魏林生，郭園園，章亞芳，趙曉陽(yáng)，陸向東，陳金城，吳仁芽

(1.南昌大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，江西 南昌 330031；2.上海烯峰科技有限公司，上海 201712；3.江西銀麗直飲水設(shè)備有限公司，江西 新余 338004)

自然界中的有害微生物嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康。細(xì)菌對(duì)人類(lèi)的危害促使著我們?cè)诂F(xiàn)有抗菌劑的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出新興的、復(fù)合型的高效抗菌劑勢(shì)在必行[1-4]。而自從石墨烯(graphene oxide，GO)的抗菌作用被報(bào)道以來(lái)，石墨烯類(lèi)材料因其特殊的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)而得到了廣大學(xué)者的關(guān)注[5-7]。石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots,GQDs)作為石墨烯的衍生物，具有比石墨烯更大的比表面積[8-9]，而這種優(yōu)異的結(jié)構(gòu)特性對(duì)細(xì)菌有較好的吸附作用，有利于對(duì)細(xì)菌的捕獲，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，GQDs與微生物獨(dú)特的作用方式使其在抗菌方面的應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景[10-11]。

石墨烯的抗菌能力不僅與表面基團(tuán)以及摻雜質(zhì)存在著直接聯(lián)系[12-13]，還對(duì)尺寸具有一定的依賴(lài)性[14]，不同的方法制備出的不同尺寸的GQDs的吸收峰[15-17]、熒光顏色[18-21]等都不同，其抗菌能力[22-24]也存在著明顯差異。

傳統(tǒng)的石墨烯量子點(diǎn)的制備過(guò)程復(fù)雜，難以量產(chǎn)，且只有在紫外光下對(duì)光有明顯的吸收，而在可見(jiàn)光下幾乎無(wú)響應(yīng)。本文采用簡(jiǎn)單高效且創(chuàng)新方法——震蕩沖擊法來(lái)制備石墨烯量子點(diǎn)，并對(duì)其光學(xué)特性、光熱效應(yīng)、光動(dòng)力效應(yīng)及抑菌性能進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步推進(jìn)GQDs在殺菌領(lǐng)域的研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋白胨、酵母粉、瓊脂購(gòu)自上海微生物科技有限公司；大腸桿菌購(gòu)自上海保藏生物技術(shù)中心；無(wú)水乙醇、無(wú)菌生理鹽水、鹽酸、氫氧化鈉、PBS、2.5%戊二醛等試劑購(gòu)自沃瑞達(dá)斯有限公司。

1.2 GQDs的合成

采用震蕩沖擊法制備石墨烯量子點(diǎn)：將石墨粉和惰性氣體通過(guò)加料管進(jìn)入第一震蕩沖擊機(jī)腔體內(nèi)，經(jīng)過(guò)腔體和沖擊介子的高效運(yùn)動(dòng)，得到石墨烯量子點(diǎn)半成品；后將半成品和惰性氣體經(jīng)加料管加入第二震蕩沖擊機(jī)腔體內(nèi)繼續(xù)震蕩沖擊，可獲得合格的球形納米石墨烯量子點(diǎn)。

1.3 激光誘導(dǎo)GQDs的光熱轉(zhuǎn)換

稱(chēng)量一定量的GQDs粉末于蒸餾水中超聲，制成質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1的水溶液，取200 μL置于透明的玻璃管中，密封管口，以低功率密度(2 W·cm-2)的808 nm的紅外激光束垂直照射玻璃管中的樣品，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄樣品的溫度，以相同體積的蒸餾水作為對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 菌液和培養(yǎng)基的制備

