王妍璐，彭偉康，梁嘉樂(lè)，馬衛(wèi)列，丁 航，張志珍，陳曉佳*（廣東醫(yī)科大學(xué).第二臨床醫(yī)學(xué)院；.技術(shù)學(xué)院；.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 5808）

據(jù)估計(jì)，全球1/4 的人口患有非酒精性脂肪肝（NAFLD），預(yù)計(jì)未來(lái)10 年非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的發(fā)病率將增加56%，NASH 如不及時(shí)治療，可出現(xiàn)肝纖維化（HF），最終發(fā)展成肝細(xì)胞癌（HCC）[1-2]。由于肥胖率增加，HF 相關(guān)的HCC 發(fā)病率逐年上升[3]，亟需構(gòu)建一種與人類(lèi)HF 發(fā)生和發(fā)展高度相似的動(dòng)物模型進(jìn)行HF 的預(yù)防和治療的研究。目前構(gòu)建HF 動(dòng)物模型主要有基因工程鼠、肝毒性藥物誘導(dǎo)鼠和高脂飲食誘導(dǎo)鼠[4-5]，其中基因工程鼠成本高[6]；肝毒性藥物誘導(dǎo)雖然建模時(shí)間快但與人的HF 發(fā)生發(fā)展不符，且不穩(wěn)定[7]；高脂飲食誘導(dǎo)HF 模型與人的HF 發(fā)生、發(fā)展模式相近[8-9]。沙鼠血脂代謝與其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在很大差別，其血脂對(duì)高脂飼料反應(yīng)敏感，且其載脂蛋白變化與人類(lèi)相似，被認(rèn)為是高脂血癥良好的研究模型[10]。本課題組前期研究顯示，采用89%基礎(chǔ)飼料+1%膽固醇+l0%豬油配方的高脂飼料可構(gòu)建與人類(lèi)高脂血癥一致的高血脂動(dòng)物模型[11]，故本實(shí)驗(yàn)在高脂血癥沙鼠模型的基礎(chǔ)上構(gòu)建NAFLD 模型，延長(zhǎng)高脂喂養(yǎng)時(shí)間，模擬人類(lèi)HF 由NAFLD 發(fā)展的過(guò)程，構(gòu)建穩(wěn)定的與人類(lèi)HF 發(fā)生、發(fā)展高度一致的HF 沙鼠模型。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 5417R 高速臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf 公司）；7180 型全自動(dòng)生化分析儀（HITACHI 公司）；SYNERGY H1 酶標(biāo)儀（Biotek 公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 30 只清潔級(jí)雄性沙鼠，體質(zhì)量為40～60 g，由遵義醫(yī)科大學(xué)提供。單籠飼養(yǎng)，室溫24～26℃，濕度50%，晝夜交替時(shí)長(zhǎng)12 h，自由進(jìn)食飲水。SPF 級(jí)普通維持飼料和定制高脂飼料（89%基礎(chǔ)飼料+1% 膽固醇+l0% 豬油配方）購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma 公司；蘇木素、尹紅購(gòu)自索萊寶公司；多聚甲醛購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。MASSON 染色試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；組織TG、TC 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與造模 30 只體質(zhì)量40～60 g 雄性沙鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NCG）和模型組（MG），每組15 只。正常對(duì)照組給予正常維持飼料喂養(yǎng)，模型組進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，單籠喂養(yǎng)，保持籠具清潔，分別喂養(yǎng)16 周。

1.2.2 沙鼠血脂和體質(zhì)量檢測(cè) 造模前兩組沙鼠禁食不禁水16 h 后，2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，用毛細(xì)玻璃管眼眶靜脈叢取血，于1.5 mL 高壓滅菌的離心管中室溫靜置1 h，室溫4 500 r/min 離心10 min，分離血清，使用全自動(dòng)生化分析儀通過(guò)質(zhì)控，按標(biāo)準(zhǔn)化值標(biāo)定后測(cè)定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平。同時(shí)測(cè)定兩組沙鼠造模前體質(zhì)量。造模16 周后，按照上述方法檢測(cè)血清TG、TC、LDL-c和HDL-c，同時(shí)檢測(cè)造模后的體質(zhì)量。

