王 莉，袁 逸，唐 藝，孫 璐，袁慶新

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內分泌科，江蘇 南京 210029

糖尿病受遺傳因素和環(huán)境因素共同作用，隨著健康與疾病發(fā)育起源理論的提出，“胎源性疾病”受到越來越多的重視，子宮內環(huán)境改變、胚胎宮內發(fā)育不良及表觀遺傳的變化，將影響其成年后代謝性疾病的發(fā)生，這些個體成年后懷孕又將出現(xiàn)進一步代謝異常，這種跨代效應導致糖尿病發(fā)病率不斷增加，從胚胎發(fā)育及孕期入手探究糖尿病的發(fā)病機制是目前熱點之一。

宮內發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）是常見的胚胎發(fā)育異常形式，可以導致新生期個體的胰島面積明顯減少，胰島素染色減弱，胰島較正常少且松散，血清胰島素含量低于正常，成年后容易發(fā)生糖耐量異常［1］，這些IUGR雌性個體成年后，面對懷孕這一壓力測試，可能出現(xiàn)進一步的代謝失衡、胰島功能障礙。

許多研究已證實正常妊娠期母體會經歷一系列的生理變化，以滿足自身和胎兒不斷變化的營養(yǎng)需求，包括心血管系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)的適應性改變。孕期雌激素、孕激素、胎盤催乳素、胎盤生長激素、脂聯(lián)素、瘦素等水平的變化及碳水化合物代謝的增加，導致生理性胰島素抵抗，胰島β細胞團出現(xiàn)代償性增殖，從而保證妊娠期母體的糖代謝平衡。IUGR 雌性個體成年后妊娠期會出現(xiàn)怎樣的代謝及胰島功能改變，其可能機制如何，目前少有研究。

文獻表明，成年期的糖代謝異?？赡苁瞧渖缙诃h(huán)境印跡的“程序化”結果，表觀遺傳學在其中發(fā)揮著重要作用［2］。表觀遺傳主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑、非編碼RNA 等，是指基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達發(fā)生可遺傳的變化。非編碼轉錄本依據其大小分為兩類，具有200個或更少核苷酸的（nucleotide，nt）為小非編碼RNA，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、與piwi 蛋白作用的RNA（piwi-interacting RNA，piRNA）和小干 擾RNA（small interference RNA，siRNA）；超過200 nt 的非編碼RNA 為長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），不編碼蛋白質，結構上與信使RNA（messenger RNA，mRNA）相似，但缺乏開放閱讀框，位于細胞質或細胞核內，核lncRNA 主要參與表觀遺傳基因調控或維持核結構，而細胞質lncRNA 參與轉錄后基因調控［3］。在人胰島和純化的β細胞［4］以及小鼠胰島細胞［5］已經發(fā)現(xiàn)有1 000 多條lncRNA 表達，部分參與胰島β細胞的分化成熟過程，且表達受糖濃度調節(jié)。lncRNA的表達在時間和空間上都受到嚴格的調控，因此失調的表達譜是疾病或發(fā)育狀態(tài)改變的重要標志。

本研究首先通過孕期給予母鼠8%的低蛋白飲食獲得IUGR 新生小鼠，然后待新生小鼠成年后與同周齡雄鼠配繁，最后獲得IUGR孕鼠。對IUGR孕鼠（IUGR pregnancy，IP）和正常孕鼠（normal pregnancy，NP）胰島RNA 進行高通量測序分析，比較兩者lncRNA 和mRNA 表達差異，對 差異lncRNA 的靶mRNA 和差異mRNA 進行功能注釋和富集通路分析，為糖尿病的早期預防和診治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

8 周齡C57BL/6 雄性小鼠16 只、雌性小鼠32 只購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物飼養(yǎng)和實驗均通過南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理委員會（IACUC）批準。小鼠胰島β細胞系min6 細胞來自南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內分泌科實驗室。

