徐 東，陸歡華，王曉亮，吳偉新

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是目前常見的惡性腫瘤之一，病死率高，且該病的發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢(shì)[1]。手術(shù)切除是治療肝癌最有效的治療方法，但高復(fù)發(fā)率、早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及對(duì)化療和放療的頻繁抵抗導(dǎo)致預(yù)后不良[2]。因此，尋找有效的生物標(biāo)志物對(duì)肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后改善具有重要意義。長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一類位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，長(zhǎng)度超過200 bp的核苷酸[3]。已經(jīng)證實(shí)lncRNAs可以調(diào)節(jié)大腦發(fā)育、胚胎發(fā)育、組織分化和器官發(fā)生等[4-5]。最近的研究[6]表明，lncRNAs也參與了癌癥中許多復(fù)雜的細(xì)胞過程。如SH3BP5-AS1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)中異常表達(dá)。然而，SH3BP5-AS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。該研究旨在探討SH3BP5-AS1在肝癌中的表達(dá)特點(diǎn)并分析其對(duì)人肝癌細(xì)胞株Hep 3B和Huh 7細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣本與主要試劑

1.1.1病例資料與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 從在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院接受肝切除術(shù)的患者中收集了總共91對(duì)肝癌和腫瘤鄰近組織。所有肝癌患者均未接受任何術(shù)前治療，如射頻消融、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞、免疫治療和靶向治療。組織樣本由2名組織病理學(xué)專家確認(rèn)。所有樣品立即在液氮中速凍，隨后儲(chǔ)存在-80 ℃用于RNA提取。正常肝細(xì)胞THLE-2和肝癌細(xì)胞系Huh 7、BEL-7405、SNU-387和Hep 3B均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑 TRIzol試劑和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自美國(guó)麻省Thermo Fisher公司；SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自大連寶生物公司；CCK-8、BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、FITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒和cycle TEST PLUS DNA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司。引物序列合成購(gòu)自深圳華大基因公司。

1.2 方法

1.2.1qRT-PCR法檢測(cè)SH3BP5-AS1和跨膜蛋白6超家族成員2 (transmembrane 6 superfamily member 2, TM6SF2)在肝癌組織/細(xì)胞中表達(dá) TRIzol試劑用于從HCC組織和培養(yǎng)細(xì)胞中分離總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR分析使用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ在ABI PRISM 7300序列檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SH3BP5-AS1和TM6SF2表達(dá)，由GAPDH歸一化相對(duì)基因表達(dá)。SH3BP5-AS1引物序列(F：5′-ATCAGGCTCAGGTTTGCTCC-3′；R：5′-AGGCTAGCAGGGTAGTCTTCA-3′)；TM6SF2引物序列(F：5′-CCCTAAGGTGCAGATGCTGA-3′；R：5′-CACGGTAGGTGAAGGGTGTG-3′)。

1.2.2沉默SH3BP5-AS1表達(dá) 設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)SH3BP5-AS1特異性小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)序列，si-SH3BP5-AS1-1序列(F：5′GCUGUUUAAUGUUCUUAAAUA-3′；R：5′-UUUAAGAACAUUAAACAGCCG-3′)；si-SH3BP5-AS1-2序列(F：5′-GGAGACUAAGUGAAGACUACC-3′；R：5′-UAGUCUUCACUUAGUCUCCUG-3′)。通過轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)期的Hep 3B細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后通過qRT-PCR法檢測(cè)SH3BP5-AS1沉默效率?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)可視化軟件UALCAN[6]分析。

1.2.3細(xì)胞增殖活性檢測(cè) ① CCK-8法：以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度種植到96孔板后，10 μl CCK-8試劑加入到每個(gè)孔中，孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的吸光度。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為細(xì)胞貼壁后的0、24、48、72 h。② 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：將500個(gè)細(xì)胞種植到細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中。持續(xù)培養(yǎng)直至出現(xiàn)可見克隆，除去培養(yǎng)基，并用4%多聚甲醛溶液將細(xì)胞固定30～60 min，用0.1%結(jié)晶紫染色，拍照并計(jì)數(shù)。③ 流式檢測(cè)EdU法：將細(xì)胞培養(yǎng)在12孔板上48 h后，按照BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒操作，添加100 mg/L EdU試劑，孵育2 h，并用DAPI試劑對(duì)細(xì)胞核染色5 min，細(xì)胞懸液樣品進(jìn)行流式檢測(cè)并分析EdU+陽性細(xì)胞比例。

1.2.4流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期 胰蛋白酶法收獲細(xì)胞。在FITC-Annexin V和碘化丙啶雙重染色后，使用FITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。使用cycle TEST PLUS DNA試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧化丙啶染色后，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，并通過FACScan軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SH3BP5-AS1在肝癌中表達(dá)水平qRT-PCR結(jié)果顯示SH3BP5-AS1在肝癌組織中相對(duì)表達(dá)量為(3.46±0.80)，在癌旁組織中相對(duì)表達(dá)量為(1.62±0.74)，其在臨床肝癌組織中高表達(dá)(P<0.05，圖1A)。基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)可視化軟件UALCAN分析，結(jié)果表明SH3BP5-AS1在大樣本肝癌組織(n=371)中高表達(dá)，且在肝癌臨床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中同樣高表達(dá)(P<0.05，圖1B)。細(xì)胞水平檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于正常肝細(xì)胞THLE-2，SH3BP5-AS1在不同肝癌細(xì)胞系Huh 7、BEL-7405、SNU-387和Hep 3B中表達(dá)均不同程度升高(P<0.05，圖1C)。

