祁顏艷，顧 愹，楊 濤

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029

1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）是一種T 細(xì)胞介導(dǎo)的以胰島β細(xì)胞靶向破壞為特征的自身免疫疾病，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在β細(xì)胞破壞中起核心作用，誘導(dǎo)胰島自身抗原耐受有望治愈T1DM。但目前不管是針對(duì)胰島自身抗原如胰島素、谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD），還是針對(duì)一些致病表位肽如胰島素B9-23、DiaPep277等的抗原特異性免疫耐受治療，均未達(dá)到理想的效果，這主要由于自身反應(yīng)性T 細(xì)胞識(shí)別的表位仍未完全明確［1］。越來越多的證據(jù)表明，免疫系統(tǒng)對(duì)β細(xì)胞的攻擊很可能是由于β細(xì)胞受到應(yīng)激或病毒感染從而產(chǎn)生新生抗原或表位引起的［2-4］，新表位在T1DM 發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用［5-6］，它的產(chǎn)生解釋了為何自身反應(yīng)性T細(xì)胞能逃脫胸腺的陰性選擇來攻擊β細(xì)胞。美國(guó)的Kathryn 教授利用致糖尿病性BDC CD4+T細(xì)胞克隆系來識(shí)別β細(xì)胞蛋白提取物，發(fā)現(xiàn)了一種由胰島素與β細(xì)胞分泌顆粒內(nèi)其他抗原共價(jià)交聯(lián)剪切融合而成的新表位多肽，將其命名為“hybrid insulin peptide（HIP）”［7］。在T1DM 患者和動(dòng)物模型NOD（non-obese diabetic）小鼠體內(nèi)均存在識(shí)別這種致病性表位的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞［8-9］。基于這種新表位誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受為T1DM的治療提供了新的研究方向［6］。

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）作為強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，不僅可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)發(fā)生，而且在誘導(dǎo)中樞和外周耐受、維持免疫穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮著重要作用［10］。一方面，在經(jīng)典免疫反應(yīng)中，外周未成熟DC（imature DC，iDC）在遇到抗原和危險(xiǎn)信號(hào)后上調(diào)共刺激分子（CD80、CD86、CD40 等）、主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子和促炎細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)，成為成熟的DC（mature DC，mDC）從而能夠遷移到淋巴結(jié)并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)發(fā)生；另一方面，還存在著一群耐受性DC（tolerogenic DC，tolDC）通過低表達(dá)共刺激分子、高表達(dá)共抑制分子、分泌抗炎細(xì)胞因子等機(jī)制誘導(dǎo)T 細(xì)胞克隆失能、凋亡等。因此，tolDC 作為一種細(xì)胞療法在自身免疫疾病包括T1DM的治療中富有前景［11-13］。然而目前tolDC 在T1DM 方面的研究主要是非抗原特異性或是僅針對(duì)單一抗原（GAD）或抗原肽（胰島素原肽）［14］，而表位擴(kuò)展等原因產(chǎn)生的新表位如2.5HIP可能在T1DM發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。2.5HIP是由胰島素原的C肽片段（LQTLAL）與嗜鉻粒蛋白A的WE14片段（WSRMD）融合形成的雜交肽，它是NOD小鼠體內(nèi)分離出來的致糖尿病性的T 細(xì)胞克隆系BDC2.5 T 細(xì)胞［15］特異性識(shí)別的抗原表位［7］。針對(duì)2.5HIP誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受是T1DM 治療的新思路，所以本研究旨在探究負(fù)載2.5HIP的tolDC對(duì)致糖尿病性BDC2.5 T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為SPF級(jí)別，實(shí)驗(yàn)所用的8～12周齡NOD 雌鼠、6～13 周齡BDC2.5 TCR 轉(zhuǎn)基因雌鼠均來自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、使用及處理均經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-2011058）。實(shí)驗(yàn)所用的試劑包括：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（Gibco 公司，美國(guó)）；粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、白介素（interleukin，IL）-4（Peprotech 公司，美國(guó)）；1α，25-二羥基維生素D3（VitD3）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma 公司，美國(guó)）；CellTrace CFSE 細(xì)胞增殖試劑（Invitrogen 公司，美國(guó)）；小鼠IL-12p70 細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒（R&D 公司，美國(guó)）；小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒（深圳欣博盛）；2.5HIP 序列EVEDPQVAQLELGGGPGAGDLQTLALWSRMDQL-AKELTAE（上海吉爾生化公司合成）；小鼠CD4+T 細(xì)胞陰選磁珠、autoMACS Runnning Buffer（美天旎公司，德國(guó)）。實(shí)驗(yàn)中所用的流式抗體包括：FITC-CD11c、PE-CD80、Percpcy5.5-CD86、APC-MHCⅡ、APC-PD-L1、APC-CD4、FITC-CD44、PE/cyanine7-CD69、BV421-CD25、PEFoxp3 均來自美國(guó)Biolegend 公司；流式細(xì)胞術(shù)所用破核試劑eBioscienceTMFOXP3/Transcription Factor Staining Buffer Set（Invitrogen公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源的DC培養(yǎng)