取1.00 g胰蛋白胨，0.50 g氯化鈉和酵母提取物，溶于100.0 mL去離子水中，121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫，得到瓊脂液體培養(yǎng)基。而瓊脂固體培養(yǎng)基需在上述配方中加入3.00 g瓊脂，高壓滅菌后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，待瓊脂凝固，于4 ℃下保存?zhèn)溆?。取少許大腸桿菌菌液于35 mL的瓊脂液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，220 r·min-1的搖床上培養(yǎng)過(guò)夜后，取10 mL菌液離心，將菌液的吸光度A調(diào)整至0.5，即可得到菌體濃度CE為5×108cfu·mL-1的大腸桿菌菌液。

1.5 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制

于6個(gè)新滅菌的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，各加入60 mL的瓊脂液體培養(yǎng)基、紫外照射20 min處理后的200 μL大腸桿菌溶液和GQDs，調(diào)整GQDs濃度，于37 ℃，220 r·min-1震蕩培養(yǎng)。每隔1 h記錄溶液600 nm下的吸光度A600，直至菌液的吸收值不再明顯增長(zhǎng)為止，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 GQDs的抑菌性能研究

取0.2 mL的大腸桿菌溶液于6個(gè)2 mL的玻璃管中，加入GQDs，調(diào)整其濃度。用近紅外激光在管壁正上方5 cm處照射20 min，未加入GQDs的菌液作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。再取0.2 mL的大腸桿菌溶液于6個(gè)2 mL玻璃管中，加入GQDs，調(diào)整其質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1，用近紅外激光在管壁正上方5 cm處照射一定時(shí)間后，將菌液稀釋104倍，取100 μL滴在瓊脂固體培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液均勻地涂布在平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，大腸桿菌的存活率按以下公式計(jì)算：

式中：Rs為細(xì)菌存活率，%；nexp為實(shí)驗(yàn)組菌落個(gè)數(shù)；ncon為對(duì)照組菌落個(gè)數(shù)。

每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次后取其平均值，計(jì)算誤差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 GQDs的材料表征

對(duì)石墨烯量子點(diǎn)材料進(jìn)行了表征。圖1為石墨烯量子點(diǎn)的紫外-可見(jiàn)光光譜表征圖，可知，在200～230 nm的紫外光階段，吸光度有略微的下降，而后在230～400 nm之間呈上升趨勢(shì)，至400 nm后幾乎保持不變?？梢?jiàn)此石墨烯量子點(diǎn)不僅在紫外階段對(duì)光有明顯的吸收，在可見(jiàn)光階段也表現(xiàn)出良好的光學(xué)吸收特性。圖2為GQDs的粒徑分布圖(圖中I代表強(qiáng)度)，由圖可知，此GQDs平均粒徑為4 483 nm，但粒徑分布稍有不均。

2.2 GQDs的光熱升溫曲線(xiàn)

在低功率密度(2 W·cm-2)的808 nm的激光照射下，GQDs水溶液可以產(chǎn)生大量的熱。從圖3(a)中可以看出，GQDs水溶液在光照20 min后，其溫度隨著GQDs質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)GQDs的質(zhì)量濃度從0.2 mg·mL-1升高至2.0 mg·mL-1時(shí)，GQDs水溶液在激光照射30 s時(shí)，溫度從28.5 ℃升高至30.1，31.8，33.6，34.5，38.3，44.3 ℃，隨著激光照射時(shí)間的增加，溫度逐漸升高，在照射6 min后，溫度基本達(dá)到最大值，溶液溫度升高了約15～37.7 ℃。GQDs的質(zhì)量濃度從0提高至1.0 mg·mL-1，溫度升高了(23.2±0.5) ℃，而從1.0 mg·mL-1提高至2.0 mg·mL-1時(shí)，溫度僅提升了(6.1±0.5) ℃，而對(duì)照組蒸餾水在激光照射20 min后，溫度僅上升到32.2 ℃，升溫幅度僅為3.7 ℃左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GQDs具有較好的光熱轉(zhuǎn)換能力，且熱效應(yīng)會(huì)隨著濃度的增大而進(jìn)一步增強(qiáng)，但增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩。

