林樂豐，范冰峰，許保增

（特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112）

黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH）是由下丘腦促性腺激素釋放激素刺激垂體前葉分泌的一種異源二聚體糖蛋白激素，它在結(jié)構(gòu)和功能上與人絨毛膜促性腺激素相關(guān)，在卵泡生長發(fā)育和排卵過程中起著重要作用，LH 在所有物種中（包括人類）都有分布，在一個(gè)生殖周期中，LH 激增會(huì)使已分裂停滯的卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，繼續(xù)其細(xì)胞周期。LH 激增前，減數(shù)分裂阻滯由卵母細(xì)胞內(nèi)高水平環(huán)磷酸腺苷（Cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP）維持，壁顆粒細(xì)胞表達(dá)的C 型鈉肽與卵丘細(xì)胞中鈉肽受體2（Natriuretic Peptide Receptor 2，NPR2）結(jié)合產(chǎn)生環(huán)磷酸鳥苷（Cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP），通過縫隙連接運(yùn)送到卵母細(xì)胞阻止cAMP 降解。LH 激增后，高水平的LH 作用于黃體生成素受體激活G 蛋白偶聯(lián)受體活性，使壁顆粒細(xì)胞中cAMP 水平升高。高水平cAMP 激活絲裂原活化蛋白激酶、表皮細(xì)胞生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）等信號通路，使其參與微管的裝配與紡錘體的組裝，以及第一、第二極體排出。本文從LH 對下游不同信號通路的激活和抑制及調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟和排卵的機(jī)制進(jìn)行綜述，為獲得高質(zhì)量卵母細(xì)胞，提高雌性良種家畜擴(kuò)繁效率提供理論基礎(chǔ)。

1 卵母細(xì)胞第1 次減數(shù)分裂阻滯的調(diào)控機(jī)制

哺乳動(dòng)物體內(nèi)卵母細(xì)胞在胎兒期就已進(jìn)行分化，并停滯在第1 次減數(shù)分裂前期的末期，即雙線期。cAMP 是存在于卵母細(xì)胞內(nèi)的第2 信使，高水平的cAMP 對哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)具有抑制作用。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶和細(xì)胞周期蛋白B 結(jié)合，形成成熟促進(jìn)因子對減數(shù)分裂周期具有調(diào)控作用，cAMP 激活蛋白激酶A（Protein Kinases A，PKA）信號通路從而抑制周期蛋白激酶活性，阻止減數(shù)分裂恢復(fù)。卵母細(xì)胞膜上有許多G 蛋白偶聯(lián)受體，其中GPR3 和GPR12 對減數(shù)分裂的阻滯起作用，并在小鼠、大鼠和非洲爪蟾的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，它可將胞外信號傳遞給胞內(nèi)Gs 蛋白，使腺苷酸環(huán)化酶活化，使卵母細(xì)胞產(chǎn)生cAMP。卵母細(xì)胞中存在的磷酸二酯酶3 在有活性的情況下會(huì)促進(jìn)cAMP 降解，恢復(fù)減數(shù)分裂，細(xì)胞中cGMP 的存在能夠抑制磷酸二酯酶3 活性。顆粒細(xì)胞表達(dá)的C 型鈉肽作用于卵丘細(xì)胞中NPR2 生成cGMP，通過縫隙連接蛋白37 進(jìn)入卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞自身并不表達(dá)NPR2，也不能自行產(chǎn)生cGMP。卵母細(xì)胞中高水平cGMP 是阻止細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的主要原因。顆粒細(xì)胞通過縫隙連接使卵母細(xì)胞停滯在減數(shù)第一次分裂，這種調(diào)控系統(tǒng)已在小鼠等哺乳動(dòng)物身上得到驗(yàn)證。小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的信號通路如圖1 所示。

