胡耀文，李 鑫*，武利偉，解 靖，劉振杰，趙新崗

（1.河北省保定市第一中心醫(yī)院神經(jīng)外一科，河北 保定 071000；2.首都醫(yī)科大學(xué)三博腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100000)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是臨床常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率高，治療困難，因其轉(zhuǎn)移快速、侵襲性強(qiáng)而預(yù)后極差、且易復(fù)發(fā)，對患者生命健康造成極大威脅[1-3]。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，可與靶基因非翻譯區(qū)靶向結(jié)合，從而調(diào)控其翻譯表達(dá)。miR-495作為一種miRNA，可通過調(diào)控多種基因表達(dá)而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，miR-495在人類膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)其表達(dá)，可明顯抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，發(fā)揮顯著的抑癌作用[4-6]。Notch1基因可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生理進(jìn)程，并可通過調(diào)控細(xì)胞周期和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）過程而介導(dǎo)前列腺癌、乳腺癌、口腔鱗癌等多種腫瘤的生長及侵襲轉(zhuǎn)移，下調(diào)其表達(dá)，可延緩EMT進(jìn)程，抑制癌細(xì)胞增殖，降低其侵襲轉(zhuǎn)移力[7-9]。另外，在關(guān)于口腔鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-495可靶向下調(diào)Notch1基因表達(dá)，進(jìn)而抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲[9]。但miR-495靶向Notch1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，目前還未有明確全面的闡述，本研究對此進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87（貨號l110238）購買于上海北諾生物科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液（貨號T1300）、DMEM培養(yǎng)基（貨號31600）、優(yōu)級胎牛血清（貨號S9020）、青鏈霉素混合液（貨號P1400）、LipofectamineTM2000（貨號11668）、高效RIPA裂解液（貨號R0010）、CCK-8試劑盒（貨號CA1210）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號PC0020）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號T2240）、結(jié)晶紫染色液（貨號G1062）購買于北京索萊寶科技有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基（貨號31985062）購買于美國Thermo Fisher Scientific公司；AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒（貨號556547）購買于美國BD公司；miR-495、U6、Notch1、GAPDH引物購買于上海生工生物工程股份有限公司；miR-495 mimics、miR-495 mimics陰性對照購買于上海吉瑪基因有限公司；基質(zhì)膠（貨號wlb1062）購買于上海瓦蘭生物科技有限公司；RNAiso Plus（貨號9108）購買于日本Takara公司；SYBR Green Master Mix（貨號A8605）購買于美國ABI公司；兔源Anti-β-actin一抗（貨號ab227387）、兔源Anti-caspase-3一抗（貨號ab32351）、兔源Anti-Bax一抗（貨號ab32503）、兔源Anti-Vimentin一抗（貨號ab193555）、兔源Anti-E-cadherin一抗（貨號ab76319）、兔源Anti-Notch1一抗（貨號ab52627）、羊抗兔二抗（貨號ab150077）購買于美國Abcam公司。

1.2 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、凝膠成像系統(tǒng)購買于美國Thermo Fisher Scientific公司，型號分別是VARIOSKANLUX、Attune NxT、IBright CL 1500；光學(xué)顯微鏡購買于德國LEICA公司；核酸濃度測定儀購買于THERMO公司，型號Nanodrop little；高通量DNA合成儀、熒光定量PCR儀購買于美國Applied biosystems公司，型號分別是3900、7900 Fast；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購買于美國Bio-Rad公司，型號分別是EPS 300、Power-pac 3000。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中miR-495表達(dá) 收集本院神經(jīng)外科志愿者手術(shù)切除的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織各6例，以RNAiso Plus分別提取其中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，配制20 μL的qRTPCR反應(yīng)體系：DEPC水6 μL+上游引物 0.8 μL+下游引物0.8 μL+ cDNA2 μL+ SYBR Green Master Mix10 μL+ ROX染料0.4 μL，均加入qRT-PCR反應(yīng)管中，混勻后放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件參照說明書的指導(dǎo)設(shè)定，以U6作為miR-495的內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt算法分析數(shù)據(jù)，獲得組織中miR-495的相對表達(dá)量。qRT-PCR引物序列見表1。

