◎ 劉 于，賀 亮，謝 娜，李 琴，王衍彬，程俊文，趙建誠，陳永健

（1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.國家林業(yè)局竹筍工程技術(shù)研究中心，浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省竹類研究重點實驗室，浙江 杭州 310023；3.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 湖州 313399）

雷竹是禾本科剛竹屬早竹的栽培種。其主要分布于中國浙江。雷竹的竹筍味道特別鮮美，并且筍期較早，持續(xù)時間久，因此產(chǎn)量很高,是相當(dāng)好的筍用竹種。然而，雷竹筍作為一個全綠色純天然的食物，其蛋白質(zhì)和膳食纖維的含量都很高，同時糖類和脂類含量也非常低，還富含各種身體所需要的氨基酸和微量礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，因此受到廣大消費者的喜愛。此外，雷竹筍也有著漫長的食用史，它只是人們餐桌上的一個家常菜品[1-3]。竹筍殼作為竹筍食用后的剩余物，也多作為動物飼料，但大部分已被拋棄，無法反映其實用價值。但科學(xué)研究表明雷竹筍外殼中還存在著一定的生物活性成分，其中還含有黃酮、多糖、黃酮、甾醇和酚類等，通過開發(fā)或再利用雷竹筍殼資源，并提取其中的多糖化合物，不但能夠達(dá)到資源的高度開發(fā)利用，同時在醫(yī)學(xué)研發(fā)等方面也有著巨大的發(fā)展前景。目前，最常見的多糖萃取方式有熱水浸泡提法[4]、酸提法以及堿提法[5]等，其中酸提法以及堿提法對實驗設(shè)備的要求比較高，并且容易引起多糖結(jié)構(gòu)的改變。超聲輔助法有助于減少提取時間，并且適應(yīng)性廣泛、運行成本低。此外，超聲輔助法提取的藥液中含有的無效雜質(zhì)比較少，并且提取出的有效成分易于精制。酶解法具有專一性強(qiáng)、高效性的特點，可以催化雷竹筍中纖維素的分解[6]。將超聲與酶法結(jié)合提取雷竹筍殼多糖，可以使雷竹多糖溶出的效果更佳，并且可提高雷竹多糖獲取率[7]。

到目前為止，還未有將超聲與酶法結(jié)合提取雷竹筍殼多糖的相關(guān)文獻(xiàn)。本文將采用響應(yīng)面優(yōu)化法對超聲與酶法結(jié)合提取雷竹筍殼多糖的工藝進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化，來確定其最佳的工藝流程，并對其提取出的雷竹筍殼多糖進(jìn)行體外抗氧化活性的研究，為能夠最大限度地對雷竹筍殼的再加工和綜合利用提供理論支撐以及技術(shù)支持[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酚類、單糖標(biāo)品、葡萄糖刺激標(biāo)品、95%乙醇和濃硫酸等試劑（分析純），成都科龍化學(xué)品公司；水楊酸、過氧化氫和硫酸亞鐵，成都審計意見化學(xué)試劑廠；維生素C、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海阿拉丁生物科技股份有限公司；果膠酶、纖維素酶和蛋白質(zhì)酶，憶諾聯(lián)創(chuàng)生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海一科儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZLS-3型真空離心濃縮儀，湖南赫西儀器裝備有限公司；CL31R型多功能高速離心機(jī)，美國Thermo公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵，鞏義市予劃科技有限公司；FA二千零四型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司；LT-DBX60N型精密可程序化電烤箱，立德泰勒科學(xué)儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雷竹筍殼預(yù)處理

用水沖洗雷竹筍殼使其潔凈后，放在55 ℃的烘箱中烘干，干燥之后打粉，過80目篩，備用[11]。

1.3.2 雷竹筍殼多糖的提取

取一定量的雷竹筍殼粉末，按料液比1∶30（g∶mL）加入蒸餾水，調(diào)pH至4.5，加蛋白質(zhì)酶∶纖維素酶∶果膠酶=1∶1∶1，在一定的溫度和超聲頻率中酶解一段時間，然后將得到的浸提液置于沸水浴中15 min，使酶失活，再將浸提液進(jìn)行抽濾后，將所得濾液混合，在60 ℃下減壓濃縮至1/3體積，加入4倍體積的95%乙醇，然后醇沉24 h，在5 000 r·min-1下離心10 min，收集沉淀，通過冷凍干燥得到雷竹筍殼的粗多糖。

