梁 丹，甘信斌，戴先焙，王 杰，賀 亮，肖思敏，王前光

1.湖南省常德市畜牧水產(chǎn)事務中心，湖南常德 415000；2.湖南省常德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南常德 415000；3.湖南省新寧縣水廟鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務中心，湖南邵陽 422700；4.湖南省漢壽縣畜牧水產(chǎn)事務中心，湖南常德 415000；5.湖南省常德市鼎城區(qū)畜牧水產(chǎn)事務中心，湖南常德 415000；6.常德職業(yè)技術(shù)學院，湖南常德 415000

紫花苜蓿有“牧草之王”的美稱，是世界上栽培面積最廣泛的豆科牧草之一[1]。紫花苜蓿具有很高的營養(yǎng)價值，粗蛋白質(zhì)含量高、粗纖維含量較低、氨基酸組成平衡、各種維生素和礦物質(zhì)含量豐富、含有異黃酮和大豆黃酮類物質(zhì)及多種未知生長因子，適口性好，是牛、羊、豬、馬、兔、禽等動物的優(yōu)質(zhì)飼料[2]。牧草飼料具有綠色、環(huán)保等優(yōu)點，配合飼料中使用部分牧草粉，能減少畜禽糞便中氮磷的排放量，可節(jié)省糧食，減緩人畜爭糧等現(xiàn)象。同時，紫花苜?？商娲糠诛暳希源私档惋暳铣杀?，提高生豬養(yǎng)殖收益[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠母豬飼糧中添加苜蓿草粉，能改善母豬的繁殖性能、增加產(chǎn)仔數(shù)、降低仔豬死亡率、增加斷奶仔數(shù)[4]；江香豬基礎(chǔ)日糧飼料中添加苜蓿草粉可提升生態(tài)豬品質(zhì)[5]。苜蓿草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展已經(jīng)上升到國家戰(zhàn)略，2019年以來，中央一號文件多次指出“合理調(diào)整糧經(jīng)飼結(jié)構(gòu)，發(fā)展青貯玉米、苜蓿等優(yōu)質(zhì)飼草料生產(chǎn)”“鼓勵發(fā)展青貯玉米等優(yōu)質(zhì)飼草飼料”。湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳繼續(xù)推進苜蓿試種項目實施，并將“調(diào)整優(yōu)化飼料配方結(jié)構(gòu)，增加地方原料和新飼草飼料資源使用量”列入年度畜牧獸醫(yī)工作重點。常德市“十四五”發(fā)展規(guī)劃中，更明確提出要“穩(wěn)步發(fā)展青貯玉米、紫花苜蓿等優(yōu)質(zhì)飼料作物種植，初步形成南方現(xiàn)代飼草料綠色產(chǎn)業(yè)體系”。本試驗旨在研究紫花苜蓿發(fā)酵草粉替代基礎(chǔ)日糧對黑豬生長性能、血清生化指標、豬肉品質(zhì)（氨基酸組成、脂肪酸組成以及揮發(fā)性風味物質(zhì)組成）的影響，為科學利用苜蓿草粉資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

紫花苜蓿發(fā)酵草粉購于湖南德人牧業(yè)科技有限公司；血清中總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性（glutamic oxaloacetic transaminase activity，GOT）、丙谷轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase activity，GPT）、血尿素氮（blood urea nitrogen content，BUN）、葡萄糖（D-glucose content，GLU）、肌酐（creatinine，Crea）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol content，HDL-C）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein/very low density lipoprotein content，LDL-C）、肌酸激酶活性（creatine kinase activity，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase activity，LDH）測定試劑盒購于北京盒子生工（Boxbio）科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、甲醇、氯化鈣、石油醚、苯酚、無水硫酸鈉、丙酮（均為分析純），湖南匯虹試劑有限公司；正己烷、乙腈、二氯甲烷（均為色譜純），上海麥克林生化科技有限公司。7820A GC-5977E MSD 氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；Ac-Quity H class 超高效液相色譜儀，Waters。

1.2 試驗動物及分組

試驗動物選用保育結(jié)束（70日齡左右）健康商品黑豬120 頭，隨機分為4 組，每組3 個重復，每個重復10 頭豬，預飼期30 d 后飼喂150 d。

1.3 試驗地點

在湖南省常德市鼎城區(qū)十美堂鎮(zhèn)小茅村湖南旭湘農(nóng)牧黑豬養(yǎng)殖場進行。

1.4 試驗日糧

4 組日糧分別為0%紫花苜蓿發(fā)酵草粉+100%原飼料配方（對照組）、10%紫花苜蓿發(fā)酵草粉+90%原飼料配方（試驗1 組）、20%紫花苜蓿發(fā)酵草粉+80%原飼料配方（試驗2 組）、30%紫花苜蓿發(fā)酵草粉+70%原飼料配方（試驗3 組）。原飼料配方為常德通威飼料公司生產(chǎn)的大豬配合飼料215。