1.3.2 體外培養(yǎng)并分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞 快速解凍后復(fù)蘇購買的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87，離心5 min（1 000 r·min-1），棄去上清液，將細(xì)胞沉淀以5 mL完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+100 U·mL-1青鏈霉素溶液）重新懸浮，混勻后接種在25 cm2培養(yǎng)瓶，平放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（5% CO2、95%濕度）中，進(jìn)行無菌培養(yǎng)。

取上述處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞，接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為對照組、miR-495 mimics陰性對照組、miR-495 mimics組3組，參照說明書和文獻(xiàn)[10]，分別使用50 μLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基溶解miR-495 mimics陰性對照、miR-495 mimics，同時(shí)使用100 μLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基溶解2 μL LipofectamineTM2000，配制LipofectamineTM2000溶液，然后各取50 μL與上述miR-495 mimics陰性對照及miR-495 mimics溶液混合，輕輕震蕩均勻后，靜置20 min，將培養(yǎng)板中完全培養(yǎng)基吸除，加入Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，以配制的miR-495 mimics及miR-495 mimics陰性對照LipofectamineTM2000溶液處理細(xì)胞，6 h后吸除Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，加入新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集各組細(xì)胞，重復(fù)上述操作5次，收集5份細(xì)胞備用。

1.3.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 取上述處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞，接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為每毫升1.0×105個(gè)，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)24 h，參照1.3.2中的方法分組并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)6個(gè)孔不接種細(xì)胞，只加入完全培養(yǎng)基，做空白對照，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)無菌培養(yǎng)細(xì)胞24 h，然后吸除完全培養(yǎng)基，加入新的完全培養(yǎng)基，并每孔加入CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h，放入多功能酶標(biāo)儀中，測量450 nm波長下各孔吸光度，通過公式：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白對照組吸光度）/（對照組吸光度-空白對照組吸光度）×100%，計(jì)算各組細(xì)胞活力。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 1.3.2中收集的1份各組細(xì)胞各取含1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，離心5 min（1 000 r·min-1），棄除上清液，采用PBS溶液漂洗細(xì)胞沉淀后再次離心，棄除上清液，加入500 μL Binding Buff er+10 μL AnnexinV-FITC+5 μLPI的混合液，輕輕震蕩均勻后，37 ℃避光孵育15 min，棄除上清液，加入500 μL PBS溶液，輕輕吹打混勻后，放入流式細(xì)胞儀中檢測，通過Muticycle AV軟件分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 1）分別檢測細(xì)胞侵襲、遷移力Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)[11]：Transwell上室中提前加入基質(zhì)膠，4 ℃包被過夜，在Transwell下室中加入完全培養(yǎng)基，取1.3.2中收集的各組細(xì)胞1份，測定其密度后，分組接種在Transwell上室中，每個(gè)小室中含細(xì)胞1×105個(gè)，放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)24 h，棄去下室培養(yǎng)基及上室內(nèi)細(xì)胞，以PBS漂洗下室細(xì)胞后加入4%多聚甲醛固定，然后以結(jié)晶紫染液孵育10 min染色后，顯微鏡下任選5個(gè)視野對細(xì)胞拍照并計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值。2）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)[11]：取1.3.2中收集的各組細(xì)胞1份，測定其密度后，分組接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用無菌直尺做標(biāo)地物，以無菌槍頭劃一條直線，以PBS洗去劃痕中細(xì)胞后，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下任選5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)劃痕中細(xì)胞，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞miR-495和Notch1 mRNA表達(dá)水平 取1.3.2中收集的各組細(xì)胞1份，以RNAiso Plus分別提取其中總RNA后，參照1.3.1中的方法進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測各組細(xì)胞中miR-495和Notch1 mRNA表達(dá)水平，以U6作為miR-495的內(nèi)參基因，以GAPDH作為Notch1的內(nèi)參基因。qRT-PCR引物序列見表1。

