胡慶慶，劉浩然，王建忠

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)為泌尿系第2大惡性腫瘤，發(fā)生率僅次于膀胱癌；腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)作為RCC中的最常見(jiàn)亞型[1]，占所有RCC病理類(lèi)型的70%～80%。ccRCC早期較難發(fā)現(xiàn)，且對(duì)放化療不敏感，對(duì)于晚期患者，多依賴(lài)于免疫治療。然而，由于腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)存在高度異質(zhì)性且適應(yīng)性極強(qiáng)，常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，治療效果不盡理想[2]。TME及其免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況對(duì)腫瘤進(jìn)展影響極大[3-4]。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferase，SETD2)在多種人類(lèi)腫瘤中存在突變，其表達(dá)缺失可能與患者預(yù)后差顯著相關(guān)；然而作為經(jīng)典的免疫相關(guān)調(diào)節(jié)分子，SETD2表達(dá)缺失在ccRCC腫瘤組織免疫浸潤(rùn)方面的調(diào)節(jié)及進(jìn)一步對(duì)患者預(yù)后的影響有待研究。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料利用腫瘤基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)(the cancer genome atlas，TCGA) 中ccRCC數(shù)據(jù)集分析基因表達(dá)、基因突變數(shù)據(jù)。從基因組數(shù)據(jù)共享(genomic data commons，GDC)數(shù)據(jù)門(mén)戶(hù)網(wǎng)站下載腫瘤RNA-seq數(shù)據(jù)((https://portal.gdc.cancer.gov/)，系統(tǒng)性地獲取33種類(lèi)型腫瘤的SETD2表達(dá)譜mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。此外，該研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了336例ccRCC患者的基因突變數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，并利用R軟件中的maftools軟件包下載并可視化了ccRCC患者的體細(xì)胞突變。收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015—2017年50例接受根治性或部分腎切除術(shù)后病理確診為ccRCC患者病理組織及其完整預(yù)后信息資料。

1.2 方法

1.2.1SETD2 mRNA檢測(cè)及CD8+T細(xì)胞的測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法進(jìn)行SETD2 mRNA檢測(cè)。使用TRIzol提取腎癌組織的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，-80 ℃保存。ABI7300定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：20 μl(SYBR Green核酸染料10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物各0.8 μl，模板cDNA 2 μl，去離子水6 μl)。PCR循環(huán)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、31 s，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；目的基因SETD2上游引物序列：5′-TCCAACAGTCTATGGTGTGA-3′，下游引物序列：5′-TGAGCTGTGAAAATCTGTTG-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2免疫熒光檢測(cè)SETD2、CD8+表達(dá) 腫瘤組織石蠟切片利用梯度乙醇脫蠟后行抗原修復(fù)，0.01 mol/L PBST漂洗后行2% BSA封閉30 min，而后在各標(biāo)本上滴加SETD2和CD8+一抗孵育4 ℃過(guò)夜，PBST漂洗3次后再行熒光二抗顯色。腫瘤組織切片免疫熒光染色后行共聚焦顯微鏡觀察，比較在SETD2高、低表達(dá)兩組樣本中CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的浸潤(rùn)差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析為了進(jìn)行可靠的免疫評(píng)分評(píng)估，該研究使用了R軟件包immune deconv，其中集成了6種最新算法，包括TIMER、xCell、 MCP-counter、CIBERSORT、 EPIC 及quanTIseq，結(jié)果通過(guò)R軟件v 4.0.3中的ggplot2和pheatmap進(jìn)行呈現(xiàn)。用Kaplan-Meier分析及l(fā)og-rank測(cè)試研究并比較了不同免疫浸潤(rùn)情況及對(duì)應(yīng)SETD2突變與否與患者總生存期(overall survival，OS)、無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)、無(wú)病生存期(disease free survival，DFS)預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理基因差異表達(dá)使用R軟件v 4.0.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)每種腫瘤類(lèi)型及其配對(duì)的正常樣本之間SETD2的差異表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換。χ2檢驗(yàn)檢測(cè)不同人口學(xué)特征及臨床特征組ccRCC患者的SETD2表達(dá)是否有差別，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SETD2在ccRCC中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)利用TIMER2對(duì)TCGA中33種腫瘤類(lèi)型基因表達(dá)譜進(jìn)行SETD2的表達(dá)分析，并繪制腫瘤組織和正常組織中SETD2基因的表達(dá)分布圖，其中橫軸代表不同腫瘤組織，縱軸代表該基因表達(dá)分布情況。與對(duì)照組相比，SETD2表達(dá)在ccRCC癌患者腫瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)(圖1A)。該實(shí)驗(yàn)利用TIMER2分析了SETD2在泛癌中對(duì)免疫浸潤(rùn)的影響，并繪制了SETD2在泛癌中的免疫相關(guān)性熱圖。結(jié)果顯示SETD2表達(dá)水平與ccRCC腫瘤組織中的CD4+、CD8+、中性粒細(xì)胞、髓系樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞浸潤(rùn)呈顯著正相關(guān)(圖1B)。

