李藝養(yǎng)，羅鴻偉，田 川，馬國(guó)達(dá)，陳日玲（.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，廣東湛江 54000；.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬順德婦女兒童醫(yī)院兒科，廣東佛山 58300）

阿霉素（Dox）廣泛應(yīng)用于治療兒童白血病、淋巴瘤等多種惡性腫瘤，由于使用頻率及劑量較高，容易導(dǎo)致體內(nèi)的蓄積，可致多種毒副作用，其中最明顯的毒副作用是心臟毒性，甚至10 % 的患者在化療結(jié)束后15 a內(nèi)會(huì)出現(xiàn)癥狀性心肌病[1]。國(guó)內(nèi)外已證實(shí)外泌體對(duì)心血管疾病有損傷修復(fù)作用[2]。本研究旨在探索臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞源性的外泌體逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷及其潛在的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司；AnnexinV-FIFC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó) BD 公司；Bcl-2 antibody（C-2）（貨號(hào)sc7382）、β-actin 抗體（貨號(hào)sc-81178）、Caspase-3 antibody（H-277）（貨號(hào)：sc-7272）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz；Bax antibody（E63）（貨號(hào)：ab32503）購(gòu)自美國(guó)Abcam；Anti-CD81 antibody（貨號(hào)：A01281-2）、Anti-Tsg101 antibody（貨號(hào)：A01233-2）購(gòu)自BOSTER Biological Technolog。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的提取鑒定

于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80% 融合度時(shí)，更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后收集細(xì)胞上清，通過逐步超高速離心法得到外泌體懸浮液。將外泌體懸浮液置于銅網(wǎng)行醋酸雙氧鈾染色液負(fù)染后，透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，納米顆粒示蹤分析儀Particle Metrix 系統(tǒng)檢測(cè)外泌體粒徑大小從而得到顆粒粒徑的數(shù)量及濃度分布信息，Western-blot 蛋白印記檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物等方法鑒定外泌體。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)各組有無(wú)阿霉素及間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體濃度的不同，將鼠心肌細(xì)胞 H9C2 分為四組，（1）空白對(duì)照組（未給予任何劑量Exo 及Dox）；（2）Dox組（加入0.2 mg/L 的Dox）；（3）H-Exo+Dox 組（加入30 mg/L Exo 及0.2 mg/L 的Dox）；（4）L-Exo+Dox 組（加入15 mg/L Exo 及0.2 mg/L 的Dox）。

1.3.2 AnnexinV-FIFC/PI 檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率 將H9C2 均勻鋪板后放入5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90% 融合時(shí)，根據(jù)不同分組予以不同濃度外泌體及Dox 處理，24 h 后消化并收集各組懸浮心肌細(xì)胞，然后再加入5 μL 的 Annexin V-FITC，充分混勻后，避光孵育15 min。于上機(jī)前5 min 再加入5 μL 的PI 染色繼續(xù)避光孵育，上機(jī)時(shí)補(bǔ)加200 μL的1×Binding Buffer，并在1 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 Western-blots 檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡蛋白 收集各組心肌細(xì)胞并提取蛋白，配平至一致濃度后上樣，經(jīng)過電泳、電轉(zhuǎn)膜、封閉抗體、孵育一抗、孵育二抗后于凝膠成像儀分別檢測(cè)Bax、Bcl-2、active Caspase-3 凋亡蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件，多組間比較采用LSD 單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及外泌體的提取鑒定

2.1.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)和外泌體形態(tài) 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在顯微鏡細(xì)胞成像系統(tǒng)可見：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，大小相對(duì)一致，透光性好，高度純化，聚集性生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形（圖1）。透射電子顯微鏡下可見，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體呈圓形或橢圓形囊泡狀，大小均勻，脂質(zhì)雙層膜完整透亮，見圖 2 。

圖1 hUCMSCs 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

圖2 透射電子顯微鏡觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體形態(tài)