1.5 樣品采集與處理

試驗最后1 d 從0%、10%、20%水平組的每個重復組中選取2 頭試驗黑豬，取里脊肉樣0.5 kg 進行氨基酸、脂肪酸、揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測；從0%、10%、20%、30%水平組每個重復隨機選取10 頭試驗黑豬，取前腔靜脈血8 mL，血樣在室溫靜置1 h后，4 000 r/min 離心15 min，將分離出的血清置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 測定項目及方法

1）黑豬生長性能測定。經(jīng)預飼30 d 后，分別在飼喂第0、60、90、120 及150 天測定體重。

2）血清指標測定。TP、ALB、GOT、GPT、BUN、GLU、Crea、TC、TG、HDL-C、LDL-C、CK、LDH 的測定均按試劑盒操作規(guī)程進行。

3）氨基酸組成分析。取0.025 g 豬肉樣品，置于5 mL 安醅瓶中，加3 mL 6 mol/L 鹽酸溶液或40%（體積分數(shù)）氫氧化鈉溶液，酒精噴燈拉絲封口，110 ℃水解24 h，樣品中蛋白全部水解成氨基酸殘基后，取過膜后的上清液3 mL 按照Elite-AAK 氨基酸分析系統(tǒng)的衍生方法進行氨基酸衍生化，高效液相色譜法測定氨基酸含量。色譜分析條件：Elite-AKK 氨基酸分析色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫27 ℃，進樣體積10 μL，流動相流量1.2 mL/min，檢測波長360 nm。

4）揮發(fā)性風味物質(zhì)萃取及分析。取黑豬里脊肉5 g 至于萃取瓶中，加入5%的NaCl 以及33 μL 內(nèi)標（3.03 μg）。將萃取瓶在90 ℃水浴鍋中加熱熟制60 min，然后降溫至60 ℃，用手動SPME 進樣器，在85 ℃下通過靜態(tài)頂空方法恒溫萃取40 min，萃取完退出SPME，并立刻進行氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）分析[6]。

氣相色譜條件：DB-5-MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣；初始溫度35 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 速度升至200 ℃，然后以20 ℃/min 的速度升至260 ℃，保持8 min。進樣體積為1.00 μL，不分流進樣，流量1.5 mL/min。質(zhì)譜條件：EI+離子源，溫度250 ℃；掃描質(zhì)量范圍30～500m/z，溶劑延遲2 min；電子能量70 eV；檢測器溫度280 ℃[7]。根據(jù)GC-MS 中各組分相對保留時間結(jié)合N1ST14.L 質(zhì)譜庫進行檢索定量分析。

5）脂肪酸組成分析。取里脊肉，參照文獻[7]進行脂肪酸甲酯化，在氣相色譜質(zhì)譜儀上測定分析。色譜條件：HP-5-MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始溫度150 ℃，以15 ℃/min 速度升至200 ℃；再以2 ℃/min 的速度升至250 ℃。進樣體積為1.00 μL，分流比為20∶1，載氣為氦氣，流量1 mL/min。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，進樣口溫度280 ℃，采用EI+源（70 eV），選取Scan 模式，掃描范圍為45～500m/z，溶劑延遲2.5 min。根據(jù)GCMS 中各組分保留時間以及質(zhì)譜圖，在N1ST14.L庫檢索鑒定，通過峰面積歸一法計算各脂肪酸的百分比。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標準差”表示，并用單因素方差分析和Tukey’s 檢驗不同投飼處理之間的差異，以P＜0.05 作為判斷差異顯著性標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豬生長性能

對飼喂過程中黑豬的體重數(shù)據(jù)進行記錄分析，結(jié)果如圖1所示，在飼喂初始階段（60～90 d），對照組體重增長快于試驗組。雖然在150 d 時各組黑豬體重平均值間有差距，但差異并不顯著（P>0.05）。