1.3.3 雷竹筍殼多糖得率的測定

標(biāo)準(zhǔn)溶液選取葡萄糖水溶液，將其在490 nm處用紫外-分光光度計測定其吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖水溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.383 9x+0.036 7，R2=0.988 1，該標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系。精確稱2.0 g雷竹筍殼粗多糖到100 mL的容量瓶中，然后滴加蒸餾水至刻度線來定容，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，雷竹筍殼多糖提取率的計算如下：

式中：c為配制多糖溶液濃度，g·L-1；V為粗多糖溶液體積，L；m0為雷竹筍殼質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

在室溫下，探究不同超聲功率、提取時間、復(fù)合酶添加量、料液比以及酶解溫度對雷竹筍殼多糖得率的影響。

（1）超聲功率的確定。精確稱取10 g雷竹筍殼粉，按照物料質(zhì)量的30倍加入蒸餾水，在提取時間105 min，酶添加量2.0%，酶解溫度55 ℃的條件下，分別用100 W、150 W、200 W、250 W和300 W的功率進(jìn)行超聲處理，研究不同超聲功率對雷竹筍殼多糖提取率的影響。

（2）提取時間的確定。精確稱10 g雷竹筍殼粉，按照物料質(zhì)量的30倍加入蒸餾水，在超聲功率為200 W，復(fù)合酶添加量為2.0%，酶解溫度55 ℃的條件下，分別提取45 min、75 min、105 min、135 min和165 min，研究不同提取時間對雷竹筍殼多糖提取效率的影響。

（3）復(fù)合酶添加量的確定。精確稱取10 g的雷竹筍殼粉，按照物料質(zhì)量的30倍加入蒸餾水，在超聲功率200 W，提取時間105 min，酶解溫度55 ℃的條件下，分別添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的復(fù)合酶，研究不同復(fù)合酶添加量對雷竹筍殼多糖提取率的影響。

（4）料液比的確定。精確稱10 g雷竹筍殼粉，在提取時間105 min，超聲功率為200 W，復(fù)合酶添加量為2.0%的條件下，分別在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50（g∶mL）條件下，研究不同料液比對雷竹筍殼多糖提取效率的影響。

（5）酶解溫度的確定。精確稱10 g雷竹筍殼粉，在提取時間105 min，超聲功率為200 W，料液比1∶30，復(fù)合酶添加量為2.0%，酶解溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃的條件下，研究不同酶解溫度對雷竹筍殼多糖提取效率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，見表1。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計因素及水平表

1.4 雷竹筍殼多糖的抗氧化研究

1.4.1 DPPH自由基清除率的測定方法

參考李松昂等[12]的研究，配制出0.1～0.5 mg·mL-1不同濃度的雷竹筍殼多糖溶液，待測，各取1.0 mL雷竹筍殼多糖待測溶液置于試管當(dāng)中，然后添加3.0 mL用95%乙醇溶解的DPPH溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率的計算公式為：

式中：A0為空白樣品溶液的吸光度值；A1為樣品溶液的吸光度值；A2為以蒸餾水代替DPPH的樣品溶液的吸光度值。

1.4.2 羥自由基清除率的測定方法

參考葉兆偉等[13]的方法稍作修改后來測定羥自由基清除率。配制0.1～0.5 mg·mL-1不同濃度的雷竹筍殼多糖待測溶液，將2.0 mL濃度為9.0 mmol·L-1的FeSO4溶液、2.0 mL 濃度為 8.8 mmol·L-1的 H2O2溶液以及2.0 mL濃度為9.0 mmol·L-1的水楊酸乙醇液相繼加入到待測溶液中，搖勻，在室溫下放置30 min，待其穩(wěn)定，通過紫外-分光光度計在510 nm波長條件下測定不同濃度的雷竹筍殼多糖樣品液的吸光度，采用維生素C溶液作為陽性對照液。羥自由基清除率的計算公式為：

式中：A0為空白樣品在510 nm處的吸光度值；Am為樣品溶液在510 nm處的吸光度值；Aj為不加顯色劑H2O2的吸光度值。

1.4.3 還原能力的測定方法

參考李松昂[12]的方法稍加改動。分別精密吸取1 mL提前配好的不同質(zhì)量濃度的雷竹筍殼多糖待測液于5個試管中，加入2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL體積分?jǐn)?shù)為0.01的K3[Fe(CN)6]水溶液，拌勻，放置在50 ℃的恒溫水浴中20 min，然后加2.5 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的TCA，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液2.5 mL，加入同體積的蒸餾水，然后再加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化鐵，在常溫下放置10 min，使其充分反應(yīng)，待溶液的顏色從黃色變?yōu)樗{(lán)色后，在710 nm下測定吸光度，采用維生素C溶液作為陽性對照液。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 超聲波功率的確定

