王衍坤, 韋新宇, 胡 杰, 夏法剛, 周元昌, 季彪俊

(1.福建農(nóng)林大學農(nóng)學院，福建 福州 350002；2.福建省三明市農(nóng)業(yè)科學研究院,福建 沙縣 365509)

水稻(Oryzasativa)是重要的糧食作物，養(yǎng)活了世界上一半以上的人口[1-2]。實現(xiàn)水稻“三系”(不育系、恢復系、保持系)配套[3]，利用雜種優(yōu)勢是提高水稻產(chǎn)量的重要育種途徑[4]。恢復系是水稻“三系”育種重要的一環(huán)，了解恢復系間的遺傳多樣性有助于提高恢復系選育效率，也是進行精確雜交組配的重要保障。

SSR標記以PCR為基礎，具有基因組分布廣泛、引物設計簡便、實驗操作簡單和成本低等優(yōu)點，在遺傳圖譜構建[5]、關聯(lián)分析[6]等研究中得到了廣泛的應用。DNA指紋圖譜技術可以鑒別材料之間的遺傳差異，是鑒定水稻品種真實性和種子純度的重要手段[7-8]。近年來，研究人員利用SSR技術對水稻親本遺傳多樣性分析和品種指紋圖譜構建開展了大量的研究工作。馬紅勃等[9]利用12個SSR標記對42份水稻材料進行了DNA指紋圖譜構建，并通過遺傳多樣性分析將42份材料分成6個類群，很好地反映了它們之間的親緣關系。馬菊等[10]通過53對SSR標記將7組水稻衍生品種及其親本準確地分類。張弩等[11]利用10對SSR標記構建了宜昌地區(qū)49份雜交秈稻品種的指紋圖譜，為宜昌地區(qū)水稻品種保護和種子鑒定提供了依據(jù)。陳越等[12]利用22對SSR分子標記構建了中國南方地區(qū)100份水稻資源的SSR指紋圖譜身份證，發(fā)現(xiàn)南方地區(qū)不同省份水稻資源間的遺傳差異較大。以上研究主要涉及水稻品種和三系不育系的遺傳多樣性及指紋圖譜分析，但對恢復系的研究不多。

本研究以福建省三明市農(nóng)業(yè)科學研究院水稻研究所自主選育的8份恢復系(‘明恢’系列)和中國南方應用較廣的4份恢復系為研究對象，用40對SSR標記進行遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建，明確它們之間的遺傳親緣關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取的12份恢復系由福建省三明市農(nóng)業(yè)科學研究院水稻研究所提供。其中，8份為三明市農(nóng)業(yè)科學研究院選育的‘明恢’系列恢復系，另外4份是水稻生產(chǎn)中廣泛種植的恢復系(表1)。2018年5月，于三明市農(nóng)業(yè)科學研究院水稻研究所水稻育秧田，取各供試材料新鮮幼嫩的葉片，放于錫箔紙中置-80 ℃冰箱備用。

表1 參試恢復系及其系譜Table 1 Test materials and their pedigrees

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用SDS小量提取法[10]進行全基因組的DNA提取，并用1.0%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

1.2.2 PCR擴增及產(chǎn)物檢測 PCR總反應體系為20 μL,體系包括10×PCR Buffer 2 μL，Taq酶0.5 μL，dNTP混合物1.5 μL，模板DNA 2 μL，引物(10 μmol·L-1) 2 μL，無菌水12 μL。PCR反應程序為：①95 ℃，預變性5 min；②95 ℃，高溫變性30 s；③55 ℃，低溫退火50 s；④72 ℃，延伸1 min；⑤重復第2～第4步驟，35次；⑥72 ℃，延伸8 min，使產(chǎn)物延伸完整；⑦4 ℃，保存。PCR產(chǎn)物在6.0%(W/V)非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳90～100 min，使含有多態(tài)的條帶分離，再用銀染法顯色。顯色后的膠置于醫(yī)用X光玻璃上觀察擴增結果[6]。選用40對在水稻基因組均勻分布的多態(tài)性SSR標記。

1.2.3 標記數(shù)據(jù)分析及聚類分析 PCR標記數(shù)據(jù)讀取方法參照馬紅勃等[9]方法，通過NTSYS 2.1軟件計算所得數(shù)據(jù)的遺傳相似系數(shù)，并以該結果進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SSR分子標記多態(tài)性分析

選用40對SSR標記，對參試恢復系的DNA進行多態(tài)性掃描。按照有帶記為“1”、無帶記為“0”的讀帶原則進行標記數(shù)據(jù)的讀取(圖1)，共產(chǎn)生75個位點。每對SSR引物產(chǎn)生的條帶數(shù)目在1～4條之間，平均每對引物產(chǎn)生條帶數(shù)目為1.875條。

1.明恢82;2.明恢86;3.明恢118;4.明恢611;5.明恢826;6.明恢1259;7.明恢2155;8.明恢3009;9.華占;10.閩恢3301;11.R498;12.R527。

2.2 指紋圖譜的構建

利用11個多態(tài)性好的標記建立參試恢復系的DNA指紋圖譜(表2)。由表2可見，表中每列數(shù)據(jù)是某一SSR標記在12份材料中檢測出的帶型的數(shù)字化代號，1個代號代表1個等位基因。每一行中的數(shù)字按從左到右的順序構成一條字符串，共可建立12條字符串。當12條字符串相互之間沒有重復時，表明這11份SSR標記能將12份恢復系全部區(qū)分開，即每條字符串能唯一標識1個恢復系，如明恢82的分子身份證號碼是：01100110010。因此，可以將每一條字符串形象地稱為每份恢復系的分子身份證號碼。對于已存入DNA指紋庫中的每一個品種來說，其分子身份證號碼是唯一的。