取8～12 周齡的NOD 雌鼠，分離其肱骨、脛骨，75%酒精消毒5 min后用PBS沖洗去除兩端骨骺，用1 mL注射器沖洗骨髓腔內(nèi)的骨髓細(xì)胞至RPMI1640完全培養(yǎng)基中，裂紅處理后用200 目的濾網(wǎng)過濾并洗滌，每只鼠大概可以獲得2×107～4×107個(gè)骨髓細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用RPMI1640 完全培養(yǎng)基重懸并調(diào)整密度至1×106個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)置iDC 組、tolDC 組、LPS-tolDC 組、LPS-iDC 組（即mDC 組），每組均加入GM-CSF 20 ng/mL 和IL-4 10 ng/mL，tolDC 及LPStolDC 組額外加入VitD3（1×10-8mol/L）于6 孔板中培養(yǎng)，每隔2～3 d 進(jìn)行換液，于培養(yǎng)的第7 天收集4 組DC 計(jì)數(shù)并按1×106個(gè)/mL 鋪板，向LPS-tolDC 組以及LPS-iDC 組加入LPS（1 μg/mL）刺激24 h，然后進(jìn)行下一步表型鑒定及功能試驗(yàn)。

1.2.2 DC的表型鑒定

在DC 培養(yǎng)的第8 天收集部分iDC、tolDC 以及用LPS 刺激后的LPS-tolDC、LPS-iDC，顯微鏡下觀察其形態(tài)后1 500 r/min 離心5 min，收集其上清液于-80 ℃保存，后續(xù)用ELISA 做細(xì)胞因子檢測(cè)。收集的DC用PBS洗滌后調(diào)整至1×106個(gè)/100 μL，置于流式管中，加入流式抗體FITC-CD11c、PE-CD80、Percp-cy5.5-CD86、APC-MHCⅡ、APC-PD-L1，避光4 ℃孵育30 min 后加入4 mL PBS 洗滌，1 500 r/min離心5 min，200 μL PBS 重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)各組DC進(jìn)行純度及表型鑒定。

1.2.3 BDC2.5 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟細(xì)胞的獲取

BDC2.5 T 細(xì)胞克隆過繼轉(zhuǎn)移給未發(fā)病的NOD鼠或者NOD-SCID 鼠都會(huì)迅速導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生，目前被廣泛應(yīng)用在糖尿病相關(guān)研究中。本研究采用來自BDC2.5 TCR轉(zhuǎn)基因鼠的BDC2.5 T細(xì)胞作為研究對(duì)象。準(zhǔn)備1 個(gè)裝有200 目濾膜的培養(yǎng)皿，加入5 mL 美天旎autoMACS Runnning Buffer 并置于冰上，選擇6～13周齡的BDC2.5 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，取其脾臟細(xì)胞，置于培養(yǎng)皿中，再覆上1張濾膜，用5 mL注射器的尾部進(jìn)行研磨獲得單細(xì)胞懸液，將脾臟細(xì)胞離心后裂紅處理，Buffer洗滌后用濾膜過濾，最終進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照說明書用CD4+T細(xì)胞陰選磁珠分選出CD4+T細(xì)胞，在96孔U型底培養(yǎng)板中按每100 μL 培養(yǎng)基中2.5×105個(gè)T 細(xì)胞每孔進(jìn)行鋪板。需進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞在鋪板前用CFSE 染色：CFSE 儲(chǔ)存液用PBS 稀釋至2.5 μmol/L，1 mL 的CSFE 稀釋液可染至多1×107個(gè)T細(xì)胞，染色后置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育3～4 min，然后用10 mL的RPMI1640完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，洗滌后同上述步驟進(jìn)行計(jì)數(shù)鋪板。