由圖1可知，當(dāng)超聲功率低于200 W時，雷竹筍殼多糖提取率隨著超聲波功率的增加而增大；當(dāng)超聲功率達(dá)到200 W后，多糖提取率開始下降，這可能是超聲波功率在200 W時，多糖趨于最大提取率，多糖幾乎全部溶出，繼續(xù)增大超聲波功率，對多糖提取率沒有明顯的影響。因此，在后續(xù)試驗中選取200 W為適宜的超聲波功率。

2.1.2 提取時間的確定

由圖2可知，當(dāng)提取時間小于105 min時，提取時間越長，提取效率越高；在提取時間達(dá)到105 min以后，雷竹筍殼多糖的提取效率不僅不會因為提取時間的延長而提高，相反發(fā)生了些許的減少，這可能是由于提取時間過長，少部分雷竹筍殼多糖出現(xiàn)了分解現(xiàn)象，使雷竹筍殼多糖提取率不能繼續(xù)增大。因此，雷竹筍殼多糖的最適宜提取時間為105 min。

2.1.3 復(fù)合酶添加量的確定

由圖3可知，多糖提取率隨著復(fù)合酶添加量的增加而逐漸增加；當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到2.0%后，隨著復(fù)合酶添加量的繼續(xù)增加，雷竹筍殼多糖提取率不再明顯增加，這可能因為復(fù)合酶濃度已經(jīng)接近飽和，雷竹筍殼中的多糖幾乎全部溶出，所以多糖提取率不再隨著復(fù)合酶添加量的增加而顯著增加。因此，雷竹筍殼多糖最適宜的復(fù)合酶添加量為2.0%。

2.1.4 料液比的確定

由圖4可知，多糖提取率隨著料液比的增加而逐漸增加；當(dāng)料液比超過1∶30后，多糖提取率略有增加，但不再明顯增加，這可能因為隨著溶液濃差的減少，雷竹筍殼中的多糖較難從細(xì)胞內(nèi)溶出，所以多糖提取率不再顯著增加。因此，考慮后續(xù)擴(kuò)大生產(chǎn)濃縮能耗，雷竹筍殼多糖料液比選擇1∶30。

2.1.5 酶解溫度的確定

由圖5可知，多糖提取率隨著酶解溫度的增加而逐漸增大，當(dāng)酶解溫度為55 ℃時，酶解溫度取得最大值。這說明在一定范圍內(nèi)增大溫度，可以顯著提高纖維素酶和果膠酶等復(fù)合酶水解細(xì)胞壁的效果，有利于內(nèi)容物溶出，從而提高多糖的提取率。但溫度繼續(xù)升高反而降低了酶活力?？紤]到高效使用復(fù)合酶，選擇55 ℃為最優(yōu)的復(fù)合酶酶解溫度。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

通過響應(yīng)面法，考慮單因素對雷竹筍多糖提取率的顯著影響，篩選超聲功率（A）、提取時間（B）和復(fù)合酶添加量（C）3個因素進(jìn)行分析，其試驗方案及數(shù)據(jù)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。通過Design-Expert軟件對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多糖獲得率Y的二次回歸擬合曲線方程為Y=2.33+0.107 5A-0.011 2B+0.033 8C-0.035 0AB-0.020 0AC-0.067 5BC-0.056 3A2-0.078 8B2-0.053 8C2。

表3 各因素回歸方程的方差分析表

由表3可知，該模型概率值P＜0.000 1，說明該模型顯著；失擬項不顯著（P=0.118 3），同時說明其他的外界因素對于試驗基本沒有干擾；由校正決定系數(shù)R2adj=0.972 2，模型的決定系數(shù)R2=0.987 8，得出該試驗的設(shè)計較為合理，98.78%響應(yīng)值的變化可以通過建立的模型進(jìn)行解釋，因此雷竹筍殼多糖得率的實際值和預(yù)測值能夠比較好地擬合，且試驗誤差較小，可以用此模型對超聲輔助酶解法提取雷竹筍殼多糖的最佳條件進(jìn)行分析和預(yù)測[17]。通過F值的大小比較可以得出，各因素對多糖提取效果的影響順序為超聲功率＞復(fù)合酶添加量＞提取時間，并且本次研究所選取的因素范圍內(nèi)，3個因素對雷竹筍殼多糖得率均有明顯的影響。

