邊蘇蘇，陳玉鳳，張雯晴，蒯興旺，常新霞，唐 奇，馮振卿*

1南京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，2國家衛(wèi)生健康委員會抗體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166

卵巢癌在全球女性惡性腫瘤中，發(fā)病率和病死率分居第7位和第8位，5年生存率低于45%。在中國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中卵巢癌的發(fā)病率和病死率分別居第3 位和第1 位，每年的新發(fā)病例為52 100 例，死亡達(dá)22 500 例。手術(shù)聯(lián)合鉑類化療作為一線治療方案，很大程度上緩解了患者病情，但仍有高達(dá)70%的病例會復(fù)發(fā)［1-2］。卵巢癌復(fù)發(fā)與耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，深入探討卵巢癌耐藥的發(fā)生機(jī)制，提高化療的敏感性，對于改善卵巢癌患者的預(yù)后具有重要意義。

賴氨酸羥基化酶2（procollagenlysine 2-xoglutarate 5-dioxygenase 2，PLOD2）是PLOD 家族的一員，由PLOD2基因編碼，是膠原交聯(lián)形成過程中的關(guān)鍵酶［3］。PLOD2 可促進(jìn)多種腫瘤的侵襲進(jìn)展，包括乳腺癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌等［4-6］。鉑類藥物常作為卵巢癌一線化療的首選藥物，其中奧沙利鉑作為第三代鉑類化療藥，被廣泛應(yīng)用于卵巢癌治療，但容易產(chǎn)生獲得性耐藥。PLOD2 表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)，但PLOD2對卵巢癌化療耐藥的影響及分子機(jī)制尚不清楚。本研究擬采用干擾或過表達(dá)PLOD2的方法，觀察PLOD2對卵巢癌奧沙利鉑化療耐藥的影響，初步探討其分子機(jī)制，為卵巢癌臨床化療耐藥的研究及逆轉(zhuǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人卵巢 癌細(xì)胞 株A2780、OV1063、PEO4、HO8910、SKOV3，工具細(xì)胞293T 由本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、100×青霉素/鏈霉素雙抗、胎牛血清（Gibco公司，美國）；pPLK/GFP+Puro-PLOD2 shRNA和pLenti-CMV-PLOD2-Flag-GFPPuro 質(zhì)粒（南京晶百生物公司）；Lenti-Pac 慢病毒包裝試劑盒（GeneCopoeia 公司，美國）；嘌呤霉素（Sigma 公司，美國）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、蛋白上樣緩沖液（南京碧云天生物公司）；鼠抗人PLOD2 單克隆抗體（Proteintech 生物公司，美國）；鼠抗人PLOD2 單克隆抗體（R&D 生物公司，美國）；兔抗人MRP1 多克隆抗體、兔抗人BCRP多克隆抗體（沈陽萬類生物公司）；HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（Abcam 公司，美國）；CCK-8 試劑盒（同仁公司，日本）；細(xì)胞/組織總RNA 提取試劑盒、High-Capacity cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 熒光定量PCR 試劑盒（南京諾唯贊生物公司）；Annexin V-kFluor647/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

按照10%胎牛血清和1%雙抗的比例配制RPMI 1640、DMEM 完全培養(yǎng)基，卵巢癌細(xì)胞株A2780、OV1063、PEO4、HO8910 和SKOV3 培養(yǎng)于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，293T 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃和5% CO2的恒溫生物培養(yǎng)箱中。每2 d換液，待細(xì)胞融合度達(dá)90%，進(jìn)行胰酶消化及傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PLOD2低表達(dá)細(xì)胞株和高表達(dá)細(xì)胞株的鑒定

培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞OV1063、HO8910、SKOV3、PEO4、A2780，待其處于對數(shù)生長期，根據(jù)細(xì)胞量用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，按照1∶4 的比例加入5×上樣緩沖液，95 ℃煮沸10 min，分裝后存放于-20 ℃。取等量蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE 法分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%的脫脂奶粉溶液封閉后孵育鼠抗人PLOD2 單克隆抗體（1∶1 000）、鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃過夜；次日孵育HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 抗體（1∶10 000），滴加ECL 發(fā)光液后曝光。ImageJ 進(jìn)行蛋白定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 PLOD2干擾和過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