1.2.4 DC與T細(xì)胞的共培養(yǎng)

在DC培養(yǎng)的第8天將2.5HIP（1 μg/mL）分別加入iDC、tolDC、LPS-tolDC、LPS-iDC 組共孵育4 h（對(duì)照組加入乙型肝炎病毒抗原肽作為無關(guān)肽共孵育4 h）。用PBS 洗滌后計(jì)數(shù)，按照1∶10與上述獲得的T 細(xì)胞共培養(yǎng)，即每孔2.5×104個(gè)DC、2.5×105個(gè)T 細(xì)胞。共培養(yǎng)72 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的增殖、活化情況以及誘導(dǎo)Treg生成的情況。染有CFSE的CD4+T細(xì)胞用APC-CD4流式抗體進(jìn)行染色并避光孵育30 min，洗滌后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。未染CFSE的T細(xì)胞用APC-CD4、FITC-CD44、PE/cyanine7-CD69、BV421-CD25 流式抗體先進(jìn)行細(xì)胞表面染色并避光孵育30 min，洗滌后用Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子染色試劑盒進(jìn)行破核處理，用PE-Foxp3進(jìn)行染色并避光孵育30 min，洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究應(yīng)用FlowJo 10.4 進(jìn)行流式數(shù)據(jù)的分析，Graphpad Prism 9 進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組定量資料的比較采用t檢驗(yàn)（符合正態(tài)性和方差齊性），多組定量資料組間差異比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)，多組間的兩兩比較應(yīng)用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1α，25-二羥基維生素D3 誘導(dǎo)的tolDC 具有穩(wěn)定的耐受表型

顯微鏡下觀察培養(yǎng)第8 天的DC 可見：由GMCSF、IL-4 誘導(dǎo)的iDC 呈圓球形，表面可見樹突狀結(jié)構(gòu)伸出，LPS可以通過DC膜上的Toll樣受體刺激其成為L(zhǎng)PS-iDC（mDC），其表面樹突狀結(jié)構(gòu)更加明顯且傾向聚集形成集落。在培養(yǎng)基中額外加入VitD3可誘導(dǎo)出紡錘形的tolDC，LPS 刺激后其形態(tài)如圖1A 所示。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC 表面的CD11c分子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示培養(yǎng)8 d 的iDC 純度可達(dá)80%～90%左右，且tolDC的純度更高，多達(dá)90%以上（圖1B）。

圖1 培養(yǎng)8 d后的DC形態(tài)及純度Figure 1 Morphology and purity of DC after 8 days of culture

進(jìn)一步對(duì)DC 的表面分子進(jìn)行流式檢測(cè)（圖2A～D），結(jié)果顯示tolDC 的CD80、CD86 分子表達(dá)明顯低于iDC（平均熒光強(qiáng)度CD80：172.3±7.8vs.277.8±61.2，CD86：36.4±3.9vs.87.8±31.4，P均＜0.05）。tolDC 的MHCⅡ分子表達(dá)低于iDC 但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在LPS 刺激24 h 后，LPS-tolDC 的CD80、CD86 及MHCⅡ分子表達(dá)均明顯低于LPS-iDC（P均＜0.01）。tolDC 表面的PD-L1 分子表達(dá)顯著高于iDC（平均熒光強(qiáng)度：363.3±33.0vs.126.2±18.0，P＜0.001），且LPS刺激24 h后仍高于LPS-iDC（平均熒光強(qiáng)度：1 389.0±348.2vs.738.8±32.9，P＜0.05）。分別檢測(cè)LPS 刺激后的tolDC 和iDC 細(xì)胞因子分泌情況，發(fā)現(xiàn)tolDC 分泌的炎癥細(xì)胞因子IL-12p70 顯著下降［（49.1±3.0）pg/mLvs.（127.7 ± 7.4）pg/mL，P＜0.001］，而具有免疫抑制作用的TGF-β細(xì)胞因子則明顯升高［（970.7±109.9）pg/mLvs.（747.9±48.6）pg/mL，P＜0.05，圖2E、F］。