圖1 紫花苜蓿對黑豬生長性能的影響

2.2 血清指標分析

飼糧中添加紫花苜蓿草粉后，黑豬血清各項指標如表1所示。20%添加量組TP 含量顯著高于對照組，但30%組無顯著區(qū)別。BUN 含量在20%組別顯著降低，與TP 指標相符。GLU 含量隨著紫花苜蓿添加量提升有先下降后恢復的趨勢，但都不顯著。ALB在20%、30%組顯著提升，與TP、BUN 數(shù)據(jù)結(jié)果相符。20%添加量組的黑豬血清中Crea 顯著降低。隨著紫花苜蓿添加量的提高，黑豬血清中CK 先顯著升高后顯著降低。HDL-C 顯著升高，LDL-C 則顯著降低，且均在20%組達到峰值。TG 和TC 含量在10%組顯著提高，而20%、30%組與對照無顯著區(qū)別。試驗組與對照組相比，GPT 顯著降低。GOT 雖然在30%組有下降趨勢但并不顯著。隨著紫花苜蓿添加量的提升，LDH 活性顯著提高。

表1 紫花苜蓿草粉對黑豬血清指標影響

2.3 氨基酸組成分析

紫花苜蓿添加量對黑豬豬肉中總氨基酸組成的影響如表2所示，經(jīng)水解并結(jié)合液相色譜法，每組各檢測出18 種氨基酸，其中在10%添加量時總氨基酸含量為（502.83±31.54）mg/g，顯著高于對照組的（446.72±26.30）mg/g，但與20%組無顯著差異；必需氨基酸在10%添加量組含量最高，但必需氨基酸相對于對照組無顯著差異，20%組顯著低于10%組，但與對照組無顯著差異。氨基酸組成中賴氨酸含量最高（214.95～238.52）mg/g，且各組間無顯著差異；其次是色氨酸（22.14～59.48）mg/g，20%組顯著低于10%組及對照組。10%添加量組的多數(shù)氨基酸含量均顯著高于對照組，與20%組和對照組無顯著區(qū)別。各氨基酸中最少的是半胱氨酸（1.17～1.35）mg/g，且無顯著差異。據(jù)必需氨基酸與總氨基酸的比值（essential amino acid/total amino acid，EAA/TAA）提出的理想模式標準，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)其EAA/TAA 的比值為40%左右，必需氨基酸和非必需氨基酸比值（essential amino acid /nonessential amino acid，EAA/NEAA）在60%左右。各試驗組的EAA/TAA 比值和EAA/NEAA 值的分布范圍分別為70.91% ～73.41% 和244.09% ～276.68%，且10%組與對照組無顯著差異，而20%組顯著低于對照組。

表2 紫花苜蓿對黑豬豬肉中總氨基酸組成影響分析mg/g

2.4 脂肪酸組成分析

豬肉中脂肪酸組成如表3所示，在0%及10%添加量組的豬肉中各檢測出9 種脂肪酸，而20%組檢測出10 種脂肪酸。其中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）3 種，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）4 種，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PU-FA）在20%組檢測出3 種，其余2 組各檢測出2 種；20%添加量組的總SFA 僅為36.33%±2.08%，顯著低于其余2 組；10%和20%添加量組的總MUFA 含量顯著高于對照組；20%添加組PUFA 的含量顯著高于對照組及10%組?？係FA、總MUFA 及總PUMA 中，MUFA 相對含量最高（43%～47%），而PUMA 含量最低，占10%～16%，因此在一定程度上表明，豬肉脂肪酸營養(yǎng)主要體現(xiàn)在MUFA 含量上。

表3 紫花苜蓿添加量對豬肉脂肪酸組成影響%

2.5 揮發(fā)性風味物質(zhì)含量

對不同組別的黑豬豬肉的風味化合物進行分類分析，結(jié)果見表4。共檢測到50 種揮發(fā)性風味化合物，其中醛類24 種，每組總含量分別為（3.794±2.201）、（5.166±1.395）、（1.763±1.171）μg/g，10%組含量最高且在脂肪香味的醛類含量上顯著高于對照組和20%組；芳香族共檢測出4 種，每組總含量分別為（0.428±0.104）、（0.416±0.84）、（0.285±0.1）μg/g，10%組與對照組無顯著差別，20%組在種類上明顯少于另外2 組；酯類3 種，3 組總含量分別為（0.071±0.006）、（0.110±0.026）和0 μg/g，10%組最高，20%組未檢出；在對照組及10%試驗組分別檢測出烷烴類6 種，20%組只檢測出2 種，總含量分別為（0.247 ±0.103）、（0.316 ±0.067）、（0.076 ±0.045）μg/g，10%含量最高；醇類共檢測出10 種，對照組檢測出6 種、10%組檢測出9 種、20%組檢測出1 種，含量分別為（0.307±0.11）、（0.610±0.149）、（0.044±0.007） μg/g，10%組含量最高，種類最多；此外，雜環(huán)類只檢測出1 種，酮類在對照組及10%試驗組各檢測出2 種，分別為（0.074±0.021）、（0.102±0.028） μg/g，10%組含量最高，且20%組未檢出。

