王志成，蘇昶祺，陳仕毅，賈先波，王 杰，張 明

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川成都 611130）

2020 年我國肉牛屠宰2 920 萬頭，肉?？偖a(chǎn)值達到5 540 億元。母牛終生自然繁殖只能產(chǎn)生7～8 個后代，肉牛繁殖率低已經(jīng)成為制約我國肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。利用動物繁殖生物技術使母牛進行雙胎生產(chǎn)是提高母牛繁殖率的有效手段。

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）是指通過卵母細胞體外成熟（IVM）、體外受精、經(jīng)過早期胚胎發(fā)育獲得體外胚胎，并將胚胎移植到受體體內(nèi)的過程。近年來，通過IVF-ET 方案可以獲得50%的妊娠率，有利于改善肉牛繁殖率，加速肉牛遺傳改良，該方案在北美洲肉牛生產(chǎn)中受到歡迎。隨著尼羅牛、瘤牛等肉牛品種卵母細胞品質(zhì)提高以及體外受精胚胎（IVP）全產(chǎn)業(yè)鏈的完善，在南美洲IVF-ET 技術已廣泛應用于商業(yè)化生產(chǎn)。日本采用胚胎分割或者囊胚分離技術分裂IVF 胚胎，生產(chǎn)同卵雙胚，應用于日本和牛雙胎生產(chǎn)，雙犢率可達到20%。另外，胚胎冷凍和性控精液技術的不斷優(yōu)化和發(fā)展推動了IVF-ET 技術產(chǎn)業(yè)化應用進程，提高了肉牛生產(chǎn)效益，但其穩(wěn)定性差、操作難度大、產(chǎn)業(yè)鏈不健全是限制IVF-ET 技術在我國產(chǎn)業(yè)化應用的重要原因。本文對國內(nèi)外IVF-ET 操作及雙胎生產(chǎn)進行技術總結(jié)，對該技術產(chǎn)業(yè)化應用研究進展和存在問題進行概述與分析，旨在為該技術在我國的產(chǎn)業(yè)化應用提供參考。

1 IVF 胚胎生產(chǎn)過程與現(xiàn)狀

1.1 卵母細胞收集 近年來，活體采卵-體外受精（OPU-IVF）技術在我國產(chǎn)業(yè)化應用中得到進一步優(yōu)化，綜合繁殖生物技術的應用使規(guī)?；龅姆敝吵苫盥侍岣?%，OPU 技術成為母?；铙w獲得高質(zhì)量卵母細胞的重要途徑。OPU 技術可以每周重復采卵2 次，甚至可從幼年母?；蛘呷焉? 個月內(nèi)的母牛卵巢上采集品質(zhì)較好的卵母細胞，不影響母牛卵泡波形成和繁殖水平。Trans Ova Genetics 和L'Alliance Boviteq 公司把OPU技術商業(yè)化應用于優(yōu)良母牛的快速繁殖，但生產(chǎn)成本高、妊娠率相對較低等制約了該技術在我國肉牛產(chǎn)業(yè)中的應用。同時OPU 獲得的85%以上卵母細胞處于凋亡閉鎖過程，卵母細胞品質(zhì)難以保證。隨著我國肉牛集約化屠宰水平的提高，在屠宰場規(guī)?；占殉蔡幚砗螅色@得較多卵母細胞。屠宰母牛通常繁殖機能低，自然情況下獲取有腔卵泡中卵母細胞的數(shù)量少、質(zhì)量低。因此，屠宰前對母牛進行超排處理是提高卵母細胞品質(zhì)重要的發(fā)展方向。目前，屠宰場收集卵母細胞仍是最便捷、廉價的牛卵母細胞收集方式，同時OPU 技術是未來獲得高質(zhì)量卵母細胞的重要發(fā)展方向。

1.2 卵母細胞IVM 培養(yǎng)及優(yōu)化 OPU 和屠宰廠獲得的卵母細胞絕大多數(shù)為未成熟卵母細胞，需在體外培養(yǎng)20～26 h 才能發(fā)育至成熟卵母細胞。卵母細胞IVM 與體內(nèi)成熟相比，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、染色體和紡錘體等結(jié)構和功能可能出現(xiàn)異常。活性氧可能損傷細胞核DNA 和細胞膜，從而導致卵母細胞處于氧化應激狀態(tài)，使胚胎發(fā)育能力下降。添加外源性激素、抗氧化物或者與卵丘細胞、間充質(zhì)干細胞和裸卵建立共培養(yǎng)體系是提高卵母細胞成熟率，改善胚胎品質(zhì)的重要方式（表1）。