圖1 SH3BP5-AS1在肝癌中表達(dá)水平

2.2 沉默SH3BP5-AS1表達(dá)效率檢測(cè)Hep 3B細(xì)胞中，通過siRNA技術(shù)沉默SH3BP5-AS1表達(dá)后，qRT-PCR結(jié)果顯示，SH3BP5-AS1在空白組中相對(duì)表達(dá)量為(1.02±0.09)，在對(duì)照組中相對(duì)表達(dá)量為(0.98±0.05)，在si-SH3BP5-AS1沉默組-1組中相對(duì)表達(dá)量為(0.16±0.03)，在si-SH3BP5-AS1沉默組-2中相對(duì)表達(dá)量為(0.32±0.02)，表達(dá)量分別降為之前的約1/6、1/3。沉默SH3BP5-AS1表達(dá)的Hep 3B細(xì)胞用于后續(xù)功能研究(P<0.01)。

2.3 沉默SH3BP5-AS1對(duì)Hep 3B細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，si-SH3BP5-AS1沉默組-1和si-SH3BP5-AS1沉默組-2在48 h和72 h吸光度值(450 nm)均降低(P<0.05，圖2A)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空白組、對(duì)照組、si-SH3BP5-AS1沉默組-1和si-SH3BP5-AS1沉默組-2細(xì)胞克隆數(shù)分別為(323.00±19.00)、(312.30±16.07)、(156.00±9.16)(F=111.80，P<0.05)和(181.70±15.63)(F=64.54，P<0.05)(圖2B)。Edu結(jié)果顯示空白組、對(duì)照組、si-SH3BP5-AS1沉默組-1和si-SH3BP5-AS1沉默組-2 Edu+陽性細(xì)胞比例分別為(25.42±1.20)、(25.85±0.77)、(14.69±1.13)(F=109.10，P<0.05)和(16.56±1.15)(F=73.76，P<0.05)(圖2C)。以上結(jié)果均表明沉默SH3BP5-AS1具有抑制Hep 3B細(xì)胞增殖能力。

圖2 沉默SH3BP5-AS1抑制Hep 3B細(xì)胞增殖作用

2.4 沉默SH3BP5-AS1對(duì)Hep 3B細(xì)胞凋亡的影響流式結(jié)果顯示，空白組、對(duì)照組、si-SH3BP5-AS1沉默組-1和si-SH3BP5-AS1沉默組-2總細(xì)胞凋亡率分別為(12.77±0.80)、(13.58±0.63)、(26.47±0.82)和(23.56±1.47)；與對(duì)照組比較，si-SH3BP5-AS1沉默組-1(F=31.25，P<0.05)和si-SH3BP5-AS1沉默組-2(F=26.06，P<0.05)總細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)，結(jié)果表明沉默SH3BP5-AS1促進(jìn)Hep 3B細(xì)胞凋亡能力。

圖3 沉默SH3BP5-AS1促進(jìn)Hep 3B細(xì)胞凋亡作用

2.5 沉默SH3BP5-AS1對(duì)Hep 3B細(xì)胞周期影響流式結(jié)果顯示空白組、對(duì)照組和SH3BP5-AS1沉默組處于G1期細(xì)胞的比例為(20.05±3.49)、(20.86±1.89)、(35.95±2.70)和(33.59±2.03)(P<0.05)，處于S期細(xì)胞的比例為(22.68±7.52)、(24.74±1.09)、(27.29±6.98)和(30.17±10.55)，處于G2期細(xì)胞的比例為(57.27±4.97)、(54.40±2.40)、(36.76±9.66)和(36.24±10.39)。見圖4。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比，沉默SH3BP5-AS1組G1期細(xì)胞增多。

圖4 沉默SH3BP5-AS1對(duì)Hep 3B細(xì)胞周期影響

2.6 SH3BP5-AS1和TM6SF2在肝癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)qRT-PCR檢測(cè)沉默SH3BP5-AS1細(xì)胞中TM6SF2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，沉默SH3BP5-AS1組中TM6SF2呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05，圖5A)。基于肝癌組織中SH3BP5-AS1和TM6SF2表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)并分析表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者在肝癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)(R2=0.26，95%CI：-0.39～-0.19，P<0.05，圖5B)。

圖5 SH3BP5-AS1和TM6SF2在肝癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)