RNA isolater Total RNA Extraction Reagent、SYBR Green Master Mix（南京Vazyme 公司）；Primer-ScriptTMRT Master Mix（TaKaRa 公司，日本）；RNA 引物（上海Invitrogen 公司）；Histopaque1077（Sigma 公司，美國）。PCR擴增儀（Eppendorf公司，美國）；實時定量PCR 儀（Thermo Fisher 公司，美國）；Nano Drop超微分光光度儀（Thermo Fisher公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物造模

8 周齡C57B6/L 小鼠飼養(yǎng)在SPF 級環(huán)境。待小鼠適應環(huán)境后，傍晚雄性與雌性以1∶2合籠，次日清晨以陰道有精栓且陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子為確定妊娠。

NP 組：自確定妊娠開始予以標準繁殖飼料（蛋白含量為20%）。IP 組：①IUGR 小鼠造模。孕鼠自確定妊娠開始予以低蛋白飼料（購自北京協(xié)同生物有限公司，等熱量、8%的蛋白質含量）至新生小鼠出生；IUGR 小鼠造模成功標準：新生鼠體重低于同胎齡同性別小鼠體重的第10 百分位點以下；②IUGR雌小鼠8 周成年后與同周齡雄鼠合籠，自受孕開始飼以標準繁殖飼料（蛋白含量為20%）。

1.2.2 小鼠胰島的提取

NP、IP 孕鼠各3 只，用1%戊巴比妥鈉麻醉后固定，剖開腹腔，分離穿刺膽總管，注入冷膠原酶消化、過細胞篩網，收集胰島，放入Histopaque1077 中純化。所有胰島均在顯微鏡下手挑計數。

1.2.3 差異RNA檢測分析

廣州基迪奧生物科技有限公司使用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 裂解胰島細胞，提取總RNA后使用Nano Drop超微分光光度儀進行RNA質檢。

從總RNA 中去除核糖體RNA，以最大限度地保留所有編碼RNA（coding RNA）和非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。得到的RNA 隨機打斷成為短片段，再以片斷化后的RNA 為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成cDNA 第1 鏈；接著加入緩沖液、dNTPs（dUTP 代替dTTP）、RNase H和DNApolymeraseⅠ合成cDNA第2鏈，經過QiaQuick PCR 試劑盒純化并加EB 緩沖液洗脫經末端修復、加堿基A，加測序接頭，然后通過UNG（uracil-Nglycosylase）酶降解第2條鏈。用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，進行PCR擴增。最后建好的測序文庫用Illumina-HiSeqTM4000進行測序。

對下機數據進行過濾得到clean data后，將reads用Tophat2（2.1.1）比對到小鼠參考基因組（ensemble 104）上，并利用Cufflinks重構轉錄本，得到已知轉錄本與新轉錄本。利用CPC、CNCI等軟件對新轉錄本進行編碼能力預測，得到新預測的lncRNA。然后分別對樣本中的mRNA、lncRNA 進行表達量分析，并使用edgeR 包對組間lncRNA 和mRNA 進行差異分析。|log2FC|＞1，P＜0.05表示有差異。

利用lncRNA 與mRNA 表達量的Pearson 相關系數、RNAplex 等預測lncRNA 的靶mRNA，對靶基因進行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋分析和京都基因與基因組百科全書數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR

逆轉錄反應按照RT-PCR 試劑盒說明書進行。將AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX premixed）應用于StepOne Plus 系統(tǒng)，進行qRT-PCR反應。反應體系20 μL：模板cDNA 1 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，滅菌ddH2O 8.2 μL。引物序列如下，β-actin：上游5′-TGAGCTGCGTTTTACACCCT-3′，下游5′-TTTGGGGGATGTTTGCTCCA-3′；Neat1：上游5′-CAAGAAACAGCAACACCAGAAG-3′，下游5′-TAAGGTCCCCATTCAAGTCAGT-3′；FTX：上游5′-AAGATCTCCGCTGCCAGATG-3′，下游5′-CTGCTCCTGTGCCACGAATA-3′。反應條件：預變性95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。根據熔解曲線判斷引物的特異性及擴增效率，采用2-ΔΔCt法對基因相對表達量進行計算和分析。

