鄭 穎， 鐘 宇， 陳永華， 付廣義

(1.中南林業(yè)科技大學 環(huán)境科學與工程學院， 湖南 長沙 410004； 2.湖南省環(huán)境保護科學研究院 水污染控制技術湖南省重點實驗室, 湖南 長沙 410014)

0 引言

隨著水產品市場需求的持續(xù)增長，為追求經濟效益，養(yǎng)殖戶開始大規(guī)模實施高密度、高投入、高產出的養(yǎng)殖方式，大量未消納的飼料和魚蝦糞未經處理便隨養(yǎng)殖尾水直接排放至自然環(huán)境，使得水體中各污染物濃度增大，環(huán)境水質顯著下降[1].研究表明，水產養(yǎng)殖尾水中主要污染物包括氮磷及污損生物等[2].

光合細菌是一種原核生物，可有效促進元素循環(huán)[3].在處理實際水產養(yǎng)殖廢水中添加光合細菌可有效改善養(yǎng)殖水質，并提高水產品幼體成活率[4-6].現(xiàn)有研究表明，光合細菌混合菌比其單株菌具有更高的產氫率和更好的穩(wěn)定性[7]，且混合菌能更適應實際水體的環(huán)境變化[8].因此，培養(yǎng)高活性光合細菌混合菌處理水產養(yǎng)殖尾水具有更大的實際應用意義.

本課題篩選了光合細菌混合菌群，通過高通量測序技術鑒定不同馴化培養(yǎng)階段混合菌群的多樣性變化，確定混合菌種類、豐度和不同細菌間的相互作用關系；利用CS和SA作為復合物包埋菌群，進行優(yōu)化實驗，考察不同因素條件下固定化菌群對水產養(yǎng)殖尾水中氮磷降解效率的影響.研究結果為光合細菌混合菌的篩選和包埋技術應用提供了基礎.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

光合細菌混合菌：光合細菌混合菌是實驗室從長沙圭塘河泥水中取得樣品，經富集、擴大培養(yǎng)得來，并將混合菌命名為MPB1.

MPB1混合菌富集培養(yǎng)基為：乙酸鈉2.5 g/L，酵母膏0.2 g/L，MgSO40.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaHCO31.0 g/L，微量元素溶液10 mL，pH 7.0.在121 ℃下滅菌20 min.

MPB1混合菌擴大培養(yǎng)基為：乙酸鈉2.5 g/L，黃腐酸0.2 g/L，酵母膏0.4 g/L，MgSO40.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaHCO31.0 g/L，微量元素溶液10 mL，pH 7.0.在121 ℃下滅菌20 min.

1.2 實驗方法

1.2.1 光合細菌混合菌的馴化培養(yǎng)

取采集的泥水50 mL于100 mL容量瓶中，加入富集培養(yǎng)基至瓶口處，蓋塞，封口膜封口.在光照強度5 000 lx、30 ℃條件下培養(yǎng)3天，富集培養(yǎng)3次，將3次富集培養(yǎng)階段命名為R1、R2、R3.此時，混合菌培養(yǎng)液呈鮮紅色，代表光合細菌為優(yōu)勢菌，此菌液可作為擴大培養(yǎng)的菌種.

在100 mL容量瓶中接種10 mL對數(shù)生長期后期的菌液，加入擴大培養(yǎng)基至瓶口處，蓋塞，封口膜封口.在富集培養(yǎng)相同條件下培養(yǎng)7天，擴大培養(yǎng)3次，將3次擴大培養(yǎng)階段命名為R4、R5、R6.此時，混合菌培養(yǎng)液呈深紅色，可作為后續(xù)實驗的接種液[20-21].

1.2.2 DNA抽取和高通量測序

選取不同馴化培養(yǎng)階段(R1、R2、R3、R4、R5、R6)的樣品菌液進行離心.根據(jù)E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增.將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，對回收產物進行檢測定量，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司).

1.2.3 固定化包埋材料比選實驗

1.2.4 固定混合菌最佳包埋條件

通過參考王建龍等[25]的生物固定化顆粒的制備方法，設置CS質量分數(shù)、SA質量分數(shù)和交聯(lián)時間為因素條件，通過不同因素條件對模擬尾水凈化效果的影響，確定最優(yōu)包埋條件.3因素3水平正交實驗如表1所示.

表1 固定化實驗3因素3水平

1.2.5 固定化球粒凈化效果的影響因素實驗

設置不同光照條件：光照24 h、光暗比12 h∶12 h和黑暗24 h，觀察不同光照條件下對固定化球粒凈化效果的影響，選擇最佳光照時間；設置不同固定化球粒投加量：20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L和70 g/L，分析不同投加量的凈化效果，確定最佳投加量.