PLOD2干擾和過表達(dá)質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒均由晶百生物公司合成，其中干擾質(zhì)粒目標(biāo)基因長度為61 bp（Gene ID：852；Accessions：NM_000435），PLOD2 shRNA序列為5′-CCAGTTACACTGAAGGTCTTT-3′；過表達(dá)質(zhì)粒目標(biāo)基因長度為2 238 bp（Gene ID：5352；Accessions：NM_000935）。DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，均勻涂抹菌液于含氨芐青霉素（ampicillin，AMP）的LB 平板，倒置平放12～16 h，進(jìn)行單克隆挑選，并放置于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床200 r/min，12～16 h，可見菌液渾濁，保存菌液于-80 ℃。取少量送南京金斯瑞公司進(jìn)行測序，以驗(yàn)證PLOD2 干擾序列克隆入pPLK/GFP+Puro 載體和PLOD2 過表達(dá)序列克隆入pLenti-CMV-GFP-Puro載體。

1.2.4 慢病毒包裝及滴度測定

10 cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)293T 細(xì)胞，待融合度達(dá)80%左右，用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)按照Lenti-Pac 慢病毒包裝試劑說明書進(jìn)行慢病毒包裝。6～8 h 換液，48 h 和72 h 各收1 次病毒，混合后2 000 r/min，離心10 min去除細(xì)胞碎片，并用0.45 μm 濾器過濾。慢病毒濃縮液濃縮4 ℃過夜。次日，5 000 r/min 離心40 min，離心機(jī)提前4 ℃預(yù)冷。小心吸棄上清，用RPMI 1640 進(jìn)行重懸得慢病毒。1×104個(gè)/孔293T 細(xì)胞鋪于96 孔板，設(shè)定10 個(gè)孔，第1 個(gè)是空白對照，從第2 個(gè)孔開始，慢病毒1∶10 倍比稀釋，培養(yǎng)48 h 根據(jù)293T細(xì)胞的熒光率計(jì)算慢病毒滴度。

1.2.5 病毒感染及穩(wěn)定株篩選

將A2780 細(xì)胞株和OV1063 細(xì)胞株分別接種于6 孔板，次日按照病毒感染復(fù)數(shù)MOI40 和MOI30 進(jìn)行慢病毒感染，感染含干擾質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒的慢病毒的細(xì)胞分別標(biāo)記為shPLOD2和OEPLOD2，感染空載體慢病毒的細(xì)胞分別標(biāo)記為shControl 和OEControl，并添加polybrene增強(qiáng)感染效率。48 h觀察熒光并進(jìn)行嘌呤霉素篩選。同時(shí)設(shè)立空白對照組，待空白對照組細(xì)胞全部死亡，并且轉(zhuǎn)染病毒組細(xì)胞呈現(xiàn)簇狀生長，進(jìn)行半量維持篩選2周。

1.2.6 檢測PLOD2表達(dá)變化

1.2.6.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，根據(jù)細(xì)胞/組織總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，再根據(jù)High-Capacity cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。最后根據(jù)SYBR熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Premix 10 μL，PLOD2 或18S 上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA模板2 μL，去離子水7.2 μL。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相關(guān)引物序列：PLOD2上游引物5′-CTCGAGCATCCCCACAGATAA-3′，下游引物5′-TTGACCAAGGACCTTCACAGT-3′；18S 上游引物5′-AACCCGTTGAACCCCATT-3′，下游引 物5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃30 s 預(yù)變性；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。反應(yīng)結(jié)束后檢測目的基因和相應(yīng)內(nèi)參18S 的CT值，基因表達(dá)的相對定量值以2-ΔΔCT計(jì)算。

1.2.6.2 免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）

取shPLOD2 組、shControl 組、OEPLOD2 組、OEControl 組對數(shù)生長期細(xì)胞，提取蛋白、測定蛋白濃度、進(jìn)行Western blot 并計(jì)算灰度值與1.2.2 方法相同。

1.2.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)

胰酶消化各組對數(shù)生長期細(xì)胞后，以5 000 個(gè)/孔細(xì)胞鋪于96孔板，每孔含100 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔。過夜后，設(shè)定奧沙利鉑濃度依次為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，后加入每孔10 μL CCK-8和90 μL 培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)定不含細(xì)胞只含CCK-8 的空白對照孔，37 ℃和5% CO2的恒溫生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，用Multiskan Spectrum 酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的吸光度。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率=［1-（加藥組-空白組）/（未加藥組-空白組）］×100%。