λ/nm圖1 GQDs紫外-可見(jiàn)光表征圖Fig.1 UV-visible light characterization of GQDs

d/nm圖2 GQDs粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of GQDs

t/min(a) GQDs升溫曲線(xiàn)

t/min(b) GQDs在30 s時(shí)的升溫圖3 GQDs水溶液在808 nm激光照射下的升溫情況Fig.3 Heating of GQDs aqueous solution under 808 nm laser irradiation

2.3 GQDs對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm處的光密度(A600)反映了培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度的高低。本實(shí)驗(yàn)將一定量的GQDs和大腸桿菌菌液在激光照射后加入瓊脂液體培養(yǎng)基中，每隔1 h，測(cè)量菌液在600 nm處的吸光度A600，繪制出不同GQDs質(zhì)量濃度下大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

如圖4所示，菌液的初始吸光度相同，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，大腸桿菌在培養(yǎng)基中不斷地生長(zhǎng)、繁殖，溶液的吸光度不斷增大。當(dāng)GQDs的質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)略低于對(duì)照組，即GQDs對(duì)大腸桿菌的抑制效果很不理想，但隨著GQDs質(zhì)量濃度的增加，溶液的吸光度減小，抑菌效果逐漸增強(qiáng)。由圖4可知，當(dāng)GQDs的質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg·mL-1時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)幾乎與橫軸平行，說(shuō)明溶液中菌液含量極低，大腸桿菌的生長(zhǎng)幾乎被完全抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GQDs能夠抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，且抑制作用隨著GQDs質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)GQDs的質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)幾乎被完全抑制。

t/h圖4 GQDs對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Fig.4 Effect of GQDs on the growth curve of Escherichia coli

2.4 GQDs對(duì)大腸桿菌的抑制作用

將大腸桿菌菌液稀釋104倍，涂布于瓊脂固體培養(yǎng)基上，在最適宜的條件下培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落并計(jì)算大腸桿菌的存活率。

由圖5可知，在低功率密度(2 W·cm-2)808 nm的激光照射下，大腸桿菌的存活率Rs隨著GQDs質(zhì)量濃度ρ(GODs)的增加而逐漸降低。當(dāng)GQDs的質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1時(shí)，大腸桿菌的存活率就低于10%，說(shuō)明此質(zhì)量濃度下的GQDs對(duì)大腸桿菌的抑制作用較為明顯，絕大多數(shù)的大腸桿菌已經(jīng)死亡。但1.0 mg·mL-1的GQDs在激光照射10 min的情況下，仍有極少數(shù)的大腸桿菌存活，而照射時(shí)間增加至20 min，大腸桿菌的生存率達(dá)到0。另外，GQDs在光照20 min時(shí)大腸桿菌的存活率均低于照射10 min時(shí)的大腸桿菌的存活率。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激光照射時(shí)間也是影響GQDs抑菌作用的重要因素之一。圖6是GQDs質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1時(shí)，不同激光照射時(shí)間對(duì)抑菌作用的影響。由圖6可知，激光照射5 min后，大腸桿菌的存活率只有18.36%，隨著光照時(shí)間的增加，大腸桿菌存活率逐漸降低，光照時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)，大腸桿菌的存活率低于10%，而在照射25 min后，大腸桿菌被完全殺滅。

ρ(GQDs)/(mg·mL-1)圖5 GQDs對(duì)大腸桿菌存活率的影響Fig.5 Effect of GQDs on Escherichia coli survival rate

t/min圖6 光照時(shí)間對(duì)大腸桿菌存活率的影響Fig.6 Influence of illumination time on the survival rate of Escherichia coli

由上述實(shí)驗(yàn)可知，光照時(shí)間和GQDs質(zhì)量濃度對(duì)大腸桿菌的抑制作用均有重要影響。如果提高GQDs質(zhì)量濃度，殺滅細(xì)菌的時(shí)間將會(huì)進(jìn)一步縮短，由此可見(jiàn)，在激光照射下，GQDs可以短時(shí)、高效地殺滅細(xì)菌。