圖1 SETD2在泛癌中的表達(dá)及與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

2.2 SETD2基因突變分布及ccRCC中各免疫功能類(lèi)基因的突變?yōu)檫M(jìn)一步明確SETD2基因在ccRCC 組織中的突變情況，該實(shí)驗(yàn)從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)530例ccRCC患者中，挑選了含有基因突變數(shù)據(jù)的336例ccRCC患者的基因表達(dá)譜，并繪制了其基因突變景觀圖，結(jié)果顯示有266例ccRCC患者存在基因突變，位列前10的高頻突變基因有VHL、PBRM1、TTN、SETD2、BAP1、MUC16、MTOR、KDM5C、HMCN1、DNAH9，其中 SETD2突變頻率達(dá)12.5%，位列體細(xì)胞突變頻率第4(圖2)。

圖2 ccRCC腫瘤隊(duì)列體細(xì)胞景觀顯示各基因突變頻率及SETD2基因突變分布

2.3 腫瘤組織免疫浸潤(rùn)程度對(duì)ccRCC患者預(yù)后的影響為了評(píng)估TCGA中ccRCC患者腫瘤組織免疫浸潤(rùn)程度，該實(shí)驗(yàn)首先利用ssGSEA結(jié)合162個(gè)免疫示例基因進(jìn)行共識(shí)聚類(lèi)并行亞組分析，得到高免疫浸潤(rùn)組(Group1，395例)和低免疫浸潤(rùn)組(Group2，135例)(圖3A)，而后通過(guò)TIMER分析兩組隊(duì)列中腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度，結(jié)果顯示B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓系樹(shù)突狀細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均可較好地區(qū)分兩組隊(duì)列，再次驗(yàn)證隊(duì)列的免疫浸潤(rùn)程度(圖3B)。隨后，分析比較高、低免疫浸潤(rùn)組ccRCC患者預(yù)后，發(fā)現(xiàn)在總體生存率、無(wú)病生存率、無(wú)進(jìn)展生存率方面，高免疫浸潤(rùn)組患者的預(yù)后均優(yōu)于低免疫浸潤(rùn)組(圖3C～E)。

圖3 腫瘤組織免疫浸潤(rùn)程度對(duì)ccRCC患者預(yù)后的影響

2.4 SETD2突變與ccRCC腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性該研究通過(guò)基因突變景觀分析了SETD2分別在高免疫浸潤(rùn)、低免疫浸潤(rùn)兩組中的突變頻率，在低免疫浸潤(rùn)患者中，SETD2基因突變頻率高達(dá)10%，而在高免疫浸潤(rùn)樣本中，SETD2基因突變頻率達(dá)2%，即SETD2基因突變頻率兩組中存在明顯差異，低免疫浸潤(rùn)(10%)vs高免疫浸潤(rùn)(2%)，提示SETD2可能在ccRCC患者中起調(diào)控免疫浸潤(rùn)的作用(圖4)。