1.2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，按照500 個(gè)/孔的濃度種植于6孔板，貼壁后用奧沙利鉑1.25 μmol/L 藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。用4%多聚甲醛固定30 min后，用結(jié)晶紫染色20 min。進(jìn)行拍照并統(tǒng)計(jì)，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以4×105個(gè)/孔接種于6 孔板，待過夜貼壁后加入1.25 μmol/L 奧沙利鉑，對照組加入等量PBS作為對照。48 h后，收集舊培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，終止消化，1 000 r/min離心5 min后，用PBS重懸細(xì)胞并2 000 r/min離心5 min，重復(fù)1次。加入Annexin V-kFluor647/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑，4 ℃避光15 min，用BD FACS Aria ⅡSORP 分選型流式細(xì)胞儀和Beckman Coulter CytoFLEX 流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率測定。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.10 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

取4～6 周齡雌性BALB/c-NULL 裸鼠30 只，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF 級動(dòng)物房屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，保持相對濕度40%～60%，溫度（25±1）℃，生長所需的墊料、飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理，自由進(jìn)食和飲水，每日保持10 h的光照，14 h 無光的明暗周期，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所開展的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號為IACUC-2106029）。收集shPLOD2 和shControl 的對數(shù)生長期細(xì)胞，80%左右密度用胰酶進(jìn)行消化，RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液100 μL/只注射到裸鼠皮下，7 d 成瘤，舍棄未成瘤和瘤體直徑超過1 cm 的裸鼠。shPLOD2組和shControl 組再分為奧沙利鉑處理組和PBS 對照組，每組6 只。奧沙利鉑處理組每周1 次腹膜內(nèi)注射奧沙利鉑（10 mg/kg），對照組則注射等量PBS溶液。每3 d 用游標(biāo)尺測量腫瘤大小并記錄，腫瘤體積=長徑×短徑2/2［7］。1個(gè)月后，處死裸鼠，分離裸鼠皮下的瘤體，并進(jìn)行稱重。

1.2.11 檢測BCRP和MRP1的表達(dá)變化

1.2.11.1 qRT-PCR檢測BCRP和MRP1 mRNA變化

待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，根據(jù)細(xì)胞/組織總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，再根據(jù)High-Capacity cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄總RNA 為cDNA。最后根據(jù)SYBR 熒光定量PCR 試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Premix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA模板2 μL，去離子水7.2 μL。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。相關(guān)引物序列：BCRP 上游引物5′-CAGGTGGAGGCAAATCTTCGT-3′，下游引物5′-ACCCTGTTAATCCGTTCGTTTT-3′；MRP1 上游引物5′-CTCTATCTCTCCCGACATGACC-3′，下游引物5′-AGCAGACGATCCACAGCAAAA-3′；18S 上游引物5′-AACCCGTTGAACCCCATT-3′，下游引物5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。擴(kuò)增條件和計(jì)算方法與前文相同。

1.2.11.2 Western blot檢測BCRP和MRP1的蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞量用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，按照1∶4的比例加入5×上樣緩沖液，95 ℃煮沸10 min，分裝后存放于-20 ℃。取等量蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE法分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%的脫脂奶粉溶液封閉后孵育兔抗人MRP1 多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人BCRP 多克隆抗體（1∶1 000）、鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃過夜；次日孵育對應(yīng)的HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（1∶10 000）和兔抗小鼠IgG 抗體（1∶10 000），滴加ECL 發(fā)光液后曝光。ImageJ 進(jìn)行蛋白定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，用Tukey 法進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLOD2在不同卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)

提取不同卵巢癌細(xì)胞OV1063、HO8910、SKOV3、PEO4、A2780 中的總蛋白，進(jìn)行Westerrn blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，PLOD2在OV1063細(xì)胞中相對低表達(dá)，在A2780 細(xì)胞中相對高表達(dá)（圖1）。選擇OV1063 為PLOD2 低表達(dá)細(xì)胞株，A2780 為PLOD2高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 PLOD2在卵巢癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)情況Figure 1 Protein expression of PLOD2 in ovarian cancer cell lines

2.2 慢病毒干擾和過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將針對PLOD2 基因的干擾和過表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行DNA 測序，測序結(jié)果通過Blast 序列比對，證實(shí)shPLOD2 已正確克隆入pPLK/GFP+Puro 載體，表明重組shPLOD2質(zhì)粒構(gòu)建成功；OEPLOD2已正確克隆入pLenti-CMV-GFP-Puro 載體，表明OEPLOD2 質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 shPLOD2 質(zhì)粒和OEPLOD2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

