劉 珊 郭 瑞 宋新雨 于倩茹 陳鐘壡 梁文琦 滕 琪 龔樹(shù)生 柳 柯*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)耳聾疾病臨床診療與研究中心，北京 100050)

聽(tīng)力損失目前是人類最常見(jiàn)的感官缺陷之一，約有一半的語(yǔ)前聾是由遺傳原因造成的。每1 000個(gè)新生兒中就有一位患有先天性耳聾，其中60%以上是由遺傳因素引起的，遺傳性聾的群體發(fā)病率已超過(guò)27/1 000[1-3]。傳統(tǒng)上可以采用助聽(tīng)器或是人工耳蝸植入術(shù)來(lái)治療不同基因突變引起的遺傳性耳聾，但除此之外，尚無(wú)有效的藥物治療手段。對(duì)于遺傳性耳聾較為理想的干預(yù)方法是對(duì)基因突變位點(diǎn)精準(zhǔn)修復(fù)，恢復(fù)聽(tīng)力。近年來(lái)的研究[4-6]表明，基因治療已經(jīng)成為一種治療遺傳性疾病可行且有前途的方法。

在基因治療中，病毒載體的選擇尤為關(guān)鍵。目前在基因治療中最有效的病毒載體有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體(lentiviral vectors，LVs)。在體外的基因治療臨床試驗(yàn)中，反轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體作為首選載體，而AAV載體目前是體內(nèi)治療遺傳性耳聾的首選載體[7-8]，它具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及良好的安全性，并且可以在體內(nèi)長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)[9-10]，這些特性使得AAV在各個(gè)領(lǐng)域的臨床基因治療中有越來(lái)越多的應(yīng)用[11]。但是采用不同血清型、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)染路徑都可以影響AAV轉(zhuǎn)染的效率。

經(jīng)后半規(guī)管注射途徑作為一種內(nèi)耳局部給藥的方式，使注射試劑在小鼠耳蝸及前庭中廣泛并均勻分布，且對(duì)其聽(tīng)力和前庭功能損害最小，已被證明是一種將局部藥物輸送到內(nèi)耳簡(jiǎn)單且高效的方法[12-15]。

隨著遺傳性耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞及帶狀突觸疾病越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)和鑒定，針對(duì)耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的AAV轉(zhuǎn)染效率受到了更多的關(guān)注。為此在本研究中，通過(guò)半規(guī)管注射途徑檢測(cè)了4種AAV載體：AAV8、AAV9、AAVie、Anc80L65 在小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究采用6～8周齡C57BL/6J小鼠20只，雌雄不限，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則以及首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理細(xì)則。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組4只，均以左耳為手術(shù)耳。分為AAV8病毒導(dǎo)入組、AAV9病毒導(dǎo)入組、AAVie病毒導(dǎo)入組、Anc80L65病毒導(dǎo)入組，每只小鼠經(jīng)后半規(guī)管導(dǎo)入病毒溶液2 μL；正常對(duì)照組，每只小鼠經(jīng)后半規(guī)管導(dǎo)入0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液2 μL。術(shù)前1天進(jìn)行聽(tīng)力初篩，后半規(guī)管手術(shù)后2周行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)檢測(cè)后取小鼠耳蝸進(jìn)行免疫熒光染色觀察轉(zhuǎn)染情況。小鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，每籠最多5只，可自由進(jìn)食和飲水，提供12 h/12 h的明/暗環(huán)境。所有實(shí)驗(yàn)步驟均通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理學(xué)審批號(hào)：AEEI-2021-298。

1.2 主要材料

攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的AAV8、AAVie、Anc80L65病毒懸液購(gòu)于廣州派真生物技術(shù)有限公司，效價(jià)均為：1E+13GC/mL；AAV9病毒懸液來(lái)自于北京大學(xué)鄧宏魁教授細(xì)胞分化與干細(xì)胞研究室的饋贈(zèng)。