3 討論

肝癌是全球第6大常見癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。雖然目前肝癌的診斷和治療已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但肝癌患者的長(zhǎng)期生存率仍然很低。肝癌預(yù)后不良主要有兩個(gè)原因：一是腫瘤復(fù)發(fā)；二是原發(fā)性腫瘤在剩余肝臟的發(fā)展/轉(zhuǎn)移[7]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種基因改變。越來越多的學(xué)者[8]開始關(guān)注肝癌發(fā)生和發(fā)展過程中多種因素的協(xié)同作用，包括miRNA、lncRNA和表觀遺傳因素等。在過去的幾年中，諸多l(xiāng)ncRNAs在肝癌發(fā)展/轉(zhuǎn)移中的重要性已經(jīng)被證實(shí)。Huang et al[9]研究表明lncRNA-MIAT通過吸附miR-214促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲；Chao et al[10]研究表明lncRNA-D16366在大樣本肝細(xì)胞癌患者組織和血清中含量較對(duì)照組明顯降低，其表達(dá)受腫瘤大小、HbsAg、門靜脈癌栓、Child-Pugh評(píng)分、治療和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，可作為HCC的獨(dú)立診斷和預(yù)后指標(biāo)。Lee et al[11]在針對(duì)79例肝癌患者的前瞻性研究中，表明外周血lncRNA-ATB與肝癌TNM分期及T分期、門靜脈血栓形成等預(yù)后因素有關(guān)，表明lncRNA-ATB的升高是病死率和疾病進(jìn)展的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

lncRNA SH3BP5-AS1是SH3BP5的反義轉(zhuǎn)錄本1，長(zhǎng)度為5 592 bp。目前有關(guān)SH3BP5-AS1在腫瘤研究中較少，僅檢索到的文獻(xiàn)是Lina et al[6]在研究HNSCC中，應(yīng)用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)對(duì)與HNSCC預(yù)后相關(guān)的lncRNAs共表達(dá)模塊進(jìn)行分析，結(jié)果表明SH3BP5-AS1可以作為HNSCC的獨(dú)立預(yù)后因子，主要參與血管發(fā)育、分解代謝過程的正向調(diào)節(jié)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。該研究旨在探索SH3BP5-AS1在肝癌中的差異表達(dá)及其促進(jìn)肝癌發(fā)生的可能機(jī)制。首先，基于收集到的臨床肝癌樣本，通過qRT-PCR定量檢測(cè)SH3BP5-AS1表達(dá)量，結(jié)果顯示其在肝癌組織中高表達(dá)；同時(shí)，通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析網(wǎng)站UALCAN，表明SH3BP5-AS1在大樣本肝癌組織(n=371)中高表達(dá)；此外，細(xì)胞水平檢測(cè)結(jié)果同樣顯示SH3BP5-AS1在不同肝癌細(xì)胞中高水平表達(dá)。以上均表明SH3BP5-AS1在肝癌中高表達(dá)，其在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。為了研究SH3BP5-AS1在肝癌細(xì)胞中的潛在功能，該研究通過siRNA技術(shù)沉默SH3BP5-AS1表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示設(shè)計(jì)的2個(gè)平行si-SH3BP5-AS1均是有效的，選擇沉默效率更高的si-SH3BP5-AS1-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

腫瘤細(xì)胞增殖活性與其生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和浸潤(rùn)等生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)[12]。該研究通過CCK-8、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和Edu方法檢測(cè)si-SH3BP5-AS1后Hep 3B的增殖，結(jié)果一致表明，沉默SH3BP5-AS1抑制肝癌細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞凋亡，也稱為程序性細(xì)胞死亡，是在特定時(shí)間段內(nèi)活躍發(fā)生的基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過程。該研究結(jié)果顯示沉默SH3BP5-AS1促進(jìn)Hep 3B細(xì)胞凋亡能力。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)節(jié)的重要手段，又是機(jī)體免受腫瘤危害的重要保護(hù)機(jī)制，癌變了的細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力通常極低，而增殖能力則相應(yīng)增強(qiáng)，這直接導(dǎo)致了瘤細(xì)胞快速而病態(tài)地分裂增殖[13]，表明SH3BP5-AS1可能通過抑制凋亡促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。在腫瘤中，常見調(diào)節(jié)細(xì)胞周期機(jī)制和頻率元件的錯(cuò)亂反映出異常的細(xì)胞周期對(duì)腫瘤惡性增殖表型的重要性[14]。該研究結(jié)果顯示，沉默SH3BP5-AS1組G1期細(xì)胞增多，說明沉默SH3BP5-AS1可能將肝癌細(xì)胞阻斷在DNA合成前期，從而抑制細(xì)胞增殖。

TM6SF2主要表達(dá)于與載脂蛋白B(APOB)-脂蛋白產(chǎn)生相關(guān)的組織中，包括肝臟、小腸和腎臟，提示在脂蛋白代謝中可能發(fā)揮作用。該課題組前期研究[15]表明TM6SF2在肝癌中表達(dá)降低，該研究表明TM6SF2在沉默SH3BP5-AS1肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，且基于肝癌組織中SH3BP5-AS1和TM6SF2兩者表達(dá)負(fù)相關(guān)，提示SH3BP5-AS1可能基于TM6SF2發(fā)揮作用。

綜上所述，該研究表明SH3BP5-AS1是一個(gè)重要的促癌非編碼RNA。該研究可為肝癌患者的腫瘤靶向治療提供理論基礎(chǔ)。