1.3.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、EMT相關(guān)蛋白及Notch1蛋白表達(dá) 取1.3.2中收集的各組細(xì)胞1份，以高效RIPA裂解液于冰水浴中裂解，2 h后4℃離心20 min（3 000 r·min-1），棄除上清液，以BCA法測定其中總蛋白濃度后，將各組蛋白調(diào)整至同一濃度，每組分別取20 μL加入上樣孔中，110 V恒定電壓下電泳后濕轉(zhuǎn)，以5%脫脂牛奶室溫孵育硝酸纖維膜2 h，封閉膜上蛋白，以兔源Antiβ-actin、Anti-caspase-3、Anti-Bax、Anti-Vimentin、Anti-E-cadherin、Anti-Notch1一抗孵育裁剪下的目的蛋白條帶，4℃過夜后使用TBST溶液洗3次，加入羊抗兔二抗孵育，于搖床上室溫輕搖2 h后，使用TBST溶液再次洗3次，條帶上滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑顯色，放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照，采用Image Lab軟件分析條帶上蛋白灰度值，計(jì)算出其相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過軟件SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較使用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組之間比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中miR-495表達(dá)水平比較

見表2。

表2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中miR-495表達(dá)水平比較（±s，n= 6）

表2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中miR-495表達(dá)水平比較（±s，n= 6）

注：與癌旁組織比較，# P＜0.05

組別 miR-495/U6癌旁組織 1.01±0.27神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織 0.42±0.08#

2.2 各組U87細(xì)胞活力比較

見表3。

表3 各組U87細(xì)胞活力比較（±s，n = 6） %

表3 各組U87細(xì)胞活力比較（±s，n = 6） %

注：與對照組比較，# P＜0.05

組別 細(xì)胞活力對照組 100.00±0.00 miR-495 mimics陰性對照組 98.79±20.05 miR-495 mimics組 47.02±8.73#

2.3 各組U87細(xì)胞凋亡情況比較

見圖1、表4。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組U87細(xì)胞凋亡結(jié)果

表4 各組U87細(xì)胞凋亡率比較（±s，n = 6） %

表4 各組U87細(xì)胞凋亡率比較（±s，n = 6） %

注：與對照組比較，# P＜0.05

組別 細(xì)胞凋亡率對照組 3.51±0.57 miR-495 mimics陰性對照組 3.49±0.60 miR-495 mimics組 56.72±8.54#

2.4 各組U87細(xì)胞遷移情況比較

見圖2、表5。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組U87細(xì)胞遷移結(jié)果（×200）

表5 各組U87細(xì)胞遷移數(shù)比較（±s，n = 6） 個(gè)

表5 各組U87細(xì)胞遷移數(shù)比較（±s，n = 6） 個(gè)

注：與對照組比較，# P＜0.05

組別 細(xì)胞遷移數(shù)對照組 203.15±42.56 miR-495 mimics陰性對照組 198.96±50.23 miR-495 mimics組 27.13±6.35#

2.5 各組U87細(xì)胞侵襲情況比較

見圖3、表6。

圖3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組U87細(xì)胞侵襲結(jié)果（×400）

表6 各組U87細(xì)胞侵襲數(shù)比較（±s，n = 6） 個(gè)

表6 各組U87細(xì)胞侵襲數(shù)比較（±s，n = 6） 個(gè)

注：與對照組比較，# P＜0.05

組別 細(xì)胞侵襲數(shù)/個(gè)對照組 178.64±35.72 miR-495 mimics陰性對照組 171.57±42.68 miR-495 mimics組 23.69±6.03#

2.6 各組U87細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Bax)及EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、Vimentin)表達(dá)水平比較