表1 不同添加物對牛COCs 體外成熟培養(yǎng)液優(yōu)化效果

隨著研究不斷深入，不同的方案應用于卵母細胞IVM 以改善卵母細胞成熟率，促進IVF-ET 技術的產(chǎn)業(yè)化進程。采卵前超數(shù)排卵后再進行卵母細胞體外受精發(fā)育，囊胚率可到70% 以上，推測卵母細胞成熟率達到80% 以 上。Li 等、Albuz 等在IVM 之前用減數(shù)分裂抑制劑進行預處理（SPOM 方案），卵母細胞成熟率可達到80%～90%。有研究表明，減數(shù)分裂抑制劑的應用也有助于95～115 μm 較小卵子母源mRNA和蛋白質(zhì)積累，進一步促進胞質(zhì)成熟，提高體外胚胎品質(zhì)。新型的SMM（轉(zhuǎn)運與成熟培養(yǎng)基）培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)TCM199 培養(yǎng)基。由于SMM 不需要5% CO，因此應用于商業(yè)生產(chǎn)更加方便。如果以達到MII 期評估有腔卵泡中卵母細胞成熟率，牛卵母細胞IVM 體系已經(jīng)非常成熟，但要改善卵母細胞IVM 后早期胚胎發(fā)育，仍有大量的工作需要開展。另外，卵巢上大量無腔卵泡卵母細胞資源仍然無法利用,無腔卵泡中卵母細胞的研究將顯著提高可利用卵母細胞數(shù)目。因此，建立無腔卵泡中卵母細胞高效收集利用方法將提高胚胎生產(chǎn)效率和經(jīng)濟價值。

1.3 受精效率 IVM 后的卵母細胞轉(zhuǎn)移入TALP 液，與獲能精子進行精卵孵育，受精率可達70%～85%。精子品質(zhì)是制約體外受精的重要的因素，添加Ca、HCO和肝素可以顯著提高精子獲能率和受精效果。Swim-up 或Percoll 方法處理精子常被用來改善精子活力和質(zhì)量。透明帶打孔技術（PZD）、透明帶下注射技術（SUZI）和單精子胞漿內(nèi)注射（ICSI）以及微流控技術的發(fā)展有效提高了單精子、弱精子穿越透明帶的能力，促進精卵融合和胚胎發(fā)育。

另外，性控精液技術商業(yè)化應用也將進一步提高家畜的繁殖效率。流式細胞分選方法進行精子性控是生產(chǎn)指定性別胚胎，改善胚胎品質(zhì)的重要手段。與傳統(tǒng)的性控凍精方法相比，精子分選技術可實現(xiàn)精子凍-解、分選和二次凍-解過程，很好地解決凍精到分選地的遠距離運輸問題，該技術的應用有效推動了性控凍精的商業(yè)化應用。

ICSI 能夠?qū)崿F(xiàn)性控精子進入卵母細胞，生產(chǎn)指定性別胚胎，該技術廣泛應用于良種繁育或性控精液體外受精。除此之外，IVF 和人工授精（AI）技術也常用于指定性別胚胎生產(chǎn)（表2）。采用IVF 方式進行指定性別胚胎生產(chǎn)的穩(wěn)定性差，可能與卵母細胞品質(zhì)和精卵孵育環(huán)境差異有關。通過ICSI 或者AI 技術生產(chǎn)指定性別胚胎，進行同性別雙犢生產(chǎn)，可有效避免自由馬丁現(xiàn)象，對提高肉?；蚰膛７敝承示哂兄匾饬x（圖1）。

圖1 利用XY 精子分選技術進行IVFET 和AI+ET 雙胎生產(chǎn)技術流程

表2 ICSI、IVF 和AI 技術進行指定性別牛生產(chǎn)情況

自2005 年精子分選技術發(fā)展以來，南美洲奶牛體外胚胎生產(chǎn)數(shù)量超過肉牛。Pontes 等進行OPU-性別控制胚胎商業(yè)化生產(chǎn)跨長距離運輸進行移植，妊娠率可達36%～40%。目前，采用性控精液技術可實現(xiàn)90%的指定性別胚胎生產(chǎn)，滿足母牛繁育、公牛屠宰的市場需求，增加每枚胚胎的經(jīng)濟價值，但利用性控精子進行胚胎生產(chǎn)的操作難度大、生產(chǎn)成本高、穩(wěn)定性差。隨著技術發(fā)展，性控精子仍是增加母?？煽睾蟠匾纳锛夹g手段，該技術應用于IVF 和AI 實踐生產(chǎn)將顯著改善經(jīng)濟效益。

