◎ 許陳思菡，沈周媛，袁琢越，路 璐，向延衛(wèi)，丁 越

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

藤茶，學(xué)名顯齒蛇葡萄，由被子植物門(mén)木蘭綱蕓香目葡萄科蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）的嫩莖葉加工而成，盛產(chǎn)于我國(guó)湖北、湖南、江西以及福建等南方各地[1-2]。藤茶性涼，味甘淡，有清熱解毒、消腫利咽、消癰散結(jié)的功效，可用于治療口腔潰瘍、咽喉腫痛、感冒發(fā)熱、濕熱黃疸、目赤腫痛和癰腫瘡癤等癥狀[3]?，F(xiàn)代研究表明藤茶具有較好的抗氧化、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗流感、降血壓、降血脂及保肝等多種保健功效和藥理作用，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的中草藥[4-10]。黃酮類(lèi)化合物是藤茶中最主要的成分，藤茶中的黃酮含量是目前被研究的植物中最高的，因此藤茶又被稱(chēng)為“黃酮之王”[11]。藤茶中總黃酮含量高達(dá)45.52%，其中二氫楊梅素的含量達(dá)藤茶總黃酮含量的58.10%～58.80%[12]。目前，藤茶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)尚處于初級(jí)階段，以茶類(lèi)產(chǎn)品為主，即沖泡型商品。然而藤茶曬干后，其表面的白霜會(huì)導(dǎo)致沖泡后外觀及口感不佳。從藤茶的開(kāi)發(fā)利用來(lái)講，藤茶提取物應(yīng)用到食品中安全健康，具有廣闊前景。本研究采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)藤茶及其提取物中總黃酮含量，并對(duì)藤茶的水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定藤茶提取物及其主要活性成分的抗氧化活性，研究藤茶的抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為藤茶的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶原茶，市售湖南張家界野生特級(jí)藤茶（批號(hào)：20210816）。

1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），購(gòu)自上海鴻永生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度92.6%，供UV檢測(cè)），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；抗壞血酸（維生素C），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.38%，供HPLC測(cè)定）、楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.69%，供HPLC測(cè)定）、檞皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.05%，供HPLC測(cè)定）、橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.60%，供HPLC測(cè)定）和芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.03%，供HPLC測(cè)定），均購(gòu)自上海鴻永生物科技有限公司。乙醇、甲醇、硝酸鋁、氫氧化鈉和亞硝酸鈉均為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JFSD-100-II微型高速粉碎機(jī)，上海嘉定糧油儀器有限公司；YH系列電熱器，500 mL，江蘇近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠(chǎng)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XS105電子天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；UV2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；酶標(biāo)儀，BioTek；SB5200D超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藤茶總黃酮水提工藝研究

（1）提取方法。取50 g藤茶，加入適量的水煎煮，合并幾次水煎液，過(guò)濾。

（2）單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。取50 g藤茶，分別加入不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50（g∶mL）的水煎煮1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h，煎煮1、2、3次，合并水煎液，過(guò)濾，采用直接測(cè)定法測(cè)定藤茶水煎液中藤茶總黃酮的濃度，并計(jì)算總黃酮提取率，考察不同料液比、不同提取時(shí)間、不同提取次數(shù)對(duì)藤茶總黃酮提取率的影響。

（3）水提工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用L9(34)正交試驗(yàn)表，考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40）、提取時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h）和提取次數(shù)（1次、2次、3次）3個(gè)因素，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，分別采用直觀分析和正交分析進(jìn)行水提工藝條件的優(yōu)選，確定最佳水提提取工藝。

1.3.2 藤茶中總黃酮含量測(cè)定方法的建立與比較

（1）二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備精密稱(chēng)定適量二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品，用95%乙醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配成0.499 6 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

（2）樣品溶液制備稱(chēng)取5 g藤茶，10倍量75%乙醇浸泡18 h，超聲1 h，過(guò)濾，取1 mL濾液于50 mL容量瓶中，95%乙醇定容，然后取5 mL于50 mL容量瓶中，95%乙醇稀釋至刻度線(xiàn)，備用。

（3）直接測(cè)定法精密吸取藤茶樣品溶液2.5 mL于25 mL容量瓶中，另取0.5 mL二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于另一個(gè)25 mL容量瓶中，并采用95%乙醇定容，搖勻后靜置10 min，在200～700 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描光譜圖，確定該方法的最適吸收波長(zhǎng)為294 nm。然后分別準(zhǔn)確吸取0.250 mL、0.375 mL、0.500 mL、0.625 mL和0.750 mL二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于5個(gè)不同25 mL容量瓶，95%乙醇定容，搖勻，靜置10 min，在此方法最適吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定藤茶樣品溶液的吸光度并計(jì)算其中藤茶總黃酮的含量。

