張坤成,陶惟一,李 霜

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院,江蘇 南京 211800)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展,石油作為重要的工業(yè)原料廣泛地應(yīng)用于材料、能源、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。然而在石油開采、運(yùn)輸、儲存等環(huán)節(jié)因非正常操作會造成環(huán)境污染,一旦石油泄漏到環(huán)境中,不僅會造成經(jīng)濟(jì)損失,而且對動植物也有著極大的危害[2-3]。目前石油污染的修復(fù)技術(shù)主要包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)以及微生物修復(fù)[4]。其中,微生物修復(fù)技術(shù)主要是利用微生物對石油烴的降解作用去除石油污染物,具有低成本、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),具有較好的應(yīng)用潛力[5-6]。

微生物修復(fù)技術(shù)的實(shí)施,需要向修復(fù)場地添加有活性的高效烴降解功能菌劑;如果烴降解菌株自身難以大規(guī)模培養(yǎng)且不易保存活性,則給下游的應(yīng)用實(shí)施帶來困難。芽孢桿菌形成的芽孢休眠體對不良環(huán)境具有特殊抵抗能力,適合開發(fā)成活菌制劑,易于貯存且質(zhì)量穩(wěn)定,有利于菌劑由實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H應(yīng)用[7]。當(dāng)前,芽孢桿菌類功能菌株已經(jīng)應(yīng)用于生物防治、環(huán)境保護(hù)、種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域[8],具備較為成熟的產(chǎn)業(yè)開發(fā)經(jīng)驗(yàn)。芽孢桿菌也是一類重要的烴降解菌株[9],從油污場地中篩選具有烴降解功能的芽孢桿菌并研究其烴代謝特征,有助于促進(jìn)石油場地生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用實(shí)施。

本研究從石油污染土壤中篩選獲得了一株能夠利用石油為碳源生長的芽孢桿菌,并且對其進(jìn)行了初步鑒定,研究了其烴降解特征,為開發(fā)生物修復(fù)菌劑提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)土樣

實(shí)驗(yàn)土樣來自大慶油田長期受石油污染的土壤。取上層石油污染土壤,經(jīng)粉碎,過篩分裝于試管中,置于冰箱備用。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10;蛋白胨 10;酵母粉 5。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)(g/L):(NH4)2SO42;NaCl 10;CaCl20.1;K2HPO42.8;KH2PO40.5;MgSO40.1;FeSO40.01;原油1。

1.3 菌種篩選及鑒定

1.3.1 具有原油降解功能的芽孢桿菌篩選

稱取0.05 g油污土壤,加到50 mL的MSM培養(yǎng)基中,以1 g/L的原油作為唯一碳源,在20 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中富集培養(yǎng)5 d。將富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至85 ℃保溫20 min,移取5 mL的富集培養(yǎng)液接入新鮮的MSM培養(yǎng)基中,相同條件下培養(yǎng)5 d,共重復(fù)3次。吸取富集后的培養(yǎng)液,稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù),涂布于LB固體培養(yǎng)基,20 ℃培養(yǎng)36 h后,挑取單菌落,接種于LB液體培養(yǎng)基,在20 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h后,以甘油凍存液保藏于-80 ℃冰箱中備用[10]。

1.3.2 菌株的鑒定

將菌液置于載玻片上,利用革蘭氏染色試劑對其進(jìn)行染色,使用顯微鏡觀察菌株細(xì)胞形態(tài)。利用DNA提取試劑盒提取菌株的基因組,用通用引物27F(5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對菌株16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增,并進(jìn)行測序,測序結(jié)果提交至NCBI基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 氮源、溫度、pH、NaCl質(zhì)量濃度、表面活性劑對原油降解效率的影響

將菌株BC-1從-80 ℃冰箱取出,接入LB液體培養(yǎng)基。生長到對數(shù)期后在LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行三區(qū)劃線培養(yǎng)出單菌落,接種BC-1菌株到LB液體培養(yǎng)基,于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h得到種子液。

1.4.1 氮源對菌株BC-1原油降解的影響

分別將BC-1種子液接種于MSM培養(yǎng)基、添加2 g/L蛋白胨的MSM培養(yǎng)基和以2 g/L蛋白胨代替(NH4)2SO4的培養(yǎng)基。置于20 ℃、150 r/min培養(yǎng)5 d后,收取發(fā)酵液,離心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法測定菌株原油降解率。

1.4.2 溫度對菌株BC-1原油降解的影響

將BC-1接種于添加2 g/L蛋白胨的MSM培養(yǎng)基,分別置于20～37 ℃的恒溫?fù)u床中。150 r/min培養(yǎng)5 d后,收取發(fā)酵液,離心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法測定菌株原油降解率。

1.4.3 pH對菌株BC-1原油降解的影響

添加2 g/L蛋白胨的MSM培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH為5～9,接入BC-1種子液。150 r/min培養(yǎng)5 d后,收取發(fā)酵液,離心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法測定菌株原油降解率。