見表7、圖4。

圖4 免疫印跡檢測各組U87細(xì)胞凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果

表7 各組U87細(xì)胞凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n= 6）

表7 各組U87細(xì)胞凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n= 6）

注：與對照組比較，# P＜0.05

組別 Caspase-3/β-actin Bax/β-actin Vimentin/β-actin E-cadherin/β-actin對照組 0.37±0.06 0.41±0.08 1.31±0.26 0.68±0.13 miR-495 mimics陰性對照組 0.39±0.07 0.42±0.09 1.32±0.28 0.70±0.15 miR-495 mimics組 0.92±0.23# 0.90±0.21# 0.76±0.14# 1.34±0.29#

2.7 各組U87細(xì)胞miR-495和Notch1表達(dá)水平比較

見圖5、表8。

表8 各組U87細(xì)胞miR-495和Notch1表達(dá)水平比較（±s，n= 6）

表8 各組U87細(xì)胞miR-495和Notch1表達(dá)水平比較（±s，n= 6）

注：與對照組比較，# P＜0.05

組別mRNA相對表達(dá) 蛋白相對表達(dá)miR-495/U6 Notch1/GAPDH Notch1/β-actin對照組 1.01±0.24 1.02±0.25 0.96±0.18 miR-495 mimics陰性對照組 1.00±0.26 0.99±0.27 0.95±0.17 miR-495 mimics組 2.34±0.52#0.41±0.08# 0.28±0.05#

圖5 免疫印跡檢測各組U87細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，以生長迅速、侵襲強(qiáng)勁、轉(zhuǎn)移速度快為顯著特點(diǎn)，如今臨床常用治療手段為手術(shù)后進(jìn)行放、化療，但總體療效并不明顯，患者平均生存時(shí)間只有約18個(gè)月，因此探索新的作用靶點(diǎn)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療具有重要的價(jià)值[12-13]。miR-495是一種抑癌基因，介導(dǎo)人膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-6]，促進(jìn)其表達(dá)，可明顯抑制口腔鱗癌及胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過程[14-15]。另外，miR-495在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)，并與患者3年總存活率呈正相關(guān)，與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，因而miR-495可作為治療膠質(zhì)瘤新的潛在靶點(diǎn)[16]。本研究通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中miR-495表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相比癌旁組織，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miR-495表達(dá)水平顯著降低，而以miR-495 mimics提高U87細(xì)胞中miR-495表達(dá)，可顯著降低其細(xì)胞活力、遷移和侵襲數(shù)、Vimentin蛋白表達(dá)，并顯著升高細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax和E-cadherin蛋白表達(dá)，表明miR-495可介導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程，上調(diào)其表達(dá)，可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，并抑制其轉(zhuǎn)移侵襲性。

Notch1是miR-495的一個(gè)靶基因，miR-495可負(fù)靶向調(diào)控Notch1基因表達(dá)[9,17]，促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，抑制miR-495表達(dá)，可保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免于高糖造成的損傷[17]。另外，Notch1可介導(dǎo)食管癌、宮頸癌、前列腺癌等多種腫瘤的生長過程，下調(diào)其表達(dá)，可顯著降低食管癌細(xì)胞活力，抑制其侵襲和遷移；以Notch1抑制劑DAPT處理宮頸癌細(xì)胞，可增強(qiáng)順鉑對其的殺傷力；抑制Notch1信號，可明顯降低前列腺癌異種移植瘤的生長[18-19]。但miR-495是否通過靶向調(diào)控Notch1表達(dá)而影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，目前還沒有明確闡述，對此進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，以miR-495 mimics處理U87細(xì)胞，可顯著降低Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)，表明miR-495能靶向下調(diào)Notch1表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，降低其細(xì)胞活力，并減輕其遷移及侵襲。

綜上所述，miR-495可減弱神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性，促使其凋亡，并降低其侵襲轉(zhuǎn)移能力，靶向下調(diào)Notch1表達(dá)可能是其作用機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療提供了新的理論依據(jù)，并為其找到了一種新的治療策略，但本研究未通過上調(diào)并下調(diào)Notch1基因表達(dá)來進(jìn)行對照驗(yàn)證，存在一定不足，后續(xù)還應(yīng)深入研究。