1.3 手術(shù)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg, Sigma公司，美國(guó))和甲苯噻嗪(10 mg/kg, Sigma，美國(guó))，進(jìn)行麻醉，麻醉成功后放置保溫毯上進(jìn)行備皮，乙醇消毒手術(shù)區(qū)域，采用左耳耳后切口，充分暴露后半規(guī)管，用26號(hào)注射器針頭在后半規(guī)管戳一小孔，將微管插入小孔中(圖1)，用微量注射泵導(dǎo)入2 μL病毒溶液。隨后拔出微管同時(shí)用一小塊肌肉封堵入口，復(fù)位肌肉及皮下組織，用縫線縫合切口。

圖1 經(jīng)后半規(guī)管導(dǎo)入手術(shù)示意圖(術(shù)耳為左耳) Fig.1 Schematic diagram of operation through posterior semicircular canal (left ear for operation)

1.4 ABR檢測(cè)

分別于術(shù)前及術(shù)后2周對(duì)小鼠進(jìn)行ABR檢測(cè)聽(tīng)力功能。將麻醉后的小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)屏蔽隔音室內(nèi)，用美國(guó)TDT RZ6機(jī)器進(jìn)行檢測(cè)，將記錄電極置于前額正中皮下，參考電極置于檢測(cè)耳后皮下，接地電極置于非測(cè)試耳后皮下，外置放大器置于測(cè)試耳一側(cè)。刺激聲采用短聲和短純音，選擇4、8、16、32 kHz為測(cè)聽(tīng)頻率點(diǎn)，記錄波形。刺激強(qiáng)度從90 dB SPL開(kāi)始，按10 dB遞減，接近閾值時(shí)按5 dB遞減，直到檢測(cè)不出重復(fù)的ABR波形，此刺激聲強(qiáng)度為小鼠的聽(tīng)閾。

1.5 內(nèi)耳標(biāo)本的制備

術(shù)后兩周行ABR測(cè)聽(tīng)后處死動(dòng)物，取出耳蝸，顯微鏡下于蝸尖處打孔，刺破圓窗膜及卵圓窗膜后放入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中4 ℃避光過(guò)夜。隨后將耳蝸放于10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙二胺四乙酸鈉(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)中脫鈣2 h，在顯微鏡下剝離蝸殼，切除多余血管紋、螺旋韌帶，撕下蓋膜及前庭膜，將基底膜切為頂中轉(zhuǎn)及中底轉(zhuǎn)進(jìn)行免疫熒光染色。

1.6 免疫熒光染色

將制備好的基底膜放于0.3%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100(Sigma-Aldrich,美國(guó))和5%(體積分?jǐn)?shù)分?jǐn)?shù))山羊血清(ZSGB-BIO公司, 中國(guó))在室溫下孵育2 h，加稀釋兔源性Myosin(1∶300，Proteus BioSciences 公司，美國(guó) )一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，加二抗山羊抗兔568(1∶300)室溫孵育2 h，PBS漂洗3次后用DAPI封片，激光共聚焦顯微鏡觀察GFP分布并拍片。

1.7 細(xì)胞計(jì)數(shù)

在激光共聚焦圖像中計(jì)數(shù)500 μm長(zhǎng)度的基底膜，計(jì)算每一段基底膜中表達(dá)GFP的內(nèi)毛細(xì)胞數(shù)比例。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組術(shù)前和術(shù)后ABR閾值測(cè)試結(jié)果

術(shù)后1 d發(fā)現(xiàn)有2只小鼠拎起尾巴有旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象，術(shù)后3 d癥狀消失，恢復(fù)正常，其余小鼠未見(jiàn)有歪頭、步態(tài)不穩(wěn)等前庭功能受損等表現(xiàn)。術(shù)后2周ABR檢測(cè)后取材時(shí)肉眼觀中耳清潔，未見(jiàn)中耳積液及內(nèi)耳炎性反應(yīng)等表現(xiàn)。將AAV8注射組、AAV9注射組、AAVie注射組、Anc80L65注射組聽(tīng)力數(shù)據(jù)分別與術(shù)前及對(duì)照組聽(tīng)力數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 手術(shù)前后小鼠ABR變化 Fig.2 Changes of ABR in mice before and after operation

2.2 耳蝸內(nèi)GFP表達(dá)