2.1.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體粒徑大小與表面標(biāo)志物 粒徑范圍集中于50～250 nm，平均粒徑大小為136.1 nm，重懸液顆粒濃度為 6.5×107Particles/mL（見圖3）；濃度最高的顆粒的粒徑為127.8 nm，其對(duì)應(yīng)的濃度為 3.3×106Particles/mL。以細(xì)胞蛋白為對(duì)照組，Western-blot 檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記蛋白CD81、TSG101呈陽(yáng)性表達(dá)。

圖3 外泌體粒粒徑大小分布圖注釋

2.1.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體表面標(biāo)志物 以細(xì)胞蛋白為對(duì)照組，Western-blot 檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記蛋白CD81、TSG101 呈陽(yáng)性表達(dá)，如圖4 所示。

圖4 Western-blot 檢測(cè)外泌體表面蛋白

2.2 各組心肌細(xì)胞的凋亡率

Dox 組細(xì)胞凋亡率最高為（27.0±1.9）%，L-Exo+Dox 組、H-Exo+Dox 組、空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率逐漸降低[分別為（15.6±1.2）%、（9.6±0.1）%、（4.6±1.3）% ]，組間兩兩比較均P＜0.05。圖5 為各組心肌細(xì)胞形態(tài)改變。

圖5 各組心肌細(xì)胞形態(tài)

2.3 各組心肌細(xì)胞的凋亡蛋白變化水平

Dox 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡后，Dox 組的促凋亡蛋白Bax 及Caspase-3 表達(dá)量最高，抑凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)量則最低，反映細(xì)胞抗凋亡能力的Bcl-2/Bax 比值也處于最低水平，而 L-Exo+Dox 組Bax 及Caspase-3 表達(dá)量較前者下調(diào)，Bcl-2 表達(dá)量則上升，Bcl-2/Bax 比值也上升；H-Exo+Dox 組Bax 及Caspase-3 則下降更加明顯，而Bcl-2 則進(jìn)一步上調(diào)，Bcl-2/Bax 比值也隨之上升；Bax、Caspase-3、Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值在Dox組與L-Exo+Dox 組的表達(dá)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)四者在L-Exo+Dox 組與H-Exo+Dox 組的表達(dá)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如表1 所示。

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)差異 (，n=3)

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)差異 (，n=3)

與 L-Exo+Dox 組比較：aP＜0.05;與空白對(duì)照組比較：bP＜0.05

3 討論

阿霉素等蒽環(huán)類藥物是治療多種血液腫瘤的首選藥物之一，但其臨床應(yīng)用受到劑量依賴性以及延遲性心臟毒性的限制。阿霉素導(dǎo)致的心臟損傷往往為不可逆性，主要表現(xiàn)為惡性心律失常、擴(kuò)張性心肌病、心力衰竭等[3]。目前尚無(wú)有效的方法減少蒽環(huán)類藥物心臟毒性，因此，需尋找有效的抗心肌損害藥物。

阿霉素導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激增加凋亡被認(rèn)為是導(dǎo)致心臟損害的重要機(jī)制之一，具體凋亡途徑尚不明確。其中Bcl-2 蛋白家族依賴性的內(nèi)在途徑的特征在于通過線粒體外膜的透化作用和線粒體中可溶性因子的釋放發(fā)揮氧化應(yīng)激凋亡，分為BH3-only 蛋白、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[4-6]。BH3-only 蛋白當(dāng)受有害刺激物激活，促凋亡蛋白Bax 和 Bak 開始形成寡聚體，在線粒體外膜上形成孔道，經(jīng)此釋放線粒體膜空間蛋白，以細(xì)胞色素C 最重要，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，可瞬時(shí)結(jié)合關(guān)鍵的胱天蛋白酶（Caspase）接頭分子凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1），觸發(fā)Apaf-1 構(gòu)象廣泛變化，寡聚化為七聚體輪狀結(jié)構(gòu)，使得Caspase 活化，Apaf-1 與啟動(dòng)子Caspase-9 結(jié)合形成凋亡小體，在凋亡小體內(nèi)Caspase-9的二聚化導(dǎo)致其被激活，繼而裂解促凋亡直接執(zhí)行者 Caspase-3 和Caspase-7，使細(xì)胞快速凋亡[4，7-8]?？沟蛲龅鞍譈cl-2 則通過在Bcl-2 或Bcl-xL 與 Bax 之間形成異二聚體，阻止Bax 和Bak 的激活和聚合，以及關(guān)閉線粒體離子通道以降低線粒體膜的通透性，從而抑制細(xì)胞凋亡[5，9]。