圖1 小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的信號通路（圖片參考Zhang 等[8]）

2 LH 信號恢復(fù)卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的機(jī)制

2.1 LH 結(jié)合受體激活EGF 和MAPK3/1 下游信號通路減數(shù)分裂恢復(fù)過程的信號通路如圖2 所示。LH 激增并與顆粒細(xì)胞上受體結(jié)合激活G 蛋白偶聯(lián)受體，提高細(xì)胞中cAMP 水平。cAMP 激增是后續(xù)眾多信號通路的關(guān)鍵，高水平cAMP 可以增加EGF 表達(dá)，使EGF 與受體EGFR 結(jié)合，EGFR 激活是縫隙連接關(guān)閉和卵母細(xì)胞cGMP 降低的部分原因。大鼠排卵前LH 峰會(huì)誘導(dǎo)表調(diào)節(jié)蛋白和雙調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，它們都屬于EGF家族成員。這些EGF 樣因子激活了絲裂原活化蛋白激酶3/1（Mitogen-activated Protein Kinases 3 and 1，MAPK3/1），也被稱為細(xì)胞外信號激酶1/2（Extracellular Signal-regulated Kinases 1 and 2，ERK1/2）通路。MAPK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，ERK1/2 是其中的一個(gè)亞族，在減數(shù)分裂恢復(fù)過程中起著重要作用。卵母細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證明，ERK1/2 活性對自發(fā)的減數(shù)分裂恢復(fù)并不是必需的，但對于卵丘細(xì)胞是必要的，即使用外源激素處理ERK1/2小鼠，也沒有卵母細(xì)胞成熟和生發(fā)泡破裂。ERK1/2 激活促進(jìn)前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2 在卵泡液中合成前列腺素E2。缺乏過氧化物合成酶2 或前列腺素受體2 的小鼠排卵數(shù)少且卵母細(xì)胞完全喪失受精能力，表明前列腺素E2 在排卵過程中起到重要作用。此外，前列腺素E2 可以通過誘導(dǎo)cAMP/PKA 和MAPK3/1 通路合成表調(diào)節(jié)蛋白和雙調(diào)蛋白來模擬LH 的作用。上述結(jié)果表明EGF 樣因子和前列腺素E2 之間存在著正反饋?zhàn)饔谩?/p>

圖2 減數(shù)分裂恢復(fù)過程的信號通路（圖片參考Richards 等[9]）

最近有研究根據(jù)基因芯片數(shù)據(jù)和定量逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果，證明許多與排卵相關(guān)的基因在ERK1/2的卵巢中不表達(dá)。因此，LH 最初表達(dá)表調(diào)節(jié)蛋白和雙調(diào)節(jié)蛋白在很大程度上不依賴于ERK1/2 通路。然而表調(diào)節(jié)蛋白、雙調(diào)節(jié)蛋白的后續(xù)表達(dá)可能依賴于ERK1/2 對前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2 的作用，使前列腺素E2 高表達(dá)。腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶被證明是小鼠胚胎細(xì)胞中表調(diào)節(jié)蛋白和雙調(diào)節(jié)蛋白的主要釋放酶，cAMP 依賴途徑激活顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶，釋放EGF 樣因子激活EGF-MAPK3/1 通路。此外，增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-b 缺失小鼠卵巢表型與Erk1/2表型相似。只有在增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-b 表達(dá)的細(xì)胞中，雙調(diào)蛋白才能誘導(dǎo)ERK1/2 依賴的靶基因（）表達(dá)。因此，增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-b 是ERK1/2 直接底物，兩者共同構(gòu)成了顆粒細(xì)胞重要信號網(wǎng)絡(luò)。