1.2.5 min6細胞的培養(yǎng)及不同糖濃度刺激

小鼠胰島細胞系min6 細胞，其正常培養(yǎng)基（糖濃度25 mmol/L）的配制：84%的高糖DMEM（含4.5 g/L 葡萄糖），15%胎牛血清（FBS），1%雙抗（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素），0.035%的2.5 mmol/L β-巰基乙醇。細胞置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中，每天更換新鮮培養(yǎng)基，融合度達80%左右進行傳代。將高糖DMEM 替換成低糖DMEM（含葡萄糖1 g/L），余成分不變，此時低糖完全培養(yǎng)基的糖濃度為5.5 mmol/L，然后在10 mL低糖完全培養(yǎng)基中分別加入0.01、0.02、0.05 g 葡萄糖粉，得到11.1、16.7、33.3 mmol/L 不同糖濃度的培養(yǎng)基。將min6細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，加入無糖低血清（0.25%）培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 h后棄去，分別加入不同糖濃度培養(yǎng)基2 mL，標記好糖濃度，放入37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后收RNA。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用Graphpad Prism 8.4.3 軟件繪制實驗結果圖，基因表達量以均值±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA的組間差異

在NP、IP 中共鑒定出個30 426 個lncRNA 轉錄本，其中已知的轉錄本13 404（44%），新的轉錄本943 個。使用edgeR 軟件對組間lncRNA 的表達量進行差異分析，發(fā)現(xiàn)在NP 和IP 中有差異表達的lncRNA 1 007個，其中483個上調，524個下調。圖1示差異表達lncRNA 的火山圖和熱圖。表1 列舉了10個高差異表達的lncRNA。

表1 差異表達的lncRNATable1 Differentially expressed lncRNAs

圖1 正常孕鼠和IUGR孕鼠差異表達的lncRNAFigure 1 Differentially expressed lncRNAs between normal pregnant and IUGR pregnant mice

2.2 mRNA分析

2.2.1 mRNA的組間差異

在NP、IP 中共鑒定出66 652 個mRNA 轉錄本，其中已知的轉錄本43 034個（64.57%），新的轉錄本10 018個。使用edgeR 軟件對組間mRNA 的表達量進行差異分析，發(fā)現(xiàn)在NP 和IP 中有差異表達的mRNA 50 個，其中22 個上調，28 個下調。圖2 示差異表達的mRNA的火山圖和熱圖。表2列舉了10個高差異表達的mRNA。

表2 差異表達的mRNATable 2 Differentially expressed mRNAs

圖2 正常孕鼠和IUGR孕鼠差異表達的mRNAFigure 2 Differentially expressed mRNAs between normal pregnant and IUGR pregnant mice

2.2.2 差異mRNA的GO/KEGG通路富集分析

圖3顯示了差異mRNA 的KEGG 通路富集分析和GO功能注釋分析。KEGG信號通路富集分析中，按基因數量從多到少排序，前5 位分別是代謝通路（metabolic pathways）（4個基因）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）（3 個基因）、內質網中的蛋白質加工（protein processing in endoplasmic reticulum）（3 個基因）、集落黏附（focal adhesiom）（3個基因）、AMPK信號通路（AMPK signaling pathway）（2 個基因）（圖3A）。GO 功能注釋分析中綠色表示下調基因，紅色表示上調基因，按照參與GO 富集條目下調基因的數量排序，生物學途徑（biological process，BP）中前5 位是細胞進程（cellular process）（18個基因）、單有機體過程（single-origanism process）（16 個基因）、生物調節(jié)（biological regulation）（11 個基因）、代謝過程（metabolic process）（11個基因）、刺激反應（response to stimulus）（9 個基因）；細胞組分（cellular component，CC）中前5 位 是細胞（cell）（22 個基因）、細胞部分（cell part）（22個基因）、細胞器（organelle）（21 個基因）、細胞器部分（organelle part）（13 個基因）、細胞膜（membrane）（12 個基因）；分子功能（molecular function，MF）中前4 位是綁定（binding）（18 個基因）、催化活性（catalytic activity）（9 個基因）、轉運活性（transporter activity）（4 個基因）、化學排斥物活性（chemorepellent activity）（1 個基因）（圖3B）。