外泌體是一種帶有生物活性的細(xì)胞外囊泡，囊泡內(nèi)含有多種功能性生物分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、miRNA、細(xì)胞因子等，通過將這些生物分子實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊作用[10]。研究表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟祖細(xì)胞來(lái)源外泌體可減少阿霉素所致的心肌細(xì)胞凋亡[3，11]。本實(shí)驗(yàn)選取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）進(jìn)行研究，免疫原性低而少有免疫排斥反應(yīng)，且具備更高的傳代及向多個(gè)胚層分化的能力[12]。

本實(shí)驗(yàn)中Dox 濃度、外泌體的濃度梯度是本課題組前期進(jìn)行Dox 誘導(dǎo)心肌損傷模型預(yù)實(shí)驗(yàn)得出來(lái)的。以阿霉素誘導(dǎo)損害的心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同濃度臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體處理后各組心肌細(xì)胞的的凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)適量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可在一定程度上降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡率，且隨著外泌體濃度增高，降低凋亡率的程度增強(qiáng)，差異有顯著性，提示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可降低阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡作用，且一定范圍外泌體濃度增強(qiáng)，其抗心肌細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)。

為進(jìn)一步研究外泌體降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡作用的機(jī)制，本研究檢測(cè)各組阿霉素誘導(dǎo)損傷的心肌細(xì)胞經(jīng)不同濃度臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體處理后的Bax、Caspase-3、Bcl-2 表達(dá)水平。研究結(jié)果示，Dox 組 Bax 及Caspase-3 蛋白高表達(dá)，而Bcl-2 低表達(dá)，我們推測(cè)阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損害可能經(jīng)Bcl-2 蛋白家族依賴性的內(nèi)在途徑，最終使心肌細(xì)胞快速凋亡。并且研究結(jié)果顯示，與Dox 組相比，L-Exo+Dox 組、H-Exo+Dox 組Bax 及Caspase-3 表達(dá)降低，而Bcl-2 表達(dá)量升高，反映細(xì)胞抗凋亡能力的Bcl-2/Bax 比值也隨之升高，且隨著外泌體濃度增高，Bax 及Caspase-3 表達(dá)量降低更明顯，Bcl-2 表達(dá)量增加更明顯（P＜0.05），說(shuō)明經(jīng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體處理后心肌細(xì)胞凋亡率降低可能與Bcl-2 蛋白家族依賴性的內(nèi)在途徑的Bax及Caspase-3 表達(dá)量降低、Bcl-2 表達(dá)量增加有關(guān)，從分子學(xué)水平解釋了外泌體降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡作用，且一定范圍外泌體濃度增強(qiáng)，其抗心肌細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)。Zhang 等[13]、Jing 等[14]研究也證實(shí)此分子水平變化。

另外，也有學(xué)者指出間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可通過聯(lián)合多種機(jī)制改善心臟損害。Ma 等[15]研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可通過遞送miR-132 促進(jìn)新血管生成以改善心肌梗塞；Arslan 等[16]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可增加ATP 水平，降低氧化應(yīng)激并激活PI3K/ Akt 途徑，從而增強(qiáng)心肌活力并防止心肌缺血再灌注損傷的重塑。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)心肌功能的改善并非是單一的通路機(jī)制，可能是多種途徑聯(lián)合的綜合結(jié)果，但這仍需進(jìn)一步的研究。