圖2 DC的表面分子鑒定及細(xì)胞因子分泌情況Figure 2 Surface molecular identification and cytokine secretion of DC

2.2 負(fù)載2.5HIP 的tolDC 及LPS-tolDC 可抑制BDC2.5 T細(xì)胞的增殖和活化

將培養(yǎng)了8 d 并負(fù)載2.5HIP 或無關(guān)肽的iDC、tolDC、LPS-tolDC、LPS-iDC 分別與BDC2.5 CD4+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，72 h 后檢測(cè)T 細(xì)胞的增殖、活化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5HIP-tolDC 組［（37.40±5.18）%］以及2.5HIP-LPS-tolDC組［（49.23±4.85）%］的T細(xì)胞增殖率與2.5HIP-iDC 組［（71.53±7.56）%］及2.5HIPLPS-iDC 組［（84.03±4.88）%］相比明顯下降（P＜0.001，圖3A）。2.5HIP-tolDC 組［（19.57±2.67）%］以及2.5HIP-LPS-tolDC組CD44+CD69+活化T細(xì)胞的比例［（49.37±4.84）%］與2.5HIP-iDC 組［（81.67±4.23）%］以及2.5HIP-LPS-iDC組［（83.90±2.42）%］相比也明顯降低（P＜0.001，圖3B）。負(fù)載無關(guān)肽的4組DC 均與T 細(xì)胞無反應(yīng)，組間無差異性，因?yàn)楣才囵B(yǎng)所用的BDC2.5 T細(xì)胞是2.5HIP特異性的T細(xì)胞。

圖3 BDC2.5 CD4+T細(xì)胞與負(fù)載2.5HIP的DC共培養(yǎng)后的增殖活化情況及產(chǎn)生Treg的比例Figure 3 Proliferation，activation and proportion of Treg of BDC2.5 CD4+T cells co-cultured with 2.5HIP-loaded DC

2.3 負(fù)載2.5HIP的tolDC可誘導(dǎo)更高比例的Treg細(xì)胞產(chǎn)生

tolDC 誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制之一是誘導(dǎo)Treg 的產(chǎn)生［11］，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了與各組DC 共培養(yǎng)的T 細(xì)胞中Treg（CD4+CD25+Foxp3+）的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2.5HIP-tolDC 組可以誘導(dǎo)最高比例的Treg 細(xì)胞產(chǎn)生［（10.77±0.82）%］，與2.5HIP-iDC［（5.62±1.73）%］及2.5HIP-LPS-iDC 組［（4.11±0.52）%］相比差異顯著（P＜0.001，圖4）。但2.5HIP-LPS-tolDC 組的Treg 比例［（6.05±1.27）%］與2.5HIP-LPS-iDC 組［（4.11±0.52）%］相比差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。負(fù)載無關(guān)肽的各組DC幾乎不誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg且組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 BDC2.5 CD4+T細(xì)胞與負(fù)載2.5HIP的DC共培養(yǎng)后產(chǎn)生Treg的比例Figure 4 Proportion of Treg in BDC2.5 CD4+T cells co-cultured with 2.5HIP-loaded DC