慢病毒表達(dá)載體pPLK/GFP+Puro和pLenti-CMVGFP-Puro 帶有綠色熒光蛋白（GFP）基因，可以通過觀察綠色熒光來評估轉(zhuǎn)染效率。shPLOD2 組和shControl 組的熒光較空白對照組有顯著升高，轉(zhuǎn)染效率＞90%（圖2A）。OEPLOD2 組和OEControl 組的熒光較空白對照組有顯著升高，轉(zhuǎn)染效率＞90%（圖2B）。

圖2 PLOD2干擾和過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率Figure 2 Transfection efficiency of PLOD2 interference and overexpressed plasmids

2.4 shPLOD2質(zhì)粒的干擾效果和OEPLOD2質(zhì)粒的過表達(dá)效果

qRT-PCR 結(jié)果表明，在shPLOD2 細(xì)胞株中PLOD2 mRNA 表達(dá)水平較shControl 組明顯下降（P＜0.01，圖3A），OEPLOD2 細(xì)胞株 中PLOD2 mRNA表達(dá)水平較OEControl 組明顯升高（P＜0.01，圖3B）。Western blot 檢測各組細(xì)胞中PLOD2 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，shPLOD2 組細(xì)胞的PLOD2 蛋白表達(dá)水平較shControl 組明顯下調(diào)（P＜0.01，圖3C、E），OEPLOD2 組細(xì)胞的PLOD2 蛋白表達(dá)水平較OEControl組明顯上調(diào)（P＜0.01，圖3D、F）。

圖3 PLOD2質(zhì)粒的干擾和過表達(dá)效率Figure 3 Efficiencies of interference of shPLOD2 and overexpression of OEPLOD2

2.5 CCK-8 法檢測PLOD2 干擾或過表達(dá)對奧沙利鉑作用下卵巢癌細(xì)胞增殖抑制的影響

結(jié)果顯示，在奧沙利鉑相同藥物濃度作用條件下，shPLOD2 組細(xì)胞較shControl 組增殖抑制能力增強(qiáng)（圖4A），半數(shù)抑制濃度IC50由（1.444 ± 0.149）μmol/L 下降至（0.536±0.026）μmol/L（P＜0.001）。同時(shí)，OEPLOD2 組細(xì)胞較OEControl 組增殖抑制能力減弱（圖4B），IC50由（0.890 ± 0.048）μmol/L 升高至（4.341±0.289）μmol/L（P＜0.001）。

圖4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測奧沙利鉑作用下的卵巢癌細(xì)胞增殖抑制Figure 4 Proliferation inhibitions under Oxaliplatin treatment of ovarian cancer cells were detected by CCK-8 assay

2.6 克隆形成試驗(yàn)檢測PLOD2 干擾或過表達(dá)對奧沙利鉑作用下卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，在奧沙利鉑處理?xiàng)l件下，shPLOD2細(xì)胞較shControl 細(xì)胞集落形成明顯減少，分別為（19±3）個(gè)和（41±4）個(gè)（P＜0.01，圖5A），OEPLOD2細(xì)胞較OEControl 細(xì)胞集落形成明顯增加，分別為（31±4）個(gè)和（12±3）個(gè)（P＜0.01，圖5B）。而在無奧沙利鉑處理?xiàng)l件下，PLOD2干擾或過表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖5）。

圖5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測PLOD2對奧沙利鉑作用下卵巢癌細(xì)胞增殖的影響Figure 5 Effects of PLOD2 on proliferation under oxaliplatin treatment in ovarian cancer cells were detected by clone formation assay

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測PLOD2 干擾或過表達(dá)對奧沙利鉑作用下卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測shPLOD2 組、shControl組、OEPLOD2組、OEControl組在PLOD2干擾或過表達(dá)條件下的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，在無奧沙利鉑作用條件下，shPLOD2 組和shControl 組、OEPLOD2組和OEControl 組細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖6A、B）。在奧沙利鉑作用條件下，shPLOD2組比shControl 組細(xì)胞凋亡率有顯著上升，分別為（28.14±3.73）%和（16.25±2.98）%（P＜0.01，圖6A、C），OEPLOD2 組比OEControl 組細(xì)胞凋亡率有顯著下降，分別為（23.85±0.94）%和（40.55±1.52）%（P＜0.001，圖6B、D）。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測PLOD2對奧沙利鉑作用下的卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 6 Effects of PLOD2 on cell apoptosis under oxaliplatin treatment in ovarian cancer cells were detected by flow cytometry