圖4 ccRCC不同免疫浸潤(rùn)程度患者各基因突變頻率及SETD2基因突變分布A：低免疫浸潤(rùn)組; B：高免疫浸潤(rùn)組

2.5 SETD2突變對(duì)免疫浸潤(rùn)的影響及患者預(yù)后上述結(jié)果表明SETD2的表達(dá)與ccRCC的免疫浸潤(rùn)相關(guān)，并且SETD2的表達(dá)也與腫瘤的良好預(yù)后有關(guān)。該研究進(jìn)一步在高、低免疫浸潤(rùn)組內(nèi)將患者分為SETD2突變型(Mut)組、野生型(WT)組，利用TIMER2分析4組免疫浸潤(rùn)評(píng)分。結(jié)果顯示在高、低免疫浸潤(rùn)組內(nèi)比較，SETD2突變組中各免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度均比野生型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，CD8+T細(xì)胞在SETD2突變組與野生型組的浸潤(rùn)程度差異最明顯，且在高免疫浸潤(rùn)SETD2 WT組中免疫評(píng)分最高(圖5A、B)。進(jìn)一步分析比較4組患者的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)高免疫浸潤(rùn)SETD2 WT組患者預(yù)后最好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5C)。

圖5 ccRCC患者高、低免疫浸潤(rùn)組中SETD2突變組及野生型組免疫浸潤(rùn)評(píng)分及患者預(yù)后

2.6 SETD2對(duì)ccRCC預(yù)后及免疫浸潤(rùn)的影響分別對(duì)該院50例ccRCC患者性別、年齡、Fuhrman分級(jí)及TMN分期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)SETD2 mRNA表達(dá)中位水平，將患者分為SETD2高、低表達(dá)兩組。結(jié)果表明SETD2表達(dá)水平與患者性別、年齡不相關(guān)，而與Fuhrman分級(jí)及TMN分期有顯著相關(guān)，SETD2低表達(dá)組分級(jí)及分期級(jí)別更高(表1)。此外，比較兩組患者預(yù)后，OS生存曲線顯示，SETD2高表達(dá)組患者的總生存曲線相較于SETD2低表達(dá)組患者更佳(圖6)。

表1 SETD2表達(dá)水平與患者性別、年齡、Fuhrman分級(jí)、TMN分期的相關(guān)性

圖6 SETD2高、低表達(dá)組患者OS生存曲線與SETD2低表達(dá)組比較：**P<0.01

為了進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析所得結(jié)果：SETD2突變可能降低ccRCC腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)(以CD8+TIL最顯著)從而使患者預(yù)后差，該研究利用免疫熒光檢測(cè)患者ccRCC組織SETD2、CD8+表達(dá)位置及其強(qiáng)度。結(jié)果顯示SETD2高表達(dá)組織中CD8+表達(dá)也顯著增高(圖7)，提示SETD2可能促進(jìn)腫瘤組織中CD8+TIL細(xì)胞浸潤(rùn)，從而緩解患者預(yù)后。

圖7 ccRCC組織中SETD2、CD8+免疫熒光表達(dá)與SETD2低表達(dá)組比較：*P<0.05

3 討論

SETD2是包含核受體SET域 (NSD) 家族的關(guān)鍵成員，是迄今在人體組織中發(fā)現(xiàn)的唯一參與H3K36me3形成過(guò)程的分子[5-6]，相關(guān)學(xué)者在多種人類(lèi)惡性腫瘤中都曾檢測(cè)到SETD2發(fā)生突變或功能喪失，導(dǎo)致相應(yīng)腫瘤組織蛋白甲基化、去甲基化和表觀突變失衡，從而致使腫瘤發(fā)生及惡化[7-8]。在ccRCC中，有研究[9]表明SETD2在腫瘤組織突變率較高，且可能與患者的不良預(yù)后相關(guān)。然而，既往的報(bào)道[10]關(guān)于SETD2突變頻率的高低不盡一致，SETD2突變影響ccRCC患者預(yù)后的具體調(diào)控機(jī)制也并不明確。該研究在ccRCC中針對(duì)SETD2突變對(duì)腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)控最終影響患者預(yù)后的機(jī)制進(jìn)行了初步探究。