2.5 GQDs抑菌機(jī)制分析

2.5.1 光熱效應(yīng)和光動(dòng)力效應(yīng)

GQDs能將吸收的光能轉(zhuǎn)換成熱能，為驗(yàn)證GQDs光熱效應(yīng)對(duì)抑菌作用的影響，將大腸桿菌在不同的溫度下單獨(dú)作用20 min，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)16 h后，測(cè)量大腸桿菌在600 nm的吸光度，如圖7所示，吸光度的數(shù)值隨著溫度的升高而降低，當(dāng)溫度從室溫升高至70 ℃時(shí)，吸光度從1.709降低至1.564，即大腸桿菌菌液濃度CE從0.546×106cfu·mL-1降低至0.482×106cfu·mL-1，由此可說(shuō)明，大腸桿菌活性在此溫度范圍內(nèi)受光熱效應(yīng)的影響。但僅在光熱效應(yīng)的作用下，大腸桿菌的濃度降低較小，難以達(dá)到安全殺菌的目的。但GQDs在激光的照射下，光熱效應(yīng)總伴隨光動(dòng)力效應(yīng)同時(shí)產(chǎn)生，由圖5和圖6可知，GQDs在光熱效應(yīng)和光動(dòng)力效應(yīng)的共同作用下可以達(dá)到安全殺菌的效果。

θ/℃圖7 溫度對(duì)大腸桿菌活性的影響Fig.7 Effect of temperature on Escherichia coli activity

而在有光激發(fā)的情況下，碳點(diǎn)中的光能引發(fā)電荷轉(zhuǎn)移，在光動(dòng)力效應(yīng)下會(huì)產(chǎn)生活性氧物種(reactive oxygen species,ROS)，從而對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)造成破壞或?qū)е录?xì)菌死亡。圖8為GQDs對(duì)大腸桿菌活性的影響，可知，大腸桿菌菌液濃度隨著GQDs質(zhì)量濃度的增大而減小，當(dāng)GQDs質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg·mL-1，大腸桿菌菌液濃度為0。由此可說(shuō)明，GQDs在光動(dòng)力效應(yīng)下可以殺滅細(xì)菌。

ρ(GODs)/(mg·mL-1)圖8 GQDs對(duì)大腸桿菌活性的影響Fig.8 Effect of GQDs on Escherichia coli activity

為了驗(yàn)證GQDs抑菌過(guò)程中的氧化還原機(jī)制，采用活性氧熒光標(biāo)記物二氯熒光黃二乙酸酯(DCFH-DA)對(duì)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的自由基和活性氧進(jìn)行標(biāo)記。無(wú)熒光的DCFH遇到細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧如·OH時(shí)，將被氧化成DCF而發(fā)出綠色的熒光。由圖9可知，經(jīng)過(guò)GQDs處理過(guò)的菌液發(fā)出了綠色的熒光，而沒(méi)有經(jīng)過(guò)GQDs處理過(guò)的菌液表現(xiàn)出來(lái)的熒光較為微弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GQDs在抑菌過(guò)程中產(chǎn)生了ROS，可與細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生氧化作用，破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。也進(jìn)一步說(shuō)明了ROS在GQDs的抑菌作用中扮演著十分重要的角色。

(a) DCFH

(b) DCFH+GQDs圖9 活性氧熒光檢測(cè)Fig.9 Reactive oxygen species fluorescence

綜上所述，GQDs對(duì)大腸桿菌的抑菌作用是由光熱效應(yīng)和光動(dòng)力效應(yīng)共同作用的。由圖7可知，只在溫度作用下時(shí)，大腸桿菌濃度只有些許的降低，而圖8中，GQDs在光動(dòng)力效應(yīng)下則可以使細(xì)菌濃度為0，完全地殺滅細(xì)菌。由此可說(shuō)明，在GQDs的抑菌過(guò)程中，光動(dòng)力效應(yīng)占主導(dǎo)作用。

