朱 韜，吳可馨，賀煜添，朱鳳池，楊冬芝

(徐州醫(yī)科大學(xué)新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004)

水凝膠(Hydrogel， Gel)由大量的水和相互交聯(lián)的高分子組成，因其含水量(70%～99%)與生物組織接近而具有很高的生物相容性和高效載藥能力[1]。智能水凝膠具有特殊環(huán)境(如溫度、pH等)響應(yīng)性質(zhì)，成為藥物載體的首選。Zhao等[2]利用制備的智能水凝膠同時(shí)包載阿霉素和紫杉醇兩種藥物，利用腫瘤環(huán)境的弱酸環(huán)境，藥物釋放表現(xiàn)出明顯的腫瘤特異性。Kim等[3]制備利用水凝膠和微球的智能響應(yīng)性，實(shí)現(xiàn)阿霉素和氟脲嘧啶在腫瘤部位的順序釋放。大部分水凝膠呈固態(tài)，在臨床應(yīng)用中收到限制?；谖h(huán)境設(shè)計(jì)的可降解水凝膠發(fā)展極為迅速[4-6]。

石墨烯量子點(diǎn)(Graphene Quantum Dots， GQDs)是一種零維碳納米材料，優(yōu)異的生物相容性和豐富的表面化學(xué)基團(tuán)，使GQDs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[7]受到廣泛關(guān)注。不同方法制備的GQDs具有明顯不同的化學(xué)和物理性質(zhì)。Ge等[8]以聚噻吩為原料合成的GQDs具有明顯優(yōu)于其他方法的性質(zhì)，這種方法合成的GQD在一定激光照射下可釋放單線態(tài)氧，具有很高的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力。這一性質(zhì)在我們?cè)谇捌趯?duì)GQDs抑菌性能研究中得以證實(shí)。但如何實(shí)現(xiàn)GQDs在疾病部位的定向釋放是需要解決的問題。

本工作中我們選取具有酸度敏感性的水凝膠包載GQDs，比較Gel在不同酸度溶液中的降解性能及GQDs的釋放行為，并研究了不同條件下GQDs@Gel的抑菌性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在弱酸條件下Gel發(fā)生降解從而釋放GQDs，從而表現(xiàn)出良好的控制釋放行為，為該復(fù)合材料在抑菌方面的應(yīng)用提供了信息借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

葡聚糖70(W=70 kD)、殼聚糖(中粘度)和高碘酸鈉(99.5%),上海麥克林生化科技有限公司;5， 10， 15，20-四(4-氨基苯基)卟啉、(三苯基膦)鈀，上海阿拉丁生化科技有限公司。N，N-二甲基十二胺，3-噻吩硼酸和溴芐基溴，Alfa Aesar化學(xué)有限公司；大腸桿菌(ATCC：8739)和金黃色葡萄球菌(ATCC：29213)，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；瓊脂，微科曼德生物工程有限公司；酵母膏和胰蛋白胨，英國OXOID公司。

Q25掃描電子顯微鏡(SEM)，美國FEI有限責(zé)任公司；FL4600熒光分光光度計(jì)，日本島津有限公司；UV-3100型可見紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；FD-1C-50真空冷凍干燥機(jī)，北京博藝康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TG20高速離心機(jī)，海南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DF-1型集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；Thermo Scientific超純水儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 GQDs@Gel的制備與表征