對(duì)于晚期腎癌，由于化療藥物療效差，免疫療法已成為治療的重要手段。然而近年來(lái)隨著在臨床的廣泛應(yīng)用，免疫治療也出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，僅40%的患者對(duì)免疫治療反應(yīng)敏感。對(duì)于腎癌免疫微環(huán)境的探索仍有待突破。既往有研究[11-12]表明，腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞(tumor-infiltrating immune cells, TIICs)是RCC預(yù)后的重要決定因素，腫瘤免疫浸潤(rùn)與臨床預(yù)后密切相關(guān)。該研究表明在高免疫浸潤(rùn)組ccRCC患者中，SETD2的表達(dá)水平更高,且患者預(yù)后更好。驗(yàn)證了TIICs與ccRCC患者預(yù)后的相關(guān)性，且SETD2可能在此過(guò)程中發(fā)揮作用。為了探明SETD2對(duì)ccRCC免疫浸潤(rùn)的影響，分別將高、低免疫浸潤(rùn)組ccRCC患者分為SETD2野生型及突變型組，分析顯示SETD2突變組中各免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度均比野生型組低，高免疫浸潤(rùn)SETD2 WT組患者預(yù)后最好；其中，CD8+T細(xì)胞在SETD2突變組與野生型組的浸潤(rùn)程度差異最明顯，且在高免疫浸潤(rùn)SETD2 WT組中免疫評(píng)分最高。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為在多數(shù)惡性腫瘤中，CD8+T細(xì)胞高浸潤(rùn)患者預(yù)后更好。然而，CD8+T細(xì)胞在ccRCC腫瘤組織中的浸潤(rùn)程度對(duì)患者預(yù)后的影響仍有爭(zhēng)議。有研究[13]認(rèn)為CD8+TIL高浸潤(rùn)ccRCC患者預(yù)后更好，也有觀點(diǎn)[14]認(rèn)為CD8+TIL高浸潤(rùn)患者預(yù)后更差。結(jié)合該院ccRCC患者資料，研究表明SETD2高表達(dá)提示更好的患者預(yù)后，且與CD8+TIL高浸潤(rùn)相關(guān), 與通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析所得結(jié)論相互佐證。而報(bào)道稱(chēng)CD8+TIL高浸潤(rùn)ccRCC患者預(yù)后更差的相關(guān)學(xué)者研究[14]表明，ccRCC腫瘤組織中浸潤(rùn)的部分CD8+T細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)CXCL13這一趨化因子的表達(dá)，若CXCL13與CD8+蛋白雙陽(yáng)性T細(xì)胞這一亞群高表達(dá)，即會(huì)出現(xiàn)免疫逃逸，從而導(dǎo)致CD8+TIL高浸潤(rùn)ccRCC患者預(yù)后反而更差。

綜上所述，該研究結(jié)果揭示了ccRCC中SETD2高表達(dá)及腫瘤組織CD8+T細(xì)胞高浸潤(rùn)均是患者的良好預(yù)后的指標(biāo)，且SETD2高表達(dá)時(shí)，CD8+TIL高浸潤(rùn)對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生的積極作用更明顯。然而，SETD2高表達(dá)是通過(guò)何種下游分子來(lái)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用，如何與CD8+T細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)相互作用來(lái)達(dá)到對(duì)ccRCC發(fā)展更好的控制作用的具體通路仍有待進(jìn)一步探究。