2.8 PLOD2干擾對A2780細(xì)胞裸鼠成瘤的影響

檢測各組裸鼠腫瘤大小和瘤重并記錄生長曲線，在未用奧沙利鉑的條件下，shPLOD2 組腫瘤相較于shControl 組，腫瘤平均體積和瘤重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖7A、B、C）。在奧沙利鉑處理?xiàng)l件下，shPLOD2 組的平均體積小于shControl 組（P＜0.05，圖7A、C），瘤重低于shControl組（P＜0.05，圖7B）。

圖7 PLOD2干擾對奧沙利鉑作用下的卵巢癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力的影響Figure 7 Effects of knockdown of PLOD2 on the tumorigenic ability of nude mice under oxaliplatin treatment of ovarian cancer cells

2.9 PLOD2 干擾或過表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞BCRP、MRP1表達(dá)的影響

采 用qRT-PCR 和Western blot 檢 測BCRP、MRP1在各組細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，shPLOD2組BCRP 和MRP1 mRNA 表達(dá)較shControl 組明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.001，圖8A）；BCRP、MRP1蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P=0.001，P＜0.05，圖8E）。OEPLOD2組BCRP 和MRP1 mRNA 表達(dá)較OECcontrol 組明顯上調(diào)（P均＜0.01，圖8B）；BCRP 和MRP1 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01，P＜0.001，圖8F）。

圖8 PLOD2對奧沙利鉑作用下的卵巢癌細(xì)胞BCRP、MRP1表達(dá)水平的影響Figure 8 Effects of PLOD2 on BCRP，MRP1 expresssions of ovarian cancer cells under oxaliplatin treatment

3 討論

奧沙利鉑等鉑類藥物已被廣泛應(yīng)用于治療卵巢癌等實(shí)體腫瘤。然而，其療效往往因癌細(xì)胞耐藥性的發(fā)展而受到影響。耐藥性機(jī)制主要包括：DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、藥物蓄積減少、解毒功能增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡抑制增強(qiáng)、基因突變、腫瘤微環(huán)境等［8-9］。對化療耐藥機(jī)制的研究，有助于為抗癌新藥研發(fā)和化療方案的優(yōu)化提供新的見解。

PLOD2 是一種在人體組織中廣泛表達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白，能使得前膠原分子螺旋區(qū)和端肽區(qū)的賴氨酸殘基羥基化進(jìn)而促進(jìn)膠原交聯(lián)的形成［10］。PLOD2 表達(dá)可通過TGFβ1/Smad3 信號通路促進(jìn)肺纖維化，而米諾地爾作為PLOD2抑制劑可抑制這一過程的進(jìn)展［11］。此外，PLOD2被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系，包括乳腺癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌等［4-6］。PLOD2 與乳腺癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)。PLOD2 可通過直接和間接方式促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移［6］。PLOD2通過作用于膠原纖維的形態(tài)改變，有助于形成腫瘤轉(zhuǎn)移的“高速公路”［12］。另外有報(bào)道稱，PLOD2與化療耐藥有關(guān)［13-15］。

研究證實(shí)PLOD2 可增強(qiáng)膽管癌對吉西他濱的耐藥性，通過上調(diào)PLOD2 的表達(dá)，耐藥細(xì)胞株的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白N-cadherin、Snail、Vimentin 表達(dá)上調(diào)［13］。同時(shí)，有研究結(jié)果也表明，PLOD2 的表達(dá)與胃癌細(xì)胞氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）的化療耐藥性密切相關(guān)，其作用機(jī)制可能與通過上調(diào)BCRP 藥轉(zhuǎn)蛋白和下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax、上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)相關(guān)［14］。除此之外，PLOD2可能通過促進(jìn)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活FAK-PI3K/AKT 以及MAPK 信號通路誘導(dǎo)奧希替尼耐藥［15］。但是關(guān)于PLOD2 在卵巢癌奧沙利鉑耐藥中的作用，目前知之甚少。