3 討論

T1DM 作為一種自身免疫疾病，使用外源性胰島素進(jìn)行治療并不能阻止胰島自身免疫的發(fā)展，而通過誘導(dǎo)自身抗原免疫耐受有望治愈T1DM。tolDC細(xì)胞療法作為一種極具潛力的誘導(dǎo)免疫耐受方法受到了人們的關(guān)注，但目前大多數(shù)基于tolDC 的治療都是非抗原特異性的。負(fù)載抗原的tolDC 療法可以避免廣泛的免疫抑制并有望誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受，但其效果是否更佳尚沒有定論。研究表明負(fù)載胰島素原的tolDC 在體外可以誘導(dǎo)具有各種表型的抗原特異性Treg，表達(dá)調(diào)節(jié)標(biāo)志物如Lag-3、CD161，并有效抑制效應(yīng)CD8+和CD4+T 細(xì)胞［16］，且一項(xiàng)對(duì)T1DM 患者皮內(nèi)注射負(fù)載胰島素原肽tolDC的臨床研究顯示負(fù)載抗原的tolDC 療法似乎是安全可行的［17］；但也有臨床前研究發(fā)現(xiàn)負(fù)載GAD65 的tolDC降低了tolDC對(duì)T1DM的保護(hù)作用［18］。而新生表位在T1DM 發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用，研究負(fù)載新生表位的tolDC 也許會(huì)為抗原特異性tolDC 療法打開新思路。所以本研究的創(chuàng)新之處在于首次針對(duì)新生表位2.5HIP，探究抗原特異性tolDC 細(xì)胞療法對(duì)致糖尿病性BDC2.5 T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

已有多個(gè)研究為tolDC 的體外誘導(dǎo)提供了參考，GM-CSF 及IL-4 可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞來源或小鼠骨髓祖細(xì)胞來源的iDC 的生成，同時(shí)加入藥物（如地塞米松、雷帕霉素、VitD3等）或免疫調(diào)節(jié)劑（IL-10、TGF-β等）可產(chǎn)生tolDC［14，19］。tolDC 的特征是其半成熟（semi-mature）的表型，低表達(dá)CD80、CD86、CD40和MHC等分子，高表達(dá)PD-L1等共抑制分子，分泌低水平的抗炎細(xì)胞因子、高水平的免疫抑制細(xì)胞因子，tolDC通過這些機(jī)制使得T細(xì)胞克隆失能、凋亡。iDC雖然也低表達(dá)共刺激分子，但其未成熟狀態(tài)是不穩(wěn)定的，在體內(nèi)治療或者炎癥情況下可能被激活，所以tolDC 的穩(wěn)定性也是保證其誘導(dǎo)免疫耐受的一個(gè)重要方面。本研究用維生素D3 誘導(dǎo)出的tolDC 低表達(dá)CD80、CD86，高表達(dá)PD-L1，在LPS 刺激后仍能保持穩(wěn)定的半成熟耐受表型，且炎性細(xì)胞因子IL-12p70分泌減少，免疫抑制細(xì)胞因子TGF-β分泌增多。tolDC 的MHCⅡ分子表達(dá)低于iDC，雖然兩者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在LPS刺激后，兩者的MHCⅡ分子表達(dá)有顯著差異，tolDC 這種在外來危險(xiǎn)信號(hào)或炎癥刺激下仍保持表型穩(wěn)定性也是其耐受性的一種表現(xiàn)。

研究提示在tolDC 體內(nèi)治療前用LPS 進(jìn)行刺激十分必要［20］，LPS 刺激是其獲得遷移活性和增強(qiáng)抗原提呈所必需的，且不會(huì)降低其耐受功能。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，盡管LPS-tolDC 誘導(dǎo)抗原特異性Treg產(chǎn)生的能力并不如tolDC 顯著，但tolDC 和LPS-tolDC均可以顯著抑制致病性BDC2.5 CD4+T細(xì)胞的增殖和活化。所以LPS 刺激后的tolDC 不僅可以保持穩(wěn)定的耐受表型，而且也維持了其抑制T 細(xì)胞增殖活化的能力，其是否具有更好的遷移能力還需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。需要作出解釋的是，本研究結(jié)果顯示iDC 刺激T 細(xì)胞增殖及活化的能力接近LPS-iDC，這是由于iDC的耐受表型的不穩(wěn)定性［11］，在吞噬抗原后可以獲得更活躍的表型和遷移能力，從而刺激了T細(xì)胞的增殖和活化［21］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)負(fù)載HIP的tolDC可以通過其穩(wěn)定的耐受表型和功能來抑制BDC2.5 T 細(xì)胞的增殖活化，誘導(dǎo)抗原特異性Treg 的產(chǎn)生，這為今后T1DM 的抗原特異性細(xì)胞療法提供了參考，但對(duì)于T1DM的具體治療效果還需要更進(jìn)一步的探究。