（4）硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉[Al(NO3)3-NaNO2-NaOH）]比色法（簡(jiǎn)稱(chēng)硝酸鋁法）。精密吸取藤茶樣品溶液1.5 mL于25 mL容量瓶中，另取0.25 mL二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于另一個(gè)25 mL容量瓶中，加入5 mL蒸餾水，搖勻后加入1 mL 5% NaNO2溶液搖勻并靜置6 min，加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻靜置6 min，加入10 mL 10 mol·L-1NaOH溶液，加蒸餾水至刻度線(xiàn)后搖勻靜置15 min，在200～700 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描光譜圖，確定該方法的最適吸收波長(zhǎng)為324 nm。然后分別準(zhǔn)確吸取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL和0.35 mL二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL容量瓶，按上述方法進(jìn)行處理，在此方法最適吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定藤茶樣品溶液的吸光度并計(jì)算其中藤茶總黃酮的含量。

1.3.3 藤茶總黃酮水提物及其主要化合物抗氧化活性評(píng)價(jià)

（1）DPPH溶液的制備。精密稱(chēng)取DPPH試劑適量，加乙醇溶解配制成0.65 mmol·L-1。

（2）樣品溶液的制備。精密稱(chēng)取2.00 mg藤茶提取物，加入乙醇溶液，定容至10 mL，恒溫超聲提取30 min，冷卻至室溫，用50%乙醇逐級(jí)稀釋成系列濃度的樣品溶液。

（3）對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取蘆丁、抗壞血酸、二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素和橙皮素適量，加入二甲基亞砜適量配成20 mmol·L-1母液，用50%乙醇逐級(jí)稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液。

（4）抗氧化活性的測(cè)定。精密量取10 μL樣品提取液和對(duì)照品溶液，分別加入有100 μL DPPH溶液的96孔板中，充分混勻，加入140 μL的50%乙醇，室溫避光反應(yīng)1 h，混勻，在517 nm下測(cè)定吸光度。以加入50%乙醇溶液為空白對(duì)照，各平行3份。并計(jì)算抑制率：

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A0為空白對(duì)照溶液的吸光度。

分別以各樣品溶液濃度和抑制率進(jìn)行線(xiàn)形回歸，并計(jì)算抑制率為50%時(shí)，待測(cè)樣品的濃度值，即半抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別準(zhǔn)確吸取0.250 mL、0.375 mL、0.500 mL、0.625 mL和0.750 mL二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL容量瓶，95%乙醇定容，搖勻，靜置10 min，在最適吸收波長(zhǎng)處（294 nm）測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）對(duì)各對(duì)照品濃度（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

分別準(zhǔn)確吸取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL和0.35 mL二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL容量瓶，加入5 mL蒸餾水，搖勻后加入1 mL 5% NaNO2溶液搖勻并靜置6 min，加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻靜置6 min，加入10 mL 10 mol·L-1NaOH溶液，加蒸餾水至刻度線(xiàn)后搖勻靜置15 min，在最適吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（324 nm），以吸光度（Y）對(duì)各對(duì)照品濃度（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)方法的線(xiàn)性關(guān)系。

直接測(cè)定法和硝酸鋁法的線(xiàn)性關(guān)系見(jiàn)表1，以二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的系列濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別得到兩種方法相應(yīng)的線(xiàn)性回歸方程。直接測(cè)定法在線(xiàn)性范圍為4.996 ～ 14.988 μg·mL-1時(shí)，R2為 0.999 3，線(xiàn)性關(guān)系較好；硝酸鋁法在線(xiàn)性范圍為2.998～6.994 μg·mL-1時(shí)，R2為0.999 7，線(xiàn)性關(guān)系較好。

表1 兩種測(cè)定方法的線(xiàn)性關(guān)系表

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確移取上述藤茶樣品溶液2.5 mL和1.5 mL，分別按照1.3.2項(xiàng)下2種方法進(jìn)行處理，然后在各方法的最大吸收波長(zhǎng)處（294 nm和324 nm），在2 min內(nèi)對(duì)同一樣品溶液連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算測(cè)定吸光度的平均值和RSD值。直接測(cè)定法和硝酸鋁法測(cè)定藤茶樣品溶液總黃酮的精密度實(shí)驗(yàn)中，RSD值分別為1.4%和1.8%，均小于3%，說(shuō)明采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總黃酮精密度較好。