在導(dǎo)入2周后對(duì)小鼠耳蝸取材進(jìn)行免疫熒光染色，GFP熒光標(biāo)記病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，Myosin標(biāo)記毛細(xì)胞，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP在耳蝸組織中的分布。

激光共聚焦顯微鏡下觀察AAV8在耳蝸基底膜中的表達(dá)(圖3)，GFP分布在內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)域，但密度較低，AAV8在耳蝸?lái)斨修D(zhuǎn)內(nèi)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為34.6%±1.8%，中底轉(zhuǎn)內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為39.0%±5.9%。

圖3 AAV8導(dǎo)入2周后GFP在基底膜的分布Fig.3 Distribution of GFP in Corti 2 weeks after AAV8 introduction

2.3 AAV9、AAVie、 AL80L65在耳蝸中的表達(dá)

激光共聚焦顯微鏡下觀察AAV9在耳蝸基底膜的表達(dá)，可見(jiàn)其GFP均勻且廣泛分布在內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)域(圖4)，AAV9耳蝸?lái)斨修D(zhuǎn)內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為92.5%±1.1%，中底轉(zhuǎn)內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為94.6%±1.0%，其轉(zhuǎn)染效率在頂中轉(zhuǎn)及中底轉(zhuǎn)均顯著高于AAV8及Anc80L65。

圖4 AAV9導(dǎo)入2周后GFP在基底膜的分布 Fig.4 Distribution of GFP in Corti 2 weeks after AAV9 introduction

激光共聚焦顯微鏡下觀察AAVie在耳蝸基底膜的表達(dá)，可見(jiàn)其GFP廣泛且高效分布在內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)域(圖5)。耳蝸?lái)斨修D(zhuǎn)轉(zhuǎn)染效率為96.7%±1.5%，中底轉(zhuǎn)內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為97.7%±0.8%。

圖5 AAVie導(dǎo)入2周后GFP在基底膜的分布 Fig.5 Distribution of GFP in Corti 2 weeks after AAVie introduction

激光共聚焦顯微鏡下觀察Anc80L65在耳蝸基底膜的表達(dá)(圖6)，GFP普遍分布于內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)域，耳蝸?lái)斨修D(zhuǎn)內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為62.5%±3.3%，中底轉(zhuǎn)內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為63.1%±6.1%(圖7)。

圖6 Anc80L65導(dǎo)入2周后GFP在基底膜的分布 Fig.6 Distribution of GFP in Corti 2 weeks after Anc80L65 introduction

圖7 各組病毒溶液在小鼠耳蝸中的轉(zhuǎn)染率比較 Fig.7 Comparison of transfection efficiency of virus solution in mouse cochlea

正常對(duì)照組未見(jiàn)GFP表達(dá)，在耳蝸?lái)斨修D(zhuǎn)及中底轉(zhuǎn)中，AAV9、AAVie分別比AAV8、Anc80L65轉(zhuǎn)染率高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

基因治療是隨著DNA重組技術(shù)的成熟而發(fā)展起來(lái)的，是醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域的一次重大技術(shù)進(jìn)步[16]。基因治療目前多采用的方法是通過(guò)病毒載體將遺傳物質(zhì)引入靶細(xì)胞，通過(guò)糾正或補(bǔ)充有缺陷的基因來(lái)治療或預(yù)防遺傳性疾病。基因治療的優(yōu)點(diǎn)效果是長(zhǎng)期的，不需要反復(fù)進(jìn)行手術(shù)操作。

腺相關(guān)病毒是目前研究中最活躍的基因治療的首選載體[17]，它具有裝載量大(36 kb)、相對(duì)廣泛的趨向性、低免疫原性和非致病性等獨(dú)特的臨床引用特點(diǎn)，且可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。迄今為止，至少有 12 種天然血清型和 100 多種 AAV 變體已被分離出來(lái)并作為基因傳遞載體進(jìn)行研究，并且從這些載體中不斷產(chǎn)生 AAV 突變體，以優(yōu)化 AAV 用于基因傳遞的用途。然而，盡管AAV載體在臨床上取得了良好的治療效果，但其轉(zhuǎn)染效率和誘導(dǎo)對(duì)AAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫應(yīng)答的趨勢(shì)也引起關(guān)注。本研究中，注射AAV病毒的各組與正常對(duì)照組ABR閾值比較也可以發(fā)現(xiàn)，AAV病毒對(duì)小鼠本身ABR沒(méi)有影響，且AAVie及AAV9經(jīng)半規(guī)管途徑導(dǎo)入到內(nèi)耳后在內(nèi)毛細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染率，這說(shuō)明AAV作為一種基因治療的病毒載體是安全且高效的。這為今后在基因治療如OTOF、SLC17A8、SMAD4等基因突變導(dǎo)致的聽(tīng)神經(jīng)病中病毒載體的選擇提供了更多思路[18-19]。

