 不同濃度EV71 VLP 檢測(cè)結(jié)果的回收率為81% ～106%，符合《中國(guó)藥典》三部（2020版）規(guī)定的70% ～125%，見表6。

表6 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果Tab.6 Validation for accuracy

2.5.3定量限 EV71 VLP 抗原含量在0.5 ～65 ng ／ mL（0.507、1.015、2.03、4.06、8.12、16.25、32.5 和65 ng ／ mL）范圍內(nèi)的A450值分別為0.176、0.205、0.363、0.665、1.092、1.718、1.941 和2.985，空白對(duì)照A450值為0.107，確定定量限為2 ng ／ mL。

2.5.4精密度 3 個(gè)濃度（31.250、15.625、7.813ng／mL）EV71 VLP 檢測(cè)結(jié)果的RSD分別為5.76%、12.04%和4.96%，見表7。

表7 精密度驗(yàn)證結(jié)果Tab.7 Validation for precision

3 討 論

ELISA 法已經(jīng)在EV71 滅活疫苗抗原檢測(cè)中得到應(yīng)用［16］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫日本大耳白兔，制備了抗EV71 VLP 多克隆抗體，結(jié)果顯示，抗EV71 VLP多克隆抗體能夠特異性識(shí)別抗原標(biāo)準(zhǔn)品及EV71 VLP，可用于雙抗體夾心ELISA 法的研發(fā)，經(jīng)多克隆抗體包被、抗原結(jié)合，顯色后讀取A450值，經(jīng)計(jì)算獲得檢測(cè)結(jié)果。由于多克隆抗體可能同時(shí)結(jié)合同一抗原不同結(jié)合位點(diǎn)，不同批次抗原的位點(diǎn)構(gòu)象可能會(huì)存在差異，對(duì)酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合能力的影響，尚有待進(jìn)一步考察。

本實(shí)驗(yàn)還考察了建立方法的適用性，方法驗(yàn)證的目的是證明檢驗(yàn)方法適合于相應(yīng)的檢測(cè)要求［17］，經(jīng)驗(yàn)證，建立的方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍及定量限。根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）分析方法驗(yàn)證指南，重復(fù)性測(cè)試的可接受標(biāo)準(zhǔn)為RSD應(yīng)不高于25%［18］，本方法精密度驗(yàn)證RSD在15%以下，且受被檢測(cè)樣品濃度的影響。因此，不同濃度樣品的檢測(cè)精密度可能會(huì)存在差異，針對(duì)實(shí)際生產(chǎn)過程中的樣品需在不同稀釋度下進(jìn)行測(cè)試及分析。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了雙抗體夾心ELISA 法，可用于EV71 VLP 疫苗抗原含量檢測(cè)，該方法準(zhǔn)確度高，精密度良好，可為EV71 VLP 疫苗研制中的質(zhì)量控制過程提供選擇。