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別按照1.3.2項(xiàng)下2種方法處理藤茶樣品溶液各5份，然后測(cè)定各藤茶樣品中總黃酮的含量，并計(jì)算其平均值和RSD值。結(jié)果表明，直接測(cè)定法和硝酸鋁法測(cè)定藤茶樣品溶液中總黃酮的含量分別為0.069 mg·mL-1和 0.083 1 mg·mL-1，RSD 值分別為 2.1%和2.4%，均小于5%，在誤差允許范圍內(nèi)，說(shuō)明采用上述兩種方法測(cè)定藤茶提取液中總黃酮的含量，均有較好的重復(fù)性。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確移取藤茶樣品溶液2.5 mL和1.5 mL，分別按照1.3.2項(xiàng)下2種總黃酮含量測(cè)定方法進(jìn)行處理，然后在 0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h和4.0 h時(shí)，在各方法最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定一次吸光值，共測(cè)定9次，計(jì)算各方法測(cè)定吸光度的平均值和RSD值。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，直接測(cè)定法在4 h內(nèi)的穩(wěn)定性最好，RSD值僅為1.3%，硝酸鋁法在4 h內(nèi)的穩(wěn)定性最差，RSD值為7.8%，而在1.0 h內(nèi)的RSD值為2.1%，說(shuō)明硝酸鋁法在1.0 h內(nèi)基本穩(wěn)定。由此可見(jiàn)，直接測(cè)定法建立的總黃酮測(cè)定方法穩(wěn)定性更好。

2.1.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確移取藤茶樣品溶液1.25 mL和0.75 mL各9份藤茶樣品溶液，按照80%、100%和120%比例分別加入一定量的二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，分別按照1.3.2項(xiàng)下2種總黃酮含量測(cè)定方法進(jìn)行處理，分別在上述方法中最大吸收波長(zhǎng)處（294 nm和324 nm）測(cè)定藤茶樣品溶液的吸光值，并計(jì)算其加樣回收率和RSD值。結(jié)果表明，采用直接測(cè)定法測(cè)定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為100.5%，RSD為4.2%（表2）；采用硝酸鋁顯色法測(cè)定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為102.8%，RSD為6.2%（表3），兩種方法中硝酸鋁顯色法測(cè)定誤差較大。結(jié)合方法學(xué)考察結(jié)果，最終選擇直接測(cè)定法測(cè)定樣品中總黃酮的含量。

表2 直接測(cè)定法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 硝酸鋁法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2 藤茶總黃酮水提工藝研究

2.2.1 提取溶劑量的初步考察

取50 g藤茶，分別加入不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50）的水煎煮2 h，煎煮2次，合并水煎液，過(guò)濾，采用直接測(cè)定法測(cè)定藤茶水煎液中藤茶總黃酮的濃度，并計(jì)算總黃酮提取率。

由圖1可知，隨著提取液加入量的增加，藤茶總黃酮提取率先上升后逐漸下降，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高。繼續(xù)增加提取液用量，總黃酮提取率不再升高，考慮到提取液增多，使得濃縮時(shí)間變長(zhǎng)，降低了提取效率。綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益，提取料液比選擇1∶40最佳。

2.2.2 提取時(shí)間的初步考察

實(shí)驗(yàn)考察不同提取時(shí)間（1 h、1.5 h、2 h和2.5 h）對(duì)藤茶總黃酮提取效率的影響。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮提取率先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，總黃酮提取率最高。綜合考慮，初步確定提取時(shí)間為2 h。

2.2.3 提取次數(shù)的考察

實(shí)驗(yàn)考察不同提取次數(shù)（1次、2次、3次）對(duì)藤茶總黃酮提取效率的影響。由圖3可知，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮提取率先升高后降低，提取次數(shù)為2次時(shí)，總黃酮提取率最高。綜合考慮，初步確定提取次數(shù)為2次。

2.2.4 水提工藝正交試驗(yàn)及方差分析

采用L9(34)正交試驗(yàn)表，考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40）、提取時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h）和提取次數(shù)（1次、2次、3次）3個(gè)因素，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行水提工藝條件的優(yōu)選，確定最佳水提提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