表2 參試水稻恢復系的DNA指紋圖譜Table 2 DNA fingerprint map of 12 rice restorer lines

2.3 聚類分析

根據(jù)40 對SSR引物所檢測出的75個位點，用NTSYS 2.1軟件計算參試材料的遺傳距離矩陣(表3)，并繪制親緣關系樹狀圖(圖2)。12份恢復系之間的遺傳距離在0.07～0.89之間(表3)，說明參試材料之間具有較好的遺傳多樣性。從圖2可見，遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.62～0.93，在0.74處可以將這12份材料分為6個類群。第Ⅰ類群包括明恢82、明恢86、明恢118、明恢2155、閩恢3301、R527，共6份材料；第Ⅱ類群包括明恢826和R498；其他4份材料(明恢3009、明恢1259、華占和明恢611)各為一個類群。

表3 參試水稻恢復系的SSR標記遺傳距離Table 3 Genetic distance of 12 rice restorer lines based on SSR markers

在遺傳相似系數(shù)0.79處可以將第Ⅰ類群的6份材料分成3個亞類：明恢82為第①亞類，明恢86和明恢118為第②亞類，明恢2155、閩恢3301和R527為第③亞類。經(jīng)過系譜確認(表1)，閩恢3301的父本是R527，因此二者具有非常小的遺傳距離(0.07)，遺傳相似系數(shù)達到0.93。以上表明, 本試驗所用SSR分子標記聚類結果能較好地反映供試材料的親緣關系，能從分子遺傳層面為材料組配提供較好的遺傳信息。

3 討論

3.1 SSR標記有助于分析水稻材料的遺傳多樣性

SSR標記目前已廣泛地應用于水稻育種和遺傳分析中[10]。本研究利用40對SSR標記檢測12份水稻恢復系，共檢測出75個多態(tài)性位點，每對SSR標記檢出1～4個多態(tài)性位點，平均每對引物檢出1.875個多態(tài)性位點，相對較少，可能是由于試驗所用材料數(shù)量較少所致。本試驗構建的指紋圖譜能很好地將12份恢復系分開，并通過遺傳聚類圖明確標出它們之間親緣關系的遠近，為后續(xù)遺傳組合的組配提供了分子水平的依據(jù)。

3.2 SSR標記可以明確水稻的親緣關系

利用SSR標記分析恢復系間遺傳多樣性，并結合系譜(表1)分析可以明確材料間親緣關系。比如，明恢86、明恢118和明恢2155的親本材料中都有明恢63，因此從系譜來看，三者之間具有很高的親緣關系。利用40對SSR標記構建的遺傳聚類圖(圖2)，將明恢86、明恢118和明恢2155聚類到同一大類，表明三者遺傳相似度很高，與系譜記載結果吻合。系譜記載明恢611親本跟其他供試‘明恢’系列材料無共同親本(表1)，遺傳聚類圖將其單獨聚類成一組，其遺傳距離與其他供試材料較遠。這都說明SSR標記可以在分子層面驗證恢復系的系譜關系，可進一步指導基于親緣關系的恢復系選育。

閩恢3301是福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所自主選育的強恢復系，在生產(chǎn)上應用廣泛[13]，組配出很多優(yōu)異的超級雜交稻品種，比如與優(yōu)質不育系天豐A配組育成的天優(yōu)3301，示范推廣面積廣、增產(chǎn)顯著[14]。吳明基等[15]報道，系譜記載閩恢3301為明恢86與綿恢436的雜交后代，但田間觀察顯示閩恢3301一些性狀與R527較為類似，而與明恢86相似的特征較少。閩恢3301并不是系譜記載的明恢86與綿恢436的雜交后代，而是來源于綿恢436與R527的雜交后代。本研究表明，閩恢3301與R527的遺傳距離更近，與明恢86距離較遠，這與吳明基等[15]研究結果相一致。這說明利用SSR標記分析遺傳多樣性可以明確材料之間的親緣關系，消除因記載失誤等原因造成的材料系譜錯誤，降低雜交組合選配的錯誤率。

3.3 DNA指紋圖譜可用于檢驗水稻品種真實性和種子純度

SSR標記目前廣泛應用于產(chǎn)量性狀[16]、品質性狀[17]、抗性[18]等控制位點的分子標記定位以及突變體[19]基因的挖掘。以SSR標記為基礎的水稻DNA指紋圖譜，可以為水稻品種真實性和純度的鑒定提供可靠的技術保障。本研究中，40對SSR標記在參試材料中都具有多態(tài)性且全基因組分布，為水稻分子遺傳圖譜構建提供了新的標記選擇。周佩雯等[20]利用SSR標記進行了4份節(jié)水抗旱稻材料的DNA指紋檢測，并判定其中一個為旱優(yōu)73的“近似品種”。這說明SSR標記在水稻品種真實性鑒定中可以發(fā)揮重要作用，有利于提高市場監(jiān)管效率，凈化種子市場。本研究用40對SSR標記分析了12份供試恢復系的遺傳多樣性，并用11對核心標記構建了供試材料的指紋圖譜，可為相關材料的真實性鑒定提供依據(jù)。