1.4 早期胚胎培養(yǎng) 牛早期胚胎發(fā)育至8～16 細胞期會出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象，合子從輸卵管向子宮移動的過程中，所處環(huán)境不斷發(fā)生變化。在與受精卵體外共培養(yǎng)的過程中，輸卵管上皮細胞正在去分化并且基因組表達譜不斷變化。體外受精胚胎抗凍性、超微結(jié)構（微絨毛和脂滴數(shù)量）、基因表達和染色體結(jié)構與體內(nèi)來源胚胎存在較大差異。因此，IVF 胚胎發(fā)育能力、母牛的妊娠率及產(chǎn)犢率相對較低。

外源性添加生長因子和細胞因子或者與體細胞共培養(yǎng)模擬輸卵管液，能夠克服發(fā)育阻滯，改善早期胚胎發(fā)育（表3）。胎牛血清（FBS）中包含多種細胞自身維持和增殖所需的物質(zhì)，被廣泛應用于卵母細胞IVF 和早期胚胎培養(yǎng)過程中。但是FBS 的使用可能增加疫病傳播和大胎綜合征的風險，導致胚胎抗凍性下降。Hamdi 等將低濃度輸卵管液和子宮液與合子共培養(yǎng)后，囊胚率提高30% 以上，抗氧化能力增強。因此，低濃度輸卵管液和子宮液共培養(yǎng)方案可能提供一種無血清培養(yǎng)替代方案。

表3 不同添加物對牛體外早期胚胎培養(yǎng)液優(yōu)化效果

目前常用的胚胎培養(yǎng)方案有一步培養(yǎng)法和兩步培養(yǎng)法，一步培養(yǎng)法內(nèi)源性生長因子積累多、環(huán)境應激小。兩步培養(yǎng)法毒性物質(zhì)積累少，可以及時添加細胞生長所需物質(zhì)，但相應生產(chǎn)成本也會上升。下一代的胚胎培養(yǎng)可能會集中探索微流控技術在胚胎培養(yǎng)上的應用，采用該技術的優(yōu)點在于可以實時添加胚胎發(fā)育所需物質(zhì)，避免細胞的pH 和溫度變化，減少毒性物質(zhì)積累。探索新方法改善IVP 胚胎的發(fā)育潛力是未來將IVF-ET技術應用產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要研究方向。

1.5 胚胎冷凍保存 囊胚形成后可以進行新鮮胚胎移植，需要同期化處理使受體母牛同時達到受孕狀態(tài)。采用胚胎冷凍保存可有效提高生產(chǎn)效率，實現(xiàn)遠距離胚胎運輸和適時移植，減少疫病傳播風險。

玻璃化冷凍胚胎解凍后存活率和移植成活率較高，不需要特殊設備就可實現(xiàn)。但玻璃化冷凍胚胎需要經(jīng)過解凍、復蘇和脫抗凍劑后才能移植，而且需要操作者具備長期的經(jīng)驗積累才能熟練完成。因此，該方法應用胚胎商業(yè)化具有局限性。

程序化冷凍又稱為慢速冷凍，是細胞外水結(jié)晶，產(chǎn)生滲透梯度，胞質(zhì)脫水濃縮過程。程序化冷凍成功的關鍵在于平衡水結(jié)晶和細胞脫水時間，避免冰晶形成破壞細胞膜和細胞器結(jié)構。程序化冷凍法冰晶形成會損傷細胞結(jié)構且需要專門儀器，但是使用較小濃度抗凍劑對細胞毒性小、而且可以直接移植，適合規(guī)模化胚胎生產(chǎn)使用。最近，Sanches 等研究表明將性控胚胎采用程序化冷凍進行胚胎移植可以達到與玻璃化冷凍相同的妊娠效果。在冷凍過程中添加犢牛血清（FCS）脂溶性物質(zhì)降低胚胎中脂含量以提高胚胎的抗凍性。牛血清采集成本較高，同時可能對胚胎細胞造成不可逆的損害。因此，無血清抗凍保護液開發(fā)是商業(yè)化生產(chǎn)的主要方向。

當前，冷凍液中添加1.5 mol/L 乙二醇配合蔗糖在胚胎冷凍中廣泛使用，用1.5 mol/L 甘油配合0.25 mol/L蔗糖做冷凍液來進行直接移植可獲得良好的效果。有研究表明，程序化冷凍囊胚、玻璃化冷凍桑葚胚胎可能獲得較好的生產(chǎn)效果。為滿足胚胎解凍后直接移植進行商業(yè)化生產(chǎn)，程序化冷凍是適應生產(chǎn)實踐的冷凍胚胎方法，但是冷凍液中添加促進冷凍胚胎著床和發(fā)育的物質(zhì)，增加凍胚存活率和著床率仍然有很大提升空間。