圖3 正常孕鼠和IUGR孕鼠差異mRNA的KEGG和GO富集分析圖Figure 3 The KEGG and GO enrichment analysis of differentially expressed mRNAs between normal and IUGR pregnant mice

2.3 lncRNA與mRNA的關聯(lián)分析

lncRNA 參與調控許多轉錄后進程。對mRNA的調控方式包括：反義（antisense）作用、順式（cis）作用、反式（trans）作用。

2.3.1 antisense作用

antisense 作用指一部分反義lncRNA 與正義的mRNA 結合而調控基因沉默、轉錄及mRNA 的穩(wěn)定性。圖4A列舉了3個差異lncRNA 與其靶mRNA 的antisense 作用，antisense 作用具有高度的保守性和穩(wěn)定性［6］，其中l(wèi)ncRNA Ppp1ca被報道通過MAPK通路參與腫瘤的發(fā)生［7］，其與Rad9A 的互作關系未被研究，lncRNA 1010001N08Rik、AC154652.2 未曾有報道。差異lncRNA antisense 作用的靶mRNA 的KEGG、GO 富集分析如圖4所示，KEGG 信號通路分析中按富集基因數量排序，前5 位分別是metabolic pathways（511個基因）、癌癥通路（pathway in cancer）（204 個基因）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）（167 個基因）、次生代謝物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）（158個基因）、PI3K-Akt signaling pathway（157 個基因）（圖4B）。GO 功能注釋分析中按基因數目排序，BP 中前5 位是cellular process（4 050 個基因）、single-organism process（3 712個基因）、biological regulation（3 208個基因）、metabolic process（2 184 個基因）、response to stimulus（1 904 個基因）；CC 中前5 位分別是cell（4 249 個基因）、cell part（4 224 個基因）、organelle（3 310 個基因）、membrane（2 520 個基因）、organelle part（2 128 個基因）；MF 中前5 位分別是binding（4 499 個基因）、catalytic activity（1 943 個基因）、transporter activity（460 個基因）、分子功能調節(jié)（molecular function regulator）（437 個基因）、核酸結合轉錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity）（377個基因）（圖4C）。

圖4 差異lncRNA與其靶mRNA的antisense作用及靶mRNA的KEGG和GO富集分析Figure 4 The antisense between differentially expressed lncRNA and its target mRNA，the KEGG and GO enrichment analysis of the target mRNA

2.3.2 cis作用

cis作用指同一染色體上lncRNA的功能與其鄰近的蛋白編碼基因相關，位于這些基因上游或下游10 kb的lncRNA可能在轉錄或轉錄后水平對基因的表達進行調控。圖5A列舉了3個差異lncRNA與其靶mRNA 的cis作用。cis調控主要依賴順式作用元件進行，順式作用元件是指存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列，包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等，它們參與核內基因表達的調控，順式作用元件通常轉錄為非編碼RNA，如lncRNA。圖5A 中l(wèi)ncRNA Ppp1ca、1010001N08Rik、AC154652.2 通過cis 分別和Rad9A、Gata6、Slc37a1有互作關系，而圖4A是通過antisense作用有互作關系，這是因為lncRNA 和mRNA 鏈較長，antisense 作用的位置和區(qū)域與cis 作用的位置區(qū)域有所不同。差異lncRNA cis 作用的靶mRNA 的KEGG、GO 富集分析如圖5 所示，KEGG 信號通路富集分析中按照基因數量排序，前5 位分別是metabolic pathways（847 個基因）、pathways in cancer（284 個基因）、biosynthesis of secondary metabolites（254個基因）、胞吞（endocytosis）（229 個基因）、PI3K-Akt signaling pathway（219 個基因）（圖5B）。GO 功能注釋分析中按基因數目排序，BP 中前5 位是cellular process（6 308 個基因）、single-organism process（5 438 個基因）、biological regulation（4 618 個基因）、metabolic process（3 780個基因）、response to stimulus（2 718個基因）；CC 中前5 位分別是cell（6 745 個基因）、cell part（6 430 個基因）、organelle（5 119 個基因）、membrane（3 610 個基因）、organelle part（3 459 個基因）；MF 中前5 位分別是binding（6 813 個基因）、catalytic activity（3 102 個基因）、molecular function regulator（601 個基因）、transporter activity（555 個基因）、nucleic acid binding transcription factor activity（515個基因）（圖5C）。