表4 紫花苜蓿添加量對豬肉揮發(fā)性風味物質(zhì)組成影響μg/g

續(xù)表4

3 討 論

3.1 紫花苜蓿對黑豬生長性能的影響

不同的紫花苜蓿添加量在初始階段對黑豬的體重增長有一定影響，但后期無顯著差異，這與紫花苜蓿能量及纖維物質(zhì)較低有關(guān)[8]，在飼喂初始階段黑豬需要對替換后的飼料有一定的適應階段。而最終結(jié)果顯示體重無差異，說明紫花苜蓿替代基礎(chǔ)飼料方案可行，且在20%以內(nèi)的添加量無顯著區(qū)別，這與王自豪等[5]的研究結(jié)果一致。

3.2 紫花苜蓿對黑豬血清指標的影響

TP 可反映機體對蛋白質(zhì)的吸收代謝情況[9]，本試驗結(jié)果表明20%組別顯著高于對照組，但30%組別無顯著區(qū)別，推測紫花苜蓿添加量過高，黑豬對其消化率可能降低。BUN 能夠反映出動物機體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝與氨基酸之間的平衡，易受到飼料中蛋白類含量的影響，與體內(nèi)氮沉積率、氨基酸利用率呈現(xiàn)負相關(guān)[10]。本試驗中BUN 含量在20%添加量組顯著降低，而TP 顯著升高，表明此添加量下可提高生豬機體對飼料中蛋白質(zhì)的吸收代謝較好，促進蛋白合成[11]。GLU 含量隨著紫花苜蓿添加量提升有先下降后恢復的趨勢，但都不顯著。ALB 在一定程度上反映了機體的營養(yǎng)和免疫情況，具有調(diào)節(jié)血液膠體滲透壓和運輸營養(yǎng)物質(zhì)等作用。血清ALB 在20%、30%組顯著提升，說明機體的代謝和免疫能力提高[12]，與TP、BUN 數(shù)據(jù)結(jié)果相符。Crea 是肌肉代謝產(chǎn)生的一種毒素，主要靠腎臟清除。肌酐主要由腎小球濾過排出體外。血中肌酐來自外源性和內(nèi)源性2 種，外源性肌酐是肉類食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物；內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物。本試驗中20%添加量組顯著降低，推測此添加比例下肌酐生成量較少或腎臟清除能力提升。CK 通常存在于動物的心臟、肌肉及腦部等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP 再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?，是判斷動物應激、心臟和骨骼肌疾病的重要指標。試驗組隨著紫花苜蓿添加量的提高先顯著升高后顯著降低，推測紫花苜蓿在低添加量時促進心臟肌肉細胞CK 活性，高添加量意味著基礎(chǔ)飼料比例下降，導致CK 活性降低。血清脂

質(zhì)代謝指標包括TG、TC、HDL-C 和LDL-C 等，其中TG 和TC 含量反映了脂肪的合成和分解對機體的調(diào)控。LDL-C 代表經(jīng)血液轉(zhuǎn)運內(nèi)源膽固醇到組織利用，其次是HDL-C，主要是逆向?qū)⒛懝檀紡耐庵芙M織運輸?shù)礁闻K進行排泄和分解代謝[13]。試驗組HDL-C顯著升高，LDL-C 顯著降低，且均在20%組達到峰值，而10%組TG、TC 含量顯著提高，而20%、30%組與對照無顯著區(qū)別, 以上變化說明低添加量的紫花苜蓿時促進脂肪積累，而在高濃度時促進脂肪代謝[14]。GOT 和GPT 在肝臟、心臟、骨骼肌、腎臟中含量較多，其活性高低反映了蛋白質(zhì)的合成和分解代謝狀況。試驗組與對照組相比GPT 顯著降低，蛋白分解代謝減緩，推測紫花苜蓿添加促進了蛋白的合成的同時減緩了蛋白的分解代謝[15]。GOT 雖然在30%組別有下降趨勢但并不顯著。以上說明，適當添加紫花苜蓿可以提升黑豬機體免疫力，促進對蛋白質(zhì)吸收合成并積累脂肪。