2.2 EGF 和MAPK3/1 信號通路降低卵母細(xì)胞中cGMP含量 利鈉肽前體C（NPPC）作用于卵丘細(xì)胞上鈉肽受體（NPR2）提高卵丘細(xì)胞中cGMP 水平，阻止減數(shù)分裂恢復(fù)，因此下調(diào)NPPC 和NPR2 信號通路在減數(shù)分裂恢復(fù)過程中起著重要作用。相應(yīng)的，NPPC 或NPR2 缺失或突變使小鼠恢復(fù)減數(shù)分裂。有實(shí)驗(yàn)證明，用雙調(diào)蛋白作用于小鼠卵泡培養(yǎng)液，其中NPPC 的受抑制程度與使用LH 的結(jié)果相同，EGFR 激酶抑制劑AG1478 可以消除雙調(diào)蛋白對NPPC 的抑制作用，說明LH-雙調(diào)蛋白-EGFR 信號通路的激活可以下調(diào)NPPC表達(dá)。同樣地，在小鼠體外培養(yǎng)卵丘卵母復(fù)合體實(shí)驗(yàn)中，EGFR 信號激活使NPR2 表達(dá)水平顯著下降，但是減數(shù)分裂過程仍然受阻，可能是由于細(xì)胞中NPR2 半衰期較長，卵丘細(xì)胞中NPR2 水平并未降低。EGF可以提高卵丘細(xì)胞中鈣水平，使NPR2 失活，降低與NPPC 結(jié)合力，減少相互作用，從而恢復(fù)減數(shù)分裂。NPR2 失活還與其去磷酸化有關(guān)。用抑制絲氨酸-蘇氨酸磷酸化酶中的PPP 家族試劑斑瀉素 100 μmol/L 或?qū)锼?10 μmol/L 預(yù)先孵育卵泡1h，可阻止NPR2 活性降低。這些結(jié)果表明PPP 家族磷酸酶活性是NPR2 去磷酸化所必需的，而LH 誘導(dǎo)NPR2 活性降低也需要去磷酸化。LH 介導(dǎo)雌二醇-雌二醇受體信號通路同樣可以降低NPPC 和NPR2 表達(dá)，雌二醇受體包括（ER和ER）。在對和啟動(dòng)子進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)中，小鼠載體和載體的共轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)了熒光素酶活性，表明ER、ER可以加強(qiáng)和基因的轉(zhuǎn)錄。且在ER、ER過表達(dá)的細(xì)胞中，雌二醇顯著促進(jìn)NPPC/NPR2 表達(dá)，因此雌二醇-雌二醇受體通路可以增加顆粒細(xì)胞中NPPC 和NPR2 含量，阻止減數(shù)分裂的恢復(fù)。在人超數(shù)排卵實(shí)驗(yàn)中，卵丘細(xì)胞中LH 受體含量與血清中雌二醇呈負(fù)相關(guān)，LH 激增后，LH 受體在卵丘細(xì)胞中表達(dá)，雌二醇水平下降，NPPC 和NPR2 含量降低，減數(shù)分裂恢復(fù)。原因是垂體分泌卵泡刺激素（FSH）作用于受體后增加芳香化酶表達(dá)，而LH 激增會(huì)降低這種作用，使產(chǎn)生雌二醇的顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生黃體細(xì)胞。

在大鼠和小鼠顆粒細(xì)胞中cGMP 水解由cGMP 結(jié)合磷酸二酯酶（PDEs）活性決定，主要是PDE1A 和PDE5。PDE5 的N 端有2 個(gè)與cGMP 結(jié)合的高度同源結(jié)構(gòu)域，為GAF A 和GAF B。cGMP 與GAF A 結(jié)合改變PDE5 構(gòu)象，直接激活PDE5 水解活性，而不需要使其磷酸化。另一方面，LH 信號在傳導(dǎo)過程中增加了PKA 含量，誘導(dǎo)PDE5 磷酸化，激活其活性，從而進(jìn)一步降低顆粒細(xì)胞中cGMP 含量。用腺苷酸磷酸化酶激活劑Forskolin 處理的大鼠卵泡PDE5 活性增加，與LH的反應(yīng)結(jié)果相同，證明PKA 和PKG 磷酸化PDE5 上絲氨酸位點(diǎn)是LH 誘導(dǎo)PDE5 活性增加的原因。此外，PDE5 活性增加與NPR2 去磷酸化導(dǎo)致的cGMP 下降是同時(shí)發(fā)生。

哺乳動(dòng)物的縫隙連接通道由連接蛋白基因家族蛋白組成，這些通道允許離子、氨基酸、核苷酸和二級信使（如Ca、葡萄糖、cAMP、cGMP）在細(xì)胞之間擴(kuò)散。其中連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）形成壁顆粒細(xì)胞間縫隙連接，維持成熟卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯的調(diào)節(jié)信號cGMP 通過縫隙連接從壁顆粒細(xì)胞擴(kuò)散到卵母細(xì)胞中。在減數(shù)分裂恢復(fù)過程中，LH 通過磷酸化降低其活性，使縫隙連接關(guān)閉，減少cAMP 擴(kuò)散水平以重啟細(xì)胞周期，這一過程是由MAPK 家族介導(dǎo)。LH 作用于受體后，刺激EGF、TPA 等物質(zhì)產(chǎn)生，引起Cx43 上特定氨基酸位點(diǎn)順序磷酸化，縮短其半衰期并使縫隙連接關(guān)閉。EGF 誘導(dǎo)AKT 磷酸化Cx43 上S373 和S369位點(diǎn)，誘導(dǎo)抑制Cx43：ZO-1 間相互作用，減少傳入縫隙連接通道的質(zhì)膜；MAPK 可以使Cx43 上S255、S279、S282 位點(diǎn)磷酸化，使縫隙連接關(guān)閉；最后PKC使S368 位點(diǎn)磷酸化。這些殘基磷酸化已被證明會(huì)影響縫隙連接通道門控特性和/或縫隙連接組裝減少，活化的src 也可以下調(diào)縫隙連接。LH 作用于受體后并不會(huì)降低Cx37 活性，卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間縫隙連接沒有受到顯著影響。這可能是因?yàn)槁涯讣?xì)胞減數(shù)分裂過程中需要卵丘細(xì)胞提供氨基酸、膽固醇等物質(zhì)，并將細(xì)胞中cGMP 運(yùn)輸?shù)铰亚鸺?xì)胞中。