由表4可知，在不考慮交互作用的情況下，影響水提工藝的因素主次順序?yàn)榱弦罕龋咎崛r(shí)間＞提取次數(shù)。由表5可知，料液比對(duì)總黃酮提取率有顯著性影響，而提取時(shí)間、提取次數(shù)在考察范圍內(nèi)影響不顯著。因此，藤茶總黃酮提取的最佳工藝條件為A3B3C2，即選用料液比1∶40，提取2 h，提取2次。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表5 正交試驗(yàn)方差分析表

2.2.5 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表6可知，按照最佳提取溶液開(kāi)展驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次實(shí)驗(yàn)藤茶總黃酮提取率分別為62.61%、62.40%和61.66%，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.3 測(cè)定結(jié)果

由表7可知，藤茶水提物對(duì)DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱與黃酮含量呈正相關(guān)性，表明藤茶提取物中黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性占主導(dǎo)地位。藤茶總黃酮水提物IC50=0.176 mg·mL-1，總黃酮DPPH自由基清除能力略低于維生素C（IC50=0.147 mg·mL-1），高于蘆?。↖C50=0.192 mg·mL-1）。藤茶中主要的4種黃酮類(lèi)單體化合物均有較強(qiáng)的清除作用，對(duì)DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)。對(duì)DPPH自由基清除能力為楊梅素＞槲皮素＞二氫楊梅素＞維生素C＞橙皮素。

表7 藤茶總黃酮提取物和主要黃酮類(lèi)單體化合物抗氧化活性結(jié)果表

3 結(jié)論

本文以二氫楊梅素為對(duì)照品，選用直接測(cè)定法和硝酸鋁法對(duì)藤茶中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明兩種測(cè)定方法相對(duì)應(yīng)的最適吸收波長(zhǎng)分別為294 nm和324 nm。在該波長(zhǎng)下，直接測(cè)定法和硝酸鋁法測(cè)定藤茶總黃酮，在 4.996 ～ 14.988 μg·mL-1和 2.998 ～ 6.994 μg·mL-1線(xiàn)性關(guān)系良好；精密度、重復(fù)性良好；穩(wěn)定性結(jié)果表明，直接測(cè)定法在4 h內(nèi)的穩(wěn)定性最好，硝酸鋁法在1.0 h內(nèi)基本穩(wěn)定，4 h內(nèi)的穩(wěn)定性較差。同時(shí)，加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用硝酸鋁顯色法測(cè)定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為102.8%，RSD為6.2%，兩種方法中硝酸鋁顯色法測(cè)定誤差較大，最終選擇直接測(cè)定法測(cè)定藤茶中總黃酮的含量。

藤茶總黃酮是藤茶中主要活性成分，采用水提法制備藤茶總黃酮，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝為料液比1∶40，提取2 h，提取2次。3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)表明，所制備藤茶水提物中總黃酮提取率分別為62.61%、62.40%和61.66%，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行。運(yùn)用DPPH法對(duì)藤茶水提物及其黃酮類(lèi)單體成分的自由基清除能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，藤茶水提物對(duì)DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱與黃酮含量大小呈正相關(guān)性，對(duì)DPPH自由基清除能力略高于蘆丁。藤茶中主要的4種黃酮類(lèi)單體化合物均有較強(qiáng)的清除作用，對(duì)DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基清除能力為楊梅素＞槲皮素＞二氫楊梅素＞維生素C＞橙皮素，其中楊梅素、二氫楊梅素和槲皮素可能是藤茶抗氧化的主要化學(xué)成分。

藤茶作為一種保健茶，在民間飲用歷史可上溯到神農(nóng)嘗百草時(shí)期。我國(guó)最早的詩(shī)歌總集《詩(shī)經(jīng)》稱(chēng)之為古茶勾藤。它不僅是一種純天然的綠色飲料，更是一種藥效保健性能很強(qiáng)的茶中奇葩。藤茶素有“黃酮之王”的稱(chēng)號(hào)，本文通過(guò)提取工藝優(yōu)化，可以使藤茶總黃酮提取率達(dá)到60%以上，同時(shí)藤茶提取物可以迅速溶解到溶液中，服用后發(fā)揮抗氧化、抗炎的功效。藤茶提取物對(duì)DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱與黃酮含量大小呈正相關(guān)性。目前已證實(shí)自由基氧化損傷與衰老及多種疾病相關(guān)，當(dāng)體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或/和清除過(guò)少時(shí)都會(huì)打破人體內(nèi)自由基平衡，使多余的自由基攻擊人體內(nèi)的生物膜，造成體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、酶等生物大分子的氧化損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整，從而影響人體正常新陳代謝、產(chǎn)生疾病[13]。因此，藤茶作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的藥用原料，具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。