1.2.6 分析方法

2 結果與討論

2.1 不同馴化培養(yǎng)階段菌群豐富度、多樣性及聚類分析

對不同馴化培養(yǎng)階段的MPB1菌群進行高通量測序，樣品共獲得263 624條16S rDNA基因片段優(yōu)化序列.在97%的相似度下，共有175個OTUs，覆蓋度高于99.9%，表示樣品具有代表性.菌群豐富度指數(shù)(Ace指數(shù))如圖1所示，R4-R6馴化培養(yǎng)時期的Ace指數(shù)無明顯變化，說明馴化培養(yǎng)階段菌群豐富度逐漸穩(wěn)定.

圖1 不同馴化培養(yǎng)階段下的Ace指數(shù)

MPB1菌群在屬分類學水平的層級聚類和PCA分析[27]如圖2(a)、(b)所示，菌群群落結構隨著馴化階段的變化在層級聚類中逐漸具有相似性；PCA分析圖展示不同馴化培養(yǎng)階段，菌群間的距離開始靠近，同樣反映了群落結構相似性慢慢增大.分析結果表明培養(yǎng)后期階段菌群結構趨于穩(wěn)定，再進行馴化培養(yǎng)對其群落結構影響較小，說明菌群培養(yǎng)成熟，可進行凈化效果實驗.

圖2 不同馴化培養(yǎng)階段菌群在屬分類水平下的 層級聚類和PCA分析

2.2 不同馴化培養(yǎng)階段菌群群落組成

圖3 不同馴化培養(yǎng)階段下微生物群落組成

2.3 群落的相互作用分析

有效凈化自然環(huán)境中的污染物，依賴于混合菌群中多種微生物之間的共同作用[30-31].根據(jù)Spearman相關系數(shù)，構建菌群中不同菌屬之間的相關關系網絡圖，用于探究反應菌群中微生物間的相互作用[32].MPB1菌群中優(yōu)勢菌屬間的相互作用網絡圖如圖4所示，互養(yǎng)菌屬(Synergistaceae)、脫硫弧菌屬(Desulfobibrio)、梭菌屬(Clostridium)和紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)，各菌屬間擁有正相關關系，表示在混合菌生物凈化過程中，菌屬間的主要關系可能為協(xié)同作用，通過協(xié)同作用加強了水質凈化能力.

圖4 菌群微生物間相互作用網絡圖

2.4 不同固定化包埋材料比選實驗

不同包埋材料固定MPB1菌群對TP去除效率的影響如圖5(c)、(d)顯示，TP處理效果最佳的組為CS固定化球粒組，去除效率達到74.2%，其次是CS-SA固定化球粒組，去除效率為57.8%.對照組的CS、CS-SA空白球粒組對TP的吸附效率分別為62.5%和47.7%.通過與對照組的對比說明，包埋材料吸附功能在降低TP含量過程中發(fā)揮主要作用，其中CS包埋材料擁有對TP最佳吸附效果.

不同包埋材料固定MPB1菌群對TN去除效率的影響如圖5(e)、(f)顯示，CS-SA固定化球粒組對TN去除效率為71.4%，是最佳處理組.對照組的最佳處理組是空白SA固定化組，吸附效率為46.5%.通過對比分析得出，MPB1菌群與CS-SA包埋材料能擁有最佳協(xié)同作用，使得其處理效果最佳.因此，通過綜合比較選擇CS-SA作為包埋材料進行后續(xù)實驗.

圖5 不同載體空白球粒和不同載體球粒組對 和TN的去除效果影響

2.5 復合物固定化菌群最佳包埋條件

表2 正交試驗數(shù)據(jù)分析結果

2.6 不同光暗比對凈化效果的影響

圖6 不同光暗比對固定化球粒降解 和TN的效果分析

2.7 不同投加量對凈化效果的影響

不同投加量對固定化球粒去除效果的影響如圖7所示，投加量在20～40 g/L范圍時，污染物去除效率隨著投加量的增多而上升.

圖7 不同球粒投加量對固定化球粒去除 和TN的效果分析

3 結論

(2)MPB1菌群中紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)相對豐度最大.Spearman相關系數(shù)分析顯示，菌群中互養(yǎng)菌屬(Synergistaceae)、脫硫弧菌屬(Desulfobibrio)、梭菌屬(Clostridium)和紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)，各菌屬間擁有相互作用關系，可能是菌屬間的協(xié)同關系提高了微生物的合成代謝效率，強化了混合菌的生物凈化能力.