圖5 差異性lncRNA與其靶mRNA的cis作用，差異性lncRNA cis作用的靶mRNA的KEGG和GO富集分析Figure 5 The cis between differentially expressed lncRNA and its target mRNA，the KEGG and GO enrichment analysis of differentially expressed lncRNA cis target mRNA

2.3.3 trans作用

trans 作用指lncRNA 的功能與編碼基因的位置沒有關系，而與其共表達的蛋白編碼基因相關，可以通過樣本間lncRNA 與蛋白編碼基因的表達量相關性分析或共表達分析方法來預測其靶mRNA，lncRNA 在其轉錄或轉錄后水平對基因的表達進行調控。圖6A 列舉了3 個差異lncRNA 與其靶mRNA的trans 作用，兩者可以位于不同的染色體上，內源性競爭RNA（ceRNA）就屬于此類［8］，lncRNA Ppp1ca可以競爭性地結合miR-125b從而阻止其誘導的tau磷酸化［9］。差異lncRNA trans 作用的靶mRNA 的KEGG、GO 富集分析如圖6所示，KEGG 信號通路富集分析中按基因數量排序，前5 位分別是metabolic pathways（675 個基因）、pathways in cancer（241 個基因）、biosynthesis of secondary metabolites（183 個基因）、MAPK signaling pathway（180個基因）、PI3K-Akt signaling pathway（179 個基因）（圖6B）。GO 功能注釋分析中按基因數目排序，BP 中前5 位是cellular process（4 692 個基因）、single-organism process（4 239 個基因）、biological regulation（3 550 個基因）、metabolic process（2 473 個基因）、response to stimulus（2 138 個基因）；CC 中前5 位分別是cell（4 487 個基因）、cell part（4 437 個基因）、organelle（3 100個基因）、membrane（3 071個基因）、細胞膜部分（membrane part）（2 641 個基因）；MF 中前5 位分別是binding（5 144個基因）、catalytic activity（2 200個基因）、分子傳感器活性（molecular transducer activity）（578個基因）、transporter activity（543個基因）、信號轉導活性（signal transducer activity）（540 個基因）（圖6C）。

圖6 差異性lncRNA與其靶mRNA的trans作用，差異性lncRNA trans作用的靶mRNA的KEGG和GO富集分析Figure 6 The trans between differentially expressed lncRNA and its target mRNA，the KEGG and GO enrichment analysis of differentially expressed lncRNA trans target mRNA

2.4 差異表達lncRNA FTX和Neat1的進一步分析

選取在NP和IP中高差異表達且可能與孕期胰島發(fā)育、細胞增殖相關的lncRNA FTX 和Neat1進一步分析，qRT-PCR 示正常小鼠、IUGR 小鼠懷孕后FTX 的表達量分別較未孕時下降（P＜0.001），而Neat1 的表達量分別較未孕時升高（P＜0.01，圖7）。FTX、Neat1在懷孕后的正常小鼠和IUGR 小鼠之間表達水平有顯著差異（P＜0.05，圖7）。