3.3 紫花苜蓿添加量對黑豬豬肉中氨基酸組成影響

本試驗中在添加10%紫花苜蓿時，總氨基酸含量顯著高于對照組，且必需氨基酸含量也是最高。必需氨基酸對生物體生命活動有重要作用，能提供合成蛋白質(zhì)的重要原料，同時也為生命體進行正常代謝、維持生命提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[16-17]。各組總氨基酸中賴氨酸含量最高（214.95～238.52）mg/g，且各組間無顯著差異，賴氨酸作為動物體必需氨基酸，有促進人體發(fā)育、增強免疫力的功能，并有助于提高中樞神經(jīng)組織功能的作用[18]；其次是色氨酸，含量在22.14～59.48 mg/g，20%組顯著低于10%組和對照組，色氨酸在免疫調(diào)節(jié)、消化調(diào)節(jié)、抗應激、蛋白質(zhì)合成調(diào)節(jié)等方面具有重要作用[19-20]。此外，在天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、組氨酸含量上，10%添加量組均顯著高于對照組，而20%組與對照組無顯著區(qū)別。在EAA/TAA 比值和EAA/NEAA 比值方面，20%組顯著低于對照組，而10%組無顯著差異，說明紫花苜蓿添加量會影響豬肉的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值，綜合以上推測10%組較為理想。

3.4 紫花苜蓿添加量對黑豬豬肉中脂肪酸組成分析

豬肉中脂肪酸組成對評價豬肉的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)有重要意義，其中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）指含有飽和烴基的酸，碳鏈上只有飽和的C-C鍵或C-H 鍵。動物油脂中飽和脂肪酸較多，是構(gòu)成脂質(zhì)的基本成分之一。人類所需的SFA 主要來源于畜禽肉類，為人體提供能量。生豬不同部位脂肪酸種類占比差別較大[21]。本試驗中，紫花苜蓿在20%添加量時顯著降低了SFA 含量；單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）是指碳鏈中只含有1 個不飽和鍵的脂肪酸，具有降低低密度脂蛋白（LDL）、提高高密度脂蛋白（HDL）比例的功效，而紫花苜蓿添加組的MUFA 均高于對照組，與王自豪等[5]試驗結(jié)果相同，這與血清指標中HDL-C、LDL-C變化相一致。多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PU-FA）是指碳鍵含有2 個或2 個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22 個碳原子的直鏈脂肪酸，具有軟化血管、健腦益智、改善視力的功效[22]，20%添加量組顯著高于對照組及10%組，但因其含量只占16%，而MUFA 占48%左右。因此，黑豬豬肉中脂肪酸組成主要體現(xiàn)在MUFA 含量上，推測10%組最佳。

3.5 紫花苜蓿添加量對黑豬豬肉揮發(fā)性風味成分影響

對不同組別的黑豬豬肉的風味化合物進行分類分析，共檢測到醛類24 種、芳香族4 種、酯類3種、烷烴6 種、醇類10 種、雜環(huán)類1 種、酮類2 種，共50 種揮發(fā)性風味化合物，其中醛類種類最多且含量最高。10%組總含量為（5.166±1.395）μg/g，且在1-辛醛、E-2-辛烯醛、正壬醛、E-2-壬烯醛、E-2-癸烯醛等含有脂肪類香氣[23]的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量上，紫花苜蓿添加量為10%的試驗組顯著高于對照組及20%試驗組，紫花苜蓿適當替代基礎(chǔ)飼料可以提高黑豬豬肉的香氣，但過高的添加量反而會降低，這與飼料的營養(yǎng)物質(zhì)多樣性有一定關(guān)聯(lián)。在烷烴、酯類及醇類揮發(fā)性風味物質(zhì)種類及含量上，10%試驗組明顯高于對照組及20%試驗組，烷烴類可以賦予豬肉中清香和香甜氣味[24]，因此適當添加紫花苜蓿可以賦予黑豬豬肉獨特的風味。20%試驗組雖然在揮發(fā)性風味物質(zhì)種類及含量上少于對照組及10%試驗組，但也說明紫花苜蓿添加量可以改變黑豬豬肉的風味，使風體現(xiàn)更集中于醛類。綜上所述，10%組提高了黑豬豬肉的風味多樣性，20%組使得黑豬豬肉風味更純正。

4 結(jié) 論

在黑豬育肥階段，使用紫花苜蓿草粉替代部分配合飼料飼喂是可行的。紫花苜蓿替代部分基礎(chǔ)飼料提高了飼料中營養(yǎng)素的多樣性，雖然對增重效果無影響，但對提高黑豬的代謝能力、抗病能力有一定輔助作用，且紫花苜蓿在10%的添加量下促使了豬肉品質(zhì)的提升。從經(jīng)濟角度考慮，紫花苜蓿替代部分基礎(chǔ)飼料，降低了飼喂成本，因此，在紫花苜蓿資源的利用上具有較大的開發(fā)價值和發(fā)展前景，值得生產(chǎn)上推廣應用。