GQDs的制備：參考本實(shí)驗(yàn)室合成方法制備GQDs[9-10]。 1 mmol 4-溴芐基溴和1.3 mmol N，N-二甲基十二胺溶于20 mL二氯甲烷/甲醇(V:V=3:2)，N2保護(hù)下室溫?cái)嚢?2 h。將產(chǎn)物減壓蒸餾濃縮至約5 mL，轉(zhuǎn)移至無水乙醚，靜置得白色沉淀，經(jīng)過濾、真空干燥，得到白色晶體，即化合物1。取化合物0.96 mmol 1，1 mmol 3-噻吩硼酸，4.7 mmol無水碳酸鈉和0.17 mmol 4-(三苯基膦)鈀，溶解于30 mL乙醇/去離子水 (V:V=2:1)，N2保護(hù)下加熱至90 ℃，反應(yīng)6 h后產(chǎn)物經(jīng)層析柱及薄層層析純化得白色晶體化合物2?；衔?與FeCl3(質(zhì)量比4:1)分別溶解于氯仿，將化合物2的溶液滴加入FeCl3溶液中，N2保護(hù)下室溫反應(yīng)48 h。經(jīng)過濾、離心、甲醇洗滌3次，干燥可得暗紅色固體，即為PT2。稱取20 mg PT2，溶于40 mL去離子水，用NaOH調(diào)節(jié)pH至9～10后，溶液置于高壓反應(yīng)釜，160 ℃加熱24 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，產(chǎn)物經(jīng)過濾，濾液即為GQDs水溶液。

GQDs@Gel的制備：1 g高碘酸鈉滴入葡聚糖的水溶液中，避光反應(yīng)6 h，經(jīng)透析、干燥即得醛基交聯(lián)劑。0.02 g殼聚糖與0.05 g(5， 10， 15， 20)-四(4-氨基苯基)卟啉混和均勻，再加入GQDs量子點(diǎn)溶液(80 μg/ml)50 μL，醛基交聯(lián)劑50 μL，經(jīng)反應(yīng)即得復(fù)合水凝膠GQDs@Gel。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

細(xì)菌培養(yǎng)平板的制作：LB營養(yǎng)瓊脂按照氯化鈉1 g/ 100 mL、胰蛋白胨1 g/100 mL、酵母浸粉0.5 g/100 mL、瓊脂1 g/100 mL溶解于去離子水中，在121 ℃、101 kPa條件下滅菌60 min后，稍冷卻后倒入細(xì)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿約 20 mL，待其凝固后，置于4 ℃冰箱中無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)菌復(fù)蘇與培養(yǎng)：將凍存的菌種取出，于4 ℃冰箱內(nèi)溶化。取5 μL菌種置于含有30 mL液體培養(yǎng)基的無菌試管內(nèi)，于37 ℃，200 rpm恒溫?fù)u床中傳代三次備用。將上述復(fù)蘇的菌液離心后棄上清，然后用無菌去離子水將細(xì)菌混勻，使用UV-Vis在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，當(dāng)OD600為0.1時(shí)菌液的濃度為2×108CFU/mL。采用常規(guī)的37 ℃和200 rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。

1.4 GQDs@Gel的抑菌性能

GQDs@Gel的抑菌效果：通過考察GQDs@Gel對(duì)細(xì)菌的抑菌作用，評(píng)價(jià)GQDs在包載前后其抑菌效果。采用平板菌落計(jì)數(shù)法，以磷酸緩沖溶液(Phosphate Buffered Saline， PBS)為對(duì)照，選取劑量為4 μg GQDs@Gel溶液考察納米材料的抑菌活性。每組分別設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照。細(xì)菌存活率=實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)/對(duì)照組菌落數(shù)×100%。

GQDs@Gel的光動(dòng)力抑菌效果：采用平板菌落計(jì)數(shù)法，分別考察GQDs@Gel在光照以及非光照條件下對(duì)大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的抑菌效果。將實(shí)驗(yàn)分為光照組與非光照組，對(duì)于光照組使用白熾燈(功率5 W；距離40 cm)照射15 min后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行組。

2 結(jié)果與討論

2.1 Gel的性質(zhì)表征

SEM表征(圖1)顯示，Gel呈現(xiàn)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑約 10 μm。Gel在一定條件下會(huì)發(fā)生降解，生成原產(chǎn)物卟啉衍生物，卟啉衍生物在480 nm有特征吸收峰。實(shí)驗(yàn)考察了Gel在不同pH(5.0，6.5和7.4)下的狀態(tài)，紫外-可見吸收光譜圖及Gel的流動(dòng)狀態(tài)顯示(圖2)，在酸性條件下，卟啉衍生物的吸收強(qiáng)度明顯提高，提示水凝膠的降解速度明顯高于中性條件，這與水凝膠呈現(xiàn)出的凝膠狀/流動(dòng)狀之間的變換一致。