本文選擇卵巢癌PLOD2 高表達(dá)細(xì)胞株A2780和低表達(dá)細(xì)胞株OV1063，通過慢病毒轉(zhuǎn)染shPLOD2和OEPLOD2 質(zhì)粒，探討PLOD2 對卵巢癌奧沙利鉑化療耐藥的影響及機(jī)制。結(jié)果顯示，干擾組細(xì)胞中PLOD2的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著下降，而過表達(dá)組PLOD2的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高，表明已成功構(gòu)建了卵巢癌干擾和過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株shPLOD2-A2780和OEPLOD2-OV1063。

CCK-8 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在奧沙利鉑相同濃度作用條件下，shPLOD2 組細(xì)胞增殖抑制率高于shControl組，IC50較shControl 組下降；OEPLOD2 組細(xì)胞增殖抑制率低于OEControl組，IC50較OEControl升高。后續(xù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)兩種細(xì)胞株的IC50，選取1.25 μmol/L 為奧沙利鉑實(shí)驗(yàn)濃度?？寺⌒纬珊图?xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在奧沙利鉑處理?xiàng)l件下，shPLOD2細(xì)胞比shControl細(xì)胞集落形成減少，細(xì)胞凋亡率增高；OEPLOD2細(xì)胞比OEControl細(xì)胞集落形成能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率降低。這些結(jié)果表明，PLOD2對在奧沙利鉑作用下的卵巢癌細(xì)胞有促進(jìn)增殖和抑制凋亡的作用。值得注意的是，在無奧沙利鉑作用條件下，shPLOD2組與shControl 組克隆形成能力、凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一點(diǎn)在OEPLOD2 和OEControl 細(xì)胞株上也得到了驗(yàn)證。通過將shPLOD2 細(xì)胞和shControl 細(xì)胞接種到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)在奧沙利鉑處理?xiàng)l件下，shPLOD2 組的腫瘤體積和瘤重均小于shControl組。上述研究結(jié)果提示，PLOD2可增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的耐藥性。據(jù)已有報(bào)道，PLOD2可促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖［16］，但對非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)瘤、肉瘤的增殖沒有影響［6，17-18］，同時(shí)對胃癌的凋亡也沒有影響［14］，這說明PLOD2在不同的腫瘤中所發(fā)揮的作用是有差異的。

ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要成員為ABCB1P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、ABCC1（MRP1）、ABCG2（BCRP）［19］。三者被認(rèn)為是腫瘤化療耐藥性的重要調(diào)控因子，其導(dǎo)致耐藥性的增強(qiáng)主要是通過藥物泵出細(xì)胞膜，使得細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度降低而實(shí)現(xiàn)的。據(jù)報(bào)道，MRP1 參與了奧沙利鉑對結(jié)直腸癌的耐藥［20］。MRP1 和BCRP 在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量顯著增加，MRP1 和BCRP 表達(dá)量的增加可能與化療耐藥有關(guān)，影響患者療效和預(yù)后［21］。更為直接的證據(jù)是，在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)MRP1 介導(dǎo)了卵巢癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株的多藥耐藥［22］。同時(shí)也有報(bào)道稱，BCRP 和MRP1 參與了卵巢癌對順鉑的耐藥［23］。

奧沙利鉑作為第三代鉑類化療藥，同時(shí)也是卵巢癌化療的一線用藥，其治療效果受藥轉(zhuǎn)蛋白的影響。本文已證實(shí)PLOD2 可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性，進(jìn)而推測PLOD2可能與藥轉(zhuǎn)蛋白的表達(dá)有密切關(guān)系。qRT-PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾PLOD2 表達(dá)，其BCRP、MRP1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)在過表達(dá)OEPLOD2 細(xì)胞株，BCRP、MRP1 mRNA 和蛋白表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果提示PLOD2 可能通過上調(diào)藥轉(zhuǎn)蛋白BCRP、MRP1 的表達(dá)，而促使卵巢癌對奧沙利鉑的耐藥性增強(qiáng)。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建PLOD2干擾和過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株，研究PLOD2 對卵巢癌奧沙利鉑化療耐藥的影響及機(jī)制。研究結(jié)果提示PLOD2 可增強(qiáng)卵巢癌對奧沙利鉑的化療耐藥性，這一作用可能與藥轉(zhuǎn)蛋白BCRP和MRP1 表達(dá)上調(diào)有關(guān)。本研究為探索PLOD2 在奧沙利鉑誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥中的作用提供了新視角，進(jìn)一步為逆轉(zhuǎn)卵巢癌化療耐藥提供了新的理論基礎(chǔ)。