3 LH 調(diào)控卵母細(xì)胞排卵的分子機(jī)制

3.1 LH 激活孕激素受體的表達(dá) 排卵是由LH 激增啟動(dòng)，它直接作用于卵泡膜和壁層顆粒細(xì)胞，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞胞質(zhì)和核成熟的最后階段，隨后卵泡破裂、黃體形成。排卵前卵母細(xì)胞并不表達(dá)LH 受體，盡管有報(bào)道稱卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞含有該受體，但是LH 信號強(qiáng)度明顯低于顆粒細(xì)胞。因此，LH 信號要到達(dá)卵母細(xì)胞，需要先產(chǎn)生第二信使cAMP 并通過縫隙連接將cAMP 傳到卵泡中。LH 與壁顆粒上的受體相互作用，激活腺苷酸環(huán)化酶，使卵泡內(nèi)第二信使cAMP 含量顯著上升。cAMP 升高導(dǎo)致PKA 激活，進(jìn)而激活cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，PKA 信號通路的激活也被認(rèn)為是排卵前卵泡介導(dǎo)LH 作用的主要途徑。排卵前，卵泡表面上皮細(xì)胞開始分裂，結(jié)締組織降解，在卵泡其他部位，顆粒細(xì)胞和囊膜細(xì)胞開始黃體化過程，顆粒細(xì)胞開始增大，并積累脂質(zhì)形成小滴，為類固醇激素合成提供膽固醇。排卵前，卵泡合成孕酮，在綿羊的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用異沙唑抑制孕酮合成，排卵過程會(huì)受到影響，此外，抗孕酮血清降低了用促性腺激素處理的未成熟大鼠排卵率，說明孕酮在排卵過程中起著不可缺少的作用。在人和豬的實(shí)驗(yàn)中，LH、FSH 和Forskolin 均可使孕激素受體（PGR）水平升高。孕酮受體即PGR 是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，在排卵前卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)，而卵丘細(xì)胞和膜細(xì)胞幾乎不表達(dá)?；蛲瑫r(shí)編碼PGR-a和PGR-b，當(dāng)雌性小鼠雙基因敲除后，小鼠不育，卵巢有巨大的有腔卵泡，卻無法啟動(dòng)排卵，表明PGR在排卵過程中起關(guān)鍵作用。雖然嚙齒類動(dòng)物和靈長類動(dòng)物在卵巢生理（單個(gè)排卵卵泡與多個(gè)排卵卵泡）和卵泡PGR 蛋白表達(dá)方面存在差異，但孕酮在靈長類卵巢中排卵也是通過PGR 介導(dǎo)。在恒河猴Pgr 敲除實(shí)驗(yàn)中，將腺病毒載體在排卵前22 h 注射卵泡中，PGR mRNA 被轉(zhuǎn)導(dǎo)為PGR siRNA，注射腺病毒載體卵泡中PGR mRNA 和蛋白表達(dá)受到抑制，體外顆粒細(xì)胞和體內(nèi)排卵周卵泡功能喪失，且沒有排卵痕跡，而對照組排卵不受到影響。