1.2.3 肝臟取材和肝體質(zhì)量指數(shù)計(jì)算 戊巴比妥鈉麻醉后，將沙鼠固定于小動(dòng)物解剖臺(tái)上，用剪刀快速剪開(kāi)腹腔及胸腔。在解剖顯微鏡下仔細(xì)分別將肝臟、胃和胃連接的筋膜分離，剪斷進(jìn)出肝臟的動(dòng)靜脈，將肝臟取下。預(yù)冷PBS 溶液清洗后，放置于帶有標(biāo)尺的板上拍照并稱(chēng)重，計(jì)算肝體質(zhì)量指數(shù)。肝體質(zhì)量指數(shù)為肝臟濕重與體質(zhì)量之比。之后將肝臟分成兩部分，一部分用4% 多聚甲醛溶液固定，用于HE 染色和MASSON染色；另一部分切成小塊，在液氮中速凍10 s，置-80℃?zhèn)溆?，用于測(cè)定肝臟TG 和TC 含量。

1.2.4 肝臟總TG、TC 含量測(cè)定 取-80℃凍存的部分肝臟，加入液氮研磨。按照1 mg 肝臟加入10 μL裂解液比例于冰上裂解10 min，2 000 r/min 離心5 min 后取適量上清，BCA 法測(cè)定蛋白含量。剩余上清 70 ℃加熱10 min，2 000 r/min 離心5 min，取上清測(cè)定TG 和TC 含量。按4∶1 比例配置工作液，取4 mL試劑R1 與1 mL 試劑R2 混合。在96 孔板上，每組樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入190 μL 工作液和10 μL 樣品上清液，輕搖混勻，于室溫避光反應(yīng)20 min，在酶標(biāo)儀上550 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色。分別繪制TG 和TC 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TG 和TC 濃度，以每毫克蛋白濃度校正TG 和TC 的含量。

1.2.5 肝臟石蠟切片HE 染色和MASSON 染色 切取部分肝臟，在4%多聚甲醛中固定24 h 以上，經(jīng)水洗、脫水、透明、恒溫浸蠟之后在包埋機(jī)上進(jìn)行包埋，以厚度為4 μm 進(jìn)行切片。切片經(jīng)脫蠟、脫二甲苯、水洗后參照染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE 和MASSON 染色，最后封片。在顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Grapad Prime 8.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后沙鼠血脂四項(xiàng)的改變

測(cè)定造模前兩組沙鼠的血清TG、TC、LDL-c 和HDL-C 水平，差異均無(wú)明顯變化（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)圖1A。高脂飼料喂養(yǎng)16 周后，MG 沙鼠血清中TC、TG、LDL-c 和HDL-c 含量均明顯高于NCG（P＜0.01 或0.05），見(jiàn)圖1B。結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)16 周后可導(dǎo)致沙鼠出現(xiàn)高脂血癥。

圖1 造模前后沙鼠的血脂4 項(xiàng)水平

2.2 沙鼠體質(zhì)量與肝指數(shù)

高脂飼料喂養(yǎng)16 周后，MG 沙鼠體質(zhì)量平均增加（46.17±5.77）g，高于NCG 沙鼠體質(zhì)量的（20.80±3.70）g，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。解剖沙鼠亦可發(fā)現(xiàn)，MG 沙鼠腹腔脂肪量較NCG 沙鼠明顯增多。取完整肝臟，稱(chēng)取肝臟濕重，計(jì)算肝指數(shù)。結(jié)果顯示，MG 沙鼠肝指數(shù)為0.074±0.003，明顯高于NCG 的0.033±0.002（P＜0.01）。該結(jié)果提示高脂飲食可導(dǎo)致沙鼠體質(zhì)量和肝臟重量增大。