圖7 lncRNA FTX（A）、Neat1（B）在正常小鼠、IUGR小鼠的未孕和孕期的表達Figure 7 Expression of lncRNA FTX（A）and Neat1（B）in pre-pregnancy and pregnancy of normal mice and IUGR mice

為明確lncRNA 的表達是否受糖濃度調節(jié)，本研究測定了min6 細胞在不同糖濃度刺激下FTX 和Neat1 的表達情況。FTX 在低糖濃度（5.5、11.1、16.7 mmol/L）、高糖濃度（33.3 mmol/L）下表達水平較正常糖濃度上調（P＜0.001，圖8A），而Neat1的表達相反（P＜0.01，圖8B）。

圖8 不同糖濃度下min6 細胞中l(wèi)ncRNA FTX（A）、Neat1（B）的表達Figure 8 Expression of lncRNA FTX（A）and Neat1（B）in min6 cells under different glucose concentrations

進一步查找FTX 和Neat1 與其靶mRNA 的互作關系，圖9A示FTX與其靶mRNA均為trans作用，圖9B 示Neat1 與Frmd8（mRNA）為cis 作用，余為trans作用。

圖9 lncRNA FTX（A）與靶mRNA的trans作用，lncRNA Neat1（B）與靶mRNA的cis作用（左）、trans作用（右）Figure 9 Trans-action of lncRNA FTX(A),cis(left)and trans(right)action of lncRNA Neat1(B)

3 討論

妊娠是一個逐漸發(fā)生生理性胰島素抵抗的過程，正常情況下胰島β細胞通過代償性增殖來維持孕期的糖代謝平衡，而IUGR 個體在胚胎期和新生兒早期胰島發(fā)育和功能出現(xiàn)損害，成年后是否能應對妊娠這一代謝壓力測試不得而知，目前關于IUGR 孕期的IUGR 小鼠研究未見報道。本研究首次對IUGR 孕鼠胰島轉錄組進行高通量測序分析，為深入探究其發(fā)病機制提供理論基礎。

越來越多的報道顯示lncRNA 影響胰島細胞的發(fā)育和功能、糖尿病的發(fā)生發(fā)展和IUGR 的發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA paupar 通過調控pax6 促進了胰島α細胞的發(fā)育和功能［10］；lncRNA hottip 通過調節(jié)p38-MAPK 通路改善糖尿病視網膜病變［11］；本課題組前期研究表明，lncRNA TUG1 參與了IUGR致2 型糖尿病胰島功能損傷的過程［1］。此外，lncRNA 在小鼠妊娠期不同階段動態(tài)表達，其中l(wèi)ncRNA Gm16308（lnc03）促進小鼠妊娠期胰島β細胞增殖［12］，而lncRNA 表達譜的改變可誘發(fā)妊娠期糖尿?。?3］，Zhang 等［14］證明了lncRNA MALAT1 在妊娠期糖尿病孕婦組血清中的表達水平高于正常孕婦組。

本課題組前期實驗結果顯示：小鼠孕期存在胰島增殖，但IUGR雌鼠孕期較正常小鼠孕期胰島β細胞增殖能力減弱，胰島大小及數量增加較少，出現(xiàn)糖耐量異常，為進一步探討其發(fā)病原因，本研究對IUGR 孕鼠胰島進行全轉錄組測序及分析，結果提示，差異lncRNA的靶mRNA、差異mRNA的GO分析中BP 集中于細胞及組織過程、生物調節(jié)、代謝及應激過程，CC集中在細胞及器官、胞膜等過程，MF集中于整合、催化活性、轉運活性、分子功能調節(jié)等，這些基因均可對IUGR妊娠期胰島功能產生影響，如能量代謝、β細胞周期調節(jié)及胰島素胞吐過程等變化。KEGG 富集分析顯示差異lncRNA 的靶mRNA、差異mRNA主要集中在代謝通路、癌癥通路、次生代謝產物的生物合成、PI3K-AKT通路及MAPK通路。這表明IUGR 孕鼠和正常孕鼠在合成代謝、分解代謝以及癌癥的發(fā)生發(fā)展方面存在差異。