2.5.2 GQDs對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的作用

為研究GQDs自身結(jié)構(gòu)對(duì)大腸桿菌的破壞作用，對(duì)石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行掃描電鏡分析，如圖10所示，石墨烯量子點(diǎn)邊緣鋒利，細(xì)菌細(xì)胞與石墨烯類(lèi)材料接觸后，細(xì)菌細(xì)胞被納米片層包裹，其鋒利的外表對(duì)大腸桿菌的外表造成破壞而發(fā)生不可逆的損傷[25]。

圖10 GQDs掃描電鏡圖Fig.10 SEM of GQDs

為研究GQDs對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的破壞作用，將其與0.6 mg·mL-1的GQDs共同培養(yǎng)12 h后，經(jīng)過(guò)固定脫水等處理后用掃描式電子顯微鏡觀察大腸桿菌形貌，通過(guò)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的大腸桿菌形貌上變化，分析GQDs與大腸桿菌的相互作用過(guò)程，探究GQDs對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)制，結(jié)果如圖11所示。

由圖11(a)可知，正常情況下，大腸桿菌呈現(xiàn)出規(guī)則的短棒狀結(jié)構(gòu)、表面光滑，且細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整。相比之下，大腸桿菌與GQDs接觸后，如圖11(b)所示，大腸桿菌則出現(xiàn)變形、凹陷、細(xì)胞膜破裂等情況，表面也變得粗糙。而這些形態(tài)的變化是由于大腸桿菌與GQDs的接觸過(guò)程中，GQDs鋒利的外表導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性被其破壞，GQDs的光熱效應(yīng)和光動(dòng)力效應(yīng)產(chǎn)生的ROS，破壞了大腸桿菌的新陳代謝，胞內(nèi)的物質(zhì)，比如離子，蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)等發(fā)生了泄露，而導(dǎo)致大腸桿菌的形態(tài)發(fā)生異常，從而達(dá)到了抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的效果。

(a)對(duì)照組

(b) 濃度為0.6 mg·mL-1的GQDs圖11 大腸桿菌掃描電鏡圖Fig.11 Scanning electron microscopy of Escherichia coli

3 結(jié)論

(1)采用震蕩沖擊法制備GQDs，可有效解決GQDs量產(chǎn)困難的缺點(diǎn)，提高GQDs的制備效率，降低制作成本。

(2)在808 nm激光照射下，探究GQDs抑菌特性，結(jié)果表明：GQDs能有效地抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，光照時(shí)間和GQDs質(zhì)量濃度對(duì)GQDs抑菌作用都有影響。光照時(shí)間一定，大腸桿菌的生存率隨著GQDs質(zhì)量濃度的增大而減小，而當(dāng)GQDs質(zhì)量濃度不變時(shí)，大腸桿菌的存活率隨光照時(shí)長(zhǎng)的增加而降低。若增大GQDs質(zhì)量濃度或光照時(shí)長(zhǎng)，可有效提高GQDs的殺菌效率。

(3)掃描電鏡和熒光檢測(cè)分析結(jié)果表明：GQDs的抑菌效果是由GQDs的光熱效應(yīng)、光動(dòng)力效應(yīng)以及GQDs自身結(jié)構(gòu)的共同作用。GQDs在光熱效應(yīng)和光動(dòng)力效應(yīng)下產(chǎn)生的ROS與大腸桿菌胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生氧化作用，對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，同時(shí)，GQDs鋒利的邊緣結(jié)構(gòu)破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

(4)而石墨烯量子點(diǎn)在抑菌過(guò)程中，主要依靠ROS對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞起到殺滅細(xì)菌的作用，因此，·OH的產(chǎn)生過(guò)程、檢測(cè)方法、影響因素，以及光熱效應(yīng)的增強(qiáng)情況等是我們進(jìn)一步探索的方向和研究?jī)?nèi)容。