2.2.2 兩因素交互作用分析

超聲輔助酶解法提取雷竹筍殼多糖試驗中超聲功率、復(fù)合酶添加量和提取時間之間的交互作用對雷竹筍殼多糖提取率的影響結(jié)果如圖6所示。

通常因子間二者交互效應(yīng)的明顯程度可由響應(yīng)面的曲面形狀的陡緩程度和等高線圖的形狀來顯示，當(dāng)因子間交互作用明顯時，曲面較陡且等高線為橢圓形，若曲面圖形中曲面較緩，且等高線趨向于圓形，則說明因子間的交互效應(yīng)不明顯[14,16]。由圖6可知，由因子A和B，B和C相互影響的3D曲面圖中的曲面比較陡，且等高線密集成橢圓形，說明了超聲波功率A與提取時間B、提取時間B與酶添加量C間的交互作用對雷竹筍殼多糖提取率影響很明顯；因素A和C間交互作用的曲面圖中曲面變化較緩，而等高曲線則趨向于長圓形，說明在超聲波功率A和酶添加量C間的交互影響對其多糖提取率并不顯著。以上分析出的結(jié)果與方差分析出的結(jié)果基本一致，說明響應(yīng)面結(jié)果可靠。

2.3 雷竹筍殼多糖最佳提取工藝的確定

通過響應(yīng)面試驗得到雷竹筍殼多糖的最佳提取工藝條件為料液1∶30（g∶mL），超聲波功率210 W，提取時間112 min，復(fù)合酶添加量2.1%，提取溫度55 ℃。在最優(yōu)條件下雷竹筍殼多糖提取率為2.28%。3次重復(fù)試驗后得到的雷竹筍殼多糖的平均提取率為（2.24±1.57）%，達(dá)到了回歸模型預(yù)測提取得率的98.24%，說明試驗結(jié)果與模型擬合良好，響應(yīng)面模型具有一定可行性。

2.4 抗氧化性結(jié)果與分析

2.4.1 DPPH自由基清除率結(jié)果分析

如圖7所示，當(dāng)濃度在0.1～0.5 mg·mL-1，雷竹筍殼多糖對DPPH自由基具有顯著的清除功能，其清除功能隨著濃度的提高而逐步加強(qiáng)。當(dāng)雷竹筍殼多糖溶液濃度高于0.2 mg·mL-1時，雷竹筍殼多糖對DPPH自由基的清除率不再隨著多糖溶液濃度的增加而增大。維生素C陽性對照溶液中對DPPH自由基的清除率明顯高于雷竹筍殼多糖。由此可見，雷竹筍殼多糖溶液對DPPH自由基具有清除能力，表現(xiàn)出較高的抗氧化性。

2.4.2 羥自由基清除率結(jié)果分析

羥自由基（·OH）是一種活性氧，其可以使紅細(xì)胞失活，并且是已知的自由基中毒性最大的一種，及時消除身體中的羥自由基對延緩機(jī)體衰老以及維持身體健康均具有良好的效果[15]。由圖8可知，雷竹筍殼精制多糖可以清除羥自由基并且效果良好，在0.1～0.5 mg·mL-1，多糖質(zhì)量濃度越高，清除羥自由基的作用越強(qiáng)。當(dāng)濃度高于0.3 mg·mL-1時，羥自由基的清除率增加變緩。陽性對照液維生素C對羥自由基的清除率優(yōu)于雷竹筍殼多糖。

2.4.3 還原能力的測定方法

由圖9可知，隨著雷竹筍殼多糖溶液的增加，其吸光度值的變化不顯著，說明雷竹筍殼多糖還原性不高。在相同質(zhì)量濃度條件下，維生素C的吸光度明顯高于雷竹筍殼多糖。

綜合考慮，雷竹筍殼多糖在0.1～0.5 mg·mL-1，具有一定的DPPH和羥自由基清除作用，但總體還原力不強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文選用超聲輔助酶法提取雷竹筍殼多糖，以雷竹筍殼多糖提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗確定其最佳提取條件為超聲功率210 W，酶解時間112 min，復(fù)合酶添加量2.1%，提取溫度55 ℃。在最優(yōu)條件下的雷竹筍殼多糖提取率為（2.24+1.57）%，與預(yù)測值（2.28%）基本上相吻合。雷竹筍殼多糖濃度在0.1～0.5 mg·mL-1，具有一定的DPPH和羥自由基清除作用，但其還原能力相對薄弱且不如維生素C。其消除能力與雷竹筍殼多糖的質(zhì)量濃度有明顯的關(guān)系[17]。本試驗的研究成果將對雷竹筍殼的再加工和綜合利用提出了理論支撐，并具有相應(yīng)的參考價值。