2 IVF-ET 技術應用于牛雙犢生產(chǎn)現(xiàn)狀

近年來全球體外生產(chǎn)胚胎數(shù)量呈上升趨勢，特別是在美洲和歐洲地區(qū)（圖2）。經(jīng)過近50 年的不斷探索，IVF 技術應用于生產(chǎn)實踐囊胚率為30%～40%。因此，IVF 胚胎商業(yè)化應用仍需進一步提高胚胎品質(zhì)。目前，我國肉牛胚胎工程應用產(chǎn)業(yè)化還處于起步階段，存在實踐水平低、生產(chǎn)規(guī)模小、商業(yè)化運行機制不健全等短板，但整體市場需求和發(fā)展?jié)摿薮?。采用IVF-ET 技術進行雙胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)將提高能繁母牛的經(jīng)濟效益，進一步滿足市場對肉牛需求。

圖2 2013—2018 年全球收集胚胎和胚胎移植數(shù)量變化趨勢

當前，雙胎生產(chǎn)可使肉牛生產(chǎn)效益增加20%～25%。誘導雙胎、ET 和AI-ET 技術等繁殖生物技術是生產(chǎn)雙胎的有效手段（表4）。誘導雙胎技術易于操作，不需要昂貴的設施，但易受個體和環(huán)境因素影響，整體雙胎生產(chǎn)效果不佳。母牛AI 后子宮進入妊娠環(huán)境，再進行ET 可以獲得較好的雙胎生產(chǎn)效果，該技術也是解決母牛重復配種未孕的重要手段。2001 年，愛爾蘭Ovamass Ltd 公司報道將AI+ET 技術應用于商業(yè)化生產(chǎn)中雙犢率可達34%。但該技術難度大，難以應用于商業(yè)化生產(chǎn)。目前，胚胎來源主要分為體內(nèi)來源和體外受精2 種方式（圖3），綜合生產(chǎn)成本和移植后的妊娠率考量，IVF-ET 技術作為高效廉價的雙犢生產(chǎn)策略應用于肉牛生產(chǎn)將提高母牛繁殖率，犢牛生產(chǎn)的新增加收益達到4 500～5 500 元/頭。另外，同期化方案在國內(nèi)外的規(guī)?；馀ｐB(yǎng)殖場應用廣泛，研究表明同期化處理會誘導母牛生產(chǎn)雙胎，也將提高胚胎數(shù)量以及移植成功率。若結(jié)合同期發(fā)情進行批次化雙胎生產(chǎn)，可以顯著提高生產(chǎn)效率。

表4 誘導雙犢、IVF-ET 和AI-ET 技術應用于肉牛雙胎的妊娠率和雙犢率

圖3 IVD/IVF 胚胎生產(chǎn)過程

能繁母牛雙胎生產(chǎn)也存在著較多需要解決的問題，動物自身及環(huán)境等多種因素可能都會影響母牛超數(shù)排卵效果，激素水平和移植位置也有可能影響肉牛雙胎生產(chǎn)。另外，根據(jù)美國MARC 相關數(shù)據(jù)，奶牛雙胎造成的產(chǎn)科問題嚴重影響奶牛的生產(chǎn)性能。每年奶牛雙胎對美國奶牛產(chǎn)業(yè)造成大約9 600 萬美元的損失。因此，雙胎生產(chǎn)技術應用于產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，應當權衡經(jīng)濟效益。在自然資源相對不足國家，利用胚胎移植進行肉牛雙犢生產(chǎn)仍是未來提高牛肉產(chǎn)量重要的生產(chǎn)手段。

3 展望

IVF-ET 技術已廣泛應用于肉牛品種改良和良種繁育。該技術應用于肉牛雙胎規(guī)?；a(chǎn)，將會提高母牛繁殖效率，加快肉牛規(guī)?；B(yǎng)殖的步伐，提高肉牛養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。IVF 技術在我國肉牛產(chǎn)業(yè)化應用中取得較快發(fā)展，但我國IVF-ET 技術應用于商業(yè)化雙胎存在生產(chǎn)成本較高、配套產(chǎn)品不足以滿足大規(guī)模IVF 胚胎生產(chǎn)等問題，且能勝任胚胎標準操作的技術人員少，存在成本與收益問題尚需進一步通過優(yōu)化方案來解決。但IVFET 技術仍然是目前最可行、最現(xiàn)實和最有發(fā)展前景的肉牛雙胎生產(chǎn)技術。