經(jīng)半規(guī)管注射方式并未引起小鼠耳蝸ABR閾值的顯著改變，耳后入路經(jīng)后半規(guī)管注射手術(shù)創(chuàng)傷較小，所以后半規(guī)管手術(shù)方式是一種既可以保存聽(tīng)力，又能有效的將目的基因?qū)攵伒挠行窂?。?duì)動(dòng)物手術(shù)來(lái)說(shuō)，相對(duì)于耳蝸圓窗手術(shù)，半規(guī)管更容易暴露，對(duì)神經(jīng)和血管損傷較小，對(duì)耳蝸正常結(jié)構(gòu)組織破壞性小，對(duì)前庭功能也并無(wú)損害。

本研究中發(fā)現(xiàn)有2只小鼠術(shù)后第1天起尾巴時(shí)有旋轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，但是在術(shù)后3 d癥狀消失，考慮是術(shù)后由于個(gè)體差異導(dǎo)致的前庭器官應(yīng)激反應(yīng)[20]。之前的研究表明，多種因素包括小鼠年齡、載體血清型、啟動(dòng)子類型、注射方法和病毒效價(jià)都會(huì)影響病毒在小鼠內(nèi)耳的細(xì)胞靶向性以及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[21]。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中AAV8及Anc80L65的轉(zhuǎn)染效率并不高，AAVie和AAV9雖然在內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高，但都只能轉(zhuǎn)染到內(nèi)毛細(xì)胞，外毛細(xì)胞和支持細(xì)胞均未觀察到GFP表達(dá)。分析可能的原因有：以往的研究[18-21]中病毒轉(zhuǎn)染途徑大多采用經(jīng)圓窗途徑給藥，因?yàn)閳A窗在解剖學(xué)上比后半規(guī)管更靠近耳蝸，但又容易損害小鼠聽(tīng)力。其次通過(guò)后半規(guī)管傳遞的病毒溶液可能會(huì)被半規(guī)管中的淋巴液稀釋，這會(huì)降低其濃度并限制其感染整個(gè)耳蝸的能力。另外，其他研究中多采用P7以內(nèi)新生小鼠進(jìn)行手術(shù)，這也是本研究的不足之處，只研究了AAV8、AAV9、AAVie、Anc80L65在成年小鼠經(jīng)半規(guī)管給藥后對(duì)內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染情況，其他手術(shù)方式及小鼠年齡有待進(jìn)一步研究，以尋求更高效的轉(zhuǎn)染效率。

總之，本研究表明經(jīng)后半規(guī)管注射AAVie、AAV9可以在內(nèi)耳內(nèi)毛細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染并對(duì)聽(tīng)力沒(méi)有顯著影響，因而可以在日后的基因治療中作為一種載體選擇，特別是對(duì)耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞及帶狀突觸的遺傳性聽(tīng)力損失干預(yù)而言，這種病毒應(yīng)用價(jià)值較大。當(dāng)然，目前對(duì)于腺相關(guān)病毒載體的不斷探索以及內(nèi)對(duì)耳局部給藥方式的不斷完善，如經(jīng)后半規(guī)管給藥、經(jīng)圓窗膜顯微注射、鼓室注射、中階給藥等，為今后在遺傳性疾病的臨床治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明劉珊：研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集和論文撰寫(xiě); 于倩茹：數(shù)據(jù)收集; 郭瑞、宋新雨、陳鐘壡、梁文琦、滕琪：數(shù)據(jù)分析; 龔樹(shù)生、柳柯：研究設(shè)計(jì)和論文指導(dǎo)。