2.3 沙鼠肝臟大體形態(tài)

造模16 周后取完整肝臟，可見(jiàn)MG 沙鼠肝臟外觀呈淺黃色，有油膩感，肝臟彌漫性腫大，肝包膜緊張，切開(kāi)肝臟，切緣外翻，肝緣變頓，呈肝臟脂肪異常累積現(xiàn)象。NCG 肝臟大小適中，呈紅褐色，肝臟邊緣銳利，切面整齊，見(jiàn)圖2。結(jié)果說(shuō)明，高脂飲食可導(dǎo)致沙鼠肝臟出現(xiàn)脂肪累積。

圖2 造模16 周后沙鼠肝臟形態(tài)觀察（cm）

2.4 肝臟總TG、TC 含量

肝臟充分研磨后，離心取上清測(cè)定肝臟總TG 和TC 含量。結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)16 周后，MG 組沙鼠肝臟中總TG 含量為(183.80 ± 5.69) μmol/g 蛋白，與正常對(duì)照組的(114.33 ±16.55) μmol/g 相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；總TC 含量為(506.49 ± 47.87) μmol/g，亦高于正常對(duì)照組的(61.67 ± 6.68) μmol/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果提示，高脂飲食16 周后，沙鼠攝入的大部分脂肪和膽固醇累積在肝臟。

2.5 沙鼠肝臟石蠟切片HE 染色

對(duì)肝臟進(jìn)行石蠟包埋，切片進(jìn)行HE 染色，結(jié)果見(jiàn)圖3。HE 染色顯示，NCG 沙鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索肝竇結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)均勻淡染，細(xì)胞核居中。而MG 沙鼠切面分布大小不等空泡，肝細(xì)胞變大，細(xì)胞核偏向一側(cè)，肝細(xì)胞擁擠，呈明顯肝細(xì)胞脂肪變性征象。

圖3 高脂喂養(yǎng)16 周后沙鼠肝臟HE 染色（200×）

2.6 沙鼠肝臟冰凍切片油紅O 染色

為驗(yàn)證HE 切片空泡為異常累積的脂肪，取新鮮肝臟進(jìn)行冰凍切片油紅O 染色。結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)16 周后MG 沙鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量均質(zhì)紅染（圖4），與石蠟切片HE 染色空泡位置一致，提示肝臟細(xì)胞脂肪累積。

圖4 高脂喂養(yǎng)16 周后沙鼠肝臟油紅O 染色（200×）

2.7 沙鼠肝臟石蠟切片MASSON 染色

在高脂沙鼠模型基礎(chǔ)上，延長(zhǎng)高脂喂養(yǎng)時(shí)間，對(duì)肝臟進(jìn)行石蠟切片MASSON 染色。結(jié)果顯示，與NCG沙鼠相比，MG 沙鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，肝細(xì)胞有空泡、肝血竇周?chē)霈F(xiàn)纖維化，膠原纖維大量增生并形成纖維間隔，可見(jiàn)匯管區(qū)纖維化，偶見(jiàn)假小葉形成（圖5）。

圖5 高脂喂養(yǎng)16 周后沙鼠肝臟MASSON 染色（200×）

3 討論

隨著生活水平的提高、飲食習(xí)慣的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年上升，人類(lèi)的HF 的自然發(fā)生發(fā)展過(guò)程為：NAFLD-NASH-HF，即出現(xiàn)高脂血脂后，肝臟之后累積，形成NAFLD，肝細(xì)胞由于脂毒性出現(xiàn)炎癥，導(dǎo)致NASH，炎癥因子激活肝星狀細(xì)胞，產(chǎn)生過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致HF。NAFLD 是一種由多重因素導(dǎo)致的肝臟脂肪異常累積，早期表現(xiàn)為肝細(xì)胞單純性的脂肪累積，后期可發(fā)展為NASH、HF，肝臟纖維化可導(dǎo)致肝小葉形態(tài)紊亂，膽汁淤積，如不進(jìn)行有效干預(yù)，最終可發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌[12]。