3.2 孕激素受體激活下游信號通路 內(nèi)皮素-2 是一種有效的血管活性分子，在卵泡顆粒細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，這種表達(dá)在PGR 缺失的小鼠卵巢中不復(fù)存在。Palanisamy等分別使用內(nèi)皮素-2 受體ETR-A 和ETR-B 的拮抗劑，發(fā)現(xiàn)用ETR-B 拮抗劑處理過的小鼠釋放卵母細(xì)胞數(shù)量顯著減少，ETR-B 在排卵前卵泡的壁細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞以及內(nèi)膜內(nèi)緣毛細(xì)血管中有較高表達(dá)。此外阻斷內(nèi)皮素-2 通路顯著降低了cGMP 依賴的蛋白激酶II表達(dá)水平，說明蛋白激酶II 受顆粒細(xì)胞中內(nèi)皮素-2 信號的調(diào)控。內(nèi)皮素-2 通過自分泌作用于壁細(xì)胞中的ETR-B 產(chǎn)生蛋白激酶II，也可以通過旁分泌刺激內(nèi)皮型一氧化氮合酶生成一氧化氮作用于卵丘細(xì)胞，誘導(dǎo)這些細(xì)胞合成蛋白激酶II。Richards 等認(rèn)為蛋白激酶II 是合成急性調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)鍵分子，蛋白激酶II 與排卵過程中某些功能相關(guān)。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是排卵過程中PGR 調(diào)節(jié)的下游靶點(diǎn)，參與脂肪細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，以及控制炎癥反應(yīng)。在排卵過程中，該受體基因條件性丟失雖然不會(huì)影響卵泡發(fā)育，但會(huì)阻止卵泡破裂。PPAR是一種配體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，它被環(huán)氧合酶的脂肪酸代謝產(chǎn)物所激活，激活的PPAR通過增加內(nèi)皮素-2、蛋白激酶II 和白細(xì)胞介素-6 表達(dá)介導(dǎo)PGR 功能，不受PPAR調(diào)節(jié)的分子如ADAMTS-1 可能也參與了排卵過程（圖3）。白細(xì)胞介素-6 mRNA 可以在小鼠顆粒細(xì)胞中檢測到，它是一種多功能細(xì)胞因子，也是炎癥介質(zhì)，具有廣泛的生物活性，如增加血管通透性、參與血管生成，可能在排卵和黃體形成過程中起作用，白細(xì)胞介素-6 也是大鼠T-激肽原基因的誘導(dǎo)劑，在排卵過程中增加白細(xì)胞介素-6 水平，對調(diào)節(jié)蛋白水解位置和速率起著重要的作用。ADAMTS-1 是一種由PGR 誘導(dǎo)的卵泡細(xì)胞外金屬蛋白酶，通過介導(dǎo)浸潤血管的基質(zhì)屏障降解促進(jìn)排卵卵泡中卵泡結(jié)構(gòu)重塑，在卵丘卵母復(fù)合體基質(zhì)形成和分解代謝中起到關(guān)鍵作用。在ADAMTS-1的小鼠中，排卵率降低了77%，排卵卵母細(xì)胞的受精率下降63%。ADAM8 是一種金屬蛋白酶，在排卵周卵泡顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中均有表達(dá)，ADAM8 可以改變細(xì)胞外基質(zhì)影響排卵過程，ADAM8 是PGR 潛在靶點(diǎn)，在PGR 缺失型小鼠中表達(dá)量顯著下降。此外，SNAP25是可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子粘附蛋白受體的重要組成因子，在囊泡胞吐過程中對細(xì)胞膜融合起重要作用，傳遞PGR 信號，也可以對細(xì)胞中白細(xì)胞介素-6水平進(jìn)行調(diào)控。

圖3 PGR 調(diào)控排卵的信號通路（參考Kim 等[45]）

4 小結(jié)

LH 在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)和排卵過程中起著重要作用。LH 激增后，激活MAPK 和EGF 信號通路，使顆粒細(xì)胞中C 型鈉肽與分泌在卵丘細(xì)胞NPR2 活性降低，顆粒細(xì)胞中cGMP 水解活性增加以及縫隙連接關(guān)閉，恢復(fù)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。LH 通過誘導(dǎo)PGR、EGF 表達(dá)并作用于下游信號調(diào)節(jié)分子ADAM8 和Snap25 等，增加蛋白水解酶和炎癥因子活性使卵泡膜破裂，卵母細(xì)胞排出。然而對于LH 調(diào)控卵母細(xì)胞成熟和排卵仍有問題值得去探索，如現(xiàn)有研究都是集中在小鼠上，在大型哺乳動(dòng)物及養(yǎng)殖生產(chǎn)中，現(xiàn)有結(jié)論是否仍舊適用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。了解LH 在這些過程中分子機(jī)制將為建立更加高效的卵母細(xì)胞體外成熟體系、提高體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量提供理論參考，也為提高雌性家畜擴(kuò)繁效率、擴(kuò)大畜牧養(yǎng)殖規(guī)模提供了理論基礎(chǔ)。