PI3K/AKT、MAPK 通路在維持胰島β細胞增殖和存活方面起著關鍵作用。文獻報道，催乳素受體和PI3K（AKT、mTOR、p70S6K）通路、MAPK（MEK、ERK1/2）通路參與大鼠妊娠期胰島質量的增加和葡萄糖敏感性的增強［15］。妊娠期胎盤生長因子可能刺激胰島內皮細胞釋放生長因子，激活β細胞中的PI3K/AKT 信號以增加其增殖［16］。表皮生長因子通過PI3K/AKT 和MAPK 通路激活存活蛋白survivin，抑制β細胞凋亡［17］。這些過程和通路異?？赡軐е翴UGR小鼠孕期發(fā)生胰島功能障礙。

本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA Neat1、FTX 在小鼠懷孕后表達量改變，并可能分別通過MAPK 途徑、PI3K/AKT途徑影響小鼠孕期胰島細胞增殖及功能，提示lncRNA 的表達在妊娠期這個特殊的時間段受到嚴格的調控。既往研究發(fā)現(xiàn)Neat1可以通過調節(jié)細胞的增殖及凋亡，導致疾病的發(fā)生，如腫瘤、白血病及糖尿病腎?。?8］。研究證實，lncRNA Neat1 在宮內發(fā)育遲緩模型的絨毛滋養(yǎng)細胞中表達上調［19］，提示Neat1 與特發(fā)性IUGR 胎兒的胎盤功能障礙有關，而Neat1 在IUGR 孕鼠胰島發(fā)育、胰島結構及功能維持中的作用及機制尚未見報道。lncRNA FTX參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如lncRNA FTX 通過調節(jié)miR-192-5p/EIF5A2 軸促進直腸癌的進展［20］，通過海綿化miRNA-22 調節(jié)pten/PI3K/AKT 信號通路而減少新生小鼠心肌細胞肥大［21］，但FTX 在胰島中尚未被研究。本研究在IUGR 孕鼠和正常孕鼠胰島中檢測lncRNA Neat1和FTX的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義。不同糖濃度刺激min6 細胞后，發(fā)現(xiàn)二者的表達受糖濃度影響，lncRNA這一特點可能在IUGR孕鼠發(fā)生糖耐量異常過程中發(fā)揮作用。測序結果還發(fā)現(xiàn)lncRNA FTX 與其靶mRNA 均為trans作用，lncRNA Neat1 與Frmd8（mRNA）為cis 作用，余為trans 作用，結合lncRNA 和mRNA 的互作分析（圖4A、5A、6A）可見，同一種lncRNA 可以通過不同的互作方式調控不同mRNA 的表達，而同一種lncRNA 和同一種mRNA 之間可以存在不同的互作方式，這是因為不同的作用方式在lncRNA和mRNA核苷酸鏈上所在的位置和區(qū)域不同。

文獻表明，lncRNA 可能通過充當miRNA 海綿并調節(jié)mRNA 轉錄后沉默而起到基因調節(jié)劑的作用［3］，本課題組正在實驗驗證測序結果中的互作關系，若干擾或過表達lncRNA 后，其靶mRNA 的表達量隨之發(fā)生相應的變化，接下來再深入探討其中是否涉及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA這一“海綿”作用。

本研究通過對IUGR孕鼠胰島RNA進行高通量測序，篩選出了IUGR 孕鼠和正常孕鼠差異表達的lncRNA 及mRNA，并對差異lncRNA 的靶mRNA 進行GO、KEGG分析，為研究IUGR小鼠妊娠期發(fā)生胰島功能障礙提供了理論基礎。在此基礎上，進一步深入探究差異表達的lncRNA 對IUGR 小鼠妊娠期胰島功能的具體調控作用及其機制，以期早期防控糖尿病，降低糖尿病的發(fā)病率。