外源性的脂類(lèi)物質(zhì)，被轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，被肝細(xì)胞攝取進(jìn)行代謝[13]，當(dāng)機(jī)體需要脂類(lèi)物質(zhì)時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的脂類(lèi)物質(zhì)可通過(guò)極低密度脂蛋白運(yùn)輸?shù)酵庵?，保持肝?xì)胞中的脂類(lèi)物質(zhì)處于合理水平，當(dāng)攝入過(guò)多的脂類(lèi)物質(zhì)時(shí)，其累積在肝細(xì)胞中，出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變[14-15]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)16 周時(shí)，MG 組沙鼠血清中TC 含量、TG 及LDL-c 含量均高于NCG 組沙鼠水平（P＜0.01），提示MG 組沙鼠出現(xiàn)高脂血癥。血液中的TC、TG 被運(yùn)輸?shù)礁渭?xì)胞中代謝，過(guò)多的TG、TC 被累積于肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝臟腫大，16 周時(shí)取完整沙鼠肝臟，大體觀顯示肝臟體質(zhì)量增大，肝包膜緊張，稱(chēng)取肝臟濕重和體質(zhì)量計(jì)算肝指數(shù)亦提示MG 組沙鼠肝指數(shù)高于NCG 組。為驗(yàn)證是否增大的肝臟是因?yàn)門(mén)G、TC 累積所致，進(jìn)一步去肝組織研磨，檢測(cè)肝組織中總TG 和TC含量，結(jié)果顯示MG 沙鼠肝臟TG 和TC 含量明顯高于NCG 沙鼠（P＜0.05 或0.01），提示高脂喂養(yǎng)可導(dǎo)致沙鼠肝臟TG 和TC 異常累積，符合NAFLD 發(fā)病機(jī)制。肝臟中過(guò)度累積的TG 在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥介質(zhì)激活，這些因素共同引起肝細(xì)胞損傷出現(xiàn)NASH[16]。肝臟在持續(xù)炎癥介質(zhì)的刺激下，肝竇內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)下的星狀細(xì)胞可被激活，轉(zhuǎn)分化為促瘢痕形成的肌成纖維細(xì)胞，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)肝損進(jìn)行修復(fù)，但過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)可導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)纖維化，破壞肝小葉的正常形態(tài)，導(dǎo)致肝硬化甚至肝細(xì)胞癌變[17]。肝臟組織病理檢查是診斷HF 的金標(biāo)準(zhǔn)，16 周時(shí)MG 沙鼠肝臟進(jìn)行石蠟切片HE 和油紅O 染色，均表現(xiàn)出肝臟脂肪累積，符合NAFLD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，成功構(gòu)建單純高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 動(dòng)物模型。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行MASSON 染色，結(jié)果顯示16周時(shí)MG 沙鼠肝臟出現(xiàn)纖維化，符合HF 診斷標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)單純的高脂喂養(yǎng)，模擬人類(lèi)因飲食習(xí)慣改變導(dǎo)致的高脂血癥，肝臟脂肪累積出現(xiàn)NAFLD，在沒(méi)有有效的干預(yù)措施前提下，繼續(xù)高脂飲食，導(dǎo)致NASH，炎癥介質(zhì)激活肝臟星狀細(xì)胞，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致HF 發(fā)生。該模型與人類(lèi)HF 的發(fā)生發(fā)展模式相似，且造模方法簡(jiǎn)單，且可在不同時(shí)間點(diǎn)取材觀察到HF 發(fā)生發(fā)展全過(guò)程，沙鼠體型居中，成年沙鼠100 g 左右，方便操作和多次取血，優(yōu)于大小鼠，有利于對(duì)HF 發(fā)病機(jī)制的研究。