圖1 Gel的SEM表征圖Fig.1 The SEM image of Gel

圖2 Gel在不同pH環(huán)境下的降解Fig.2 The degradation of Gel in different medium

2.2 GQDs@Gel中GQDs的包載及釋放

GQDs在650 nm(Ex=400 nm)處表現(xiàn)出熒光特征發(fā)射峰，比較GQDs及GQDs@Gel的熒光光譜圖(圖3)可知，GQDs@Gel在同樣的位置表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光性能，證明Gel對(duì)GQDs的包載。

圖3 The loading and release of GQDs in GelFig.3 Online and offline mixed experimental teaching mode

通過GQDs的紫外-可見吸收光譜性質(zhì)計(jì)算在Gel中的包載，包封率為98.2%，包載量為90 μg/mg。實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了在pH=5.0、6.5、7.4的PBS介質(zhì)中的GQDs的釋放情況，結(jié)果顯示GQDs@Gel在各溶液中孵育180 h時(shí)，GQDs的釋放率明顯不同。在pH=5.0的介質(zhì)中GQDs釋放率達(dá)到69.4%，而在pH 6.5和7.4中的釋放率分別為42.9%和11.7%，呈現(xiàn)出明顯的酸度敏感性，這與Gel的分解性能一致，說明GQDs的釋放與Gel的酸度敏感性相關(guān)。這一性質(zhì)為酸度敏感的藥物治療提供了可能性。

2.3 GQDs@Gel抑菌性能

文獻(xiàn)顯示，GQDs具有光動(dòng)力抑菌性能[11-12]，實(shí)驗(yàn)研究了被Gel包在后GQDs@Gel在光照及非光照條件下對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。結(jié)果如圖4所示，以PBS為對(duì)照，在非光照條件下大腸桿菌的存活率分別為70.5%(pH 7.4)，12.0%(pH 6.5)和5.4%(pH 5.0)，金黃色葡萄球菌的存活率分別為76.7%(pH 7.4)，23.5%(pH 6.5)和15.2%(pH 5.0)，說明本實(shí)驗(yàn)制備的GQDs@Gel本身具有抑菌效果，且抑菌效果隨溶液pH降低而增強(qiáng)，顯示出明顯的酸度響應(yīng)性。同時(shí)，與非光照組比較，光照條件下明顯增強(qiáng)了GQDs@Gel對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。數(shù)據(jù)顯示分析，經(jīng)GQDs@Gel處理后，光照條件下大腸桿菌的存活率為45.9%(pH 7.4)，2.7%(pH 6.5)和0.3%(pH 5.0)，金黃色葡萄球菌的存活率降低為60.2%(pH 7.4)，9.8%(pH 6.5)和2.6%(pH 5.0)。GQDs@Gel光照組與非光照組在抑菌性能上存在顯著性差異(p<0.01)，GQDs被Gel包載后仍然表現(xiàn)出明顯的抑菌性能，且光照可以顯著增強(qiáng)其抑菌能力。

圖4 不同pH條件下GQDs、GQDs@Gel抑菌效果圖Fig.4 The antibacterial effect of GQDs and GQDs@Gel in different medium

3 結(jié) 論

本工作構(gòu)建了酸度條件分解的水凝膠體系，并通過包載具有光動(dòng)力性質(zhì)的GQDs，形成具有酸度敏感性的GQDs@Gel復(fù)合抑菌體系。通過Gel和GQDs的光學(xué)性質(zhì)，考察了材料的降解性及GQDs的包載和釋放行為。不同酸度條件和光照條件下的抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GQDs@Gel對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，且呈現(xiàn)出明顯的酸度敏感性，普通日光燈對(duì)于GQDs@Gel的抑菌效果具有明顯的增強(qiáng)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為抑菌藥物的開發(fā)提供了有用的信息借鑒。