1.4.4 NaCl質(zhì)量濃度對BC-1原油降解的影響

添加2 g/L蛋白胨的MSM培養(yǎng)基,調(diào)整NaCl質(zhì)量濃度分別為0～40 g/L,接種BC-1種子液。150 r/min培養(yǎng)5 d后,收取發(fā)酵液,離心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法測定菌株原油降解率。

1.4.5 表面活性劑對菌株原油降解的影響

向添加2 g/L蛋白胨的MSM培養(yǎng)基分別加入200 mg/L的十二烷基磺酸鈉(SDS)、Tween 80、鼠李糖脂,接種BC-1種子液。150 r/min培養(yǎng)5 d后,收取發(fā)酵液,離心取上清,加入50 mL石油醚萃取剩余原油,以比色法測定菌株原油降解率。

1.5 原油降解率測定方法

采用比色法測定原油含量[11]。以不接菌的培養(yǎng)基作為空白對照,向培養(yǎng)液中加入25 mL的石油醚充分混合后,轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,充分振蕩。再取25 mL石油醚沖洗三角瓶也轉(zhuǎn)移至分液漏斗,再次充分振蕩混合。靜置,取上層有機(jī)相1 mL,稀釋100倍,在225 nm下比色測定降解率。

原油降解率=(A0-A1)/A0×100%

式中：A0為空白樣的OD225;A1為降解后的OD225。

1.6 菌株BC-1的烴降解特性研究

用2 g/L的柴油或混合烴(C12—C18各300 mg/L;菲、芘各50 mg/L)取代MSM培養(yǎng)基中原油,于150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5 d。采用正己烷萃取有機(jī)相。向培養(yǎng)液中加入25 mL正己烷充分混合,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,充分振蕩;再取25 mL正己烷沖洗三角瓶后也轉(zhuǎn)移至分液漏斗,再次充分振蕩混合。靜置,吸取上層有機(jī)相1 mL,以無水Na2SO4進(jìn)行脫水干燥,過有機(jī)膜,采用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)圖譜分析烴降解情況,以角鯊?fù)樽鳛閮?nèi)標(biāo)[9]。GC-MS設(shè)置電子轟擊源EI(70 eV),色譜條件參考Tao等[9]。

1.7 細(xì)胞表面疏水性(CSH)測定

將菌株BC-1接種于LB液體培養(yǎng)基中,在30 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h后,發(fā)酵液以8 000 r/min離心棄上清,菌體以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液清洗3次,并以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液將菌體重懸,OD600調(diào)整至0.6～0.8。吸取4 mL菌懸液到玻璃試管中,加入1 mL 疏水烴(柴油、正己烷、環(huán)己烷、二甲苯),渦旋振蕩2 min,靜置15 min,移取下相菌懸液,利用紫外分光光度計(jì)在600 nm下比色測定吸光率[12-13]。計(jì)算細(xì)胞表面疏水性。

細(xì)胞表面疏水性=(A′0-A′1)/A′0×100%

式中:A′0為渦旋振蕩前的OD600;A′1為渦旋振蕩后的OD600。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選與鑒定

從大慶油田石油污染土壤中通過富集培養(yǎng)和高溫篩選獲得了一株能夠利用石油為唯一碳源生長的BC-1菌株。其在平板上呈灰白色、扁平、不透明的菌落,表面粗糙呈毛玻璃狀;鏡檢細(xì)胞呈長桿狀,為革蘭氏陽性細(xì)菌,進(jìn)一步通過16S rDNA序列分析對菌株進(jìn)行鑒定。

經(jīng)過16S rDNA測序,提交至NCBI數(shù)據(jù)庫比對后,菌株BC-1鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。通過MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1所示。

圖1 菌株BC-1系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.1 Phylogenetic tree diagram of strain BC-1

2.2 環(huán)境因素對BC-1菌株原油降解效率的影響

2.2.1 有機(jī)氮對菌株原油降解的影響

考察BC-1菌株對MSM培養(yǎng)基、添加蛋白胨的MSM培養(yǎng)基以及利用蛋白胨替換(NH4)2SO4的MSM培養(yǎng)基的原油降解率,如圖2所示。

圖2 氮源對菌株BC-1原油降解效率的影響Fig.2 Effects of nitrogen source on the degradation of crude oil by strain BC-1

氮源對細(xì)菌生長代謝具有重要的影響,在微生物修復(fù)期間,氮源也是影響修復(fù)效果的關(guān)鍵所在。向MSM培養(yǎng)基中添加2 g/L的蛋白胨后,能明顯促進(jìn)菌株BC-1對原油的降解,這可能是因?yàn)樘砑佑袡C(jī)氮后促進(jìn)了菌株的生長,進(jìn)而提高了菌株的原油降解率[14]。以生物刺激對石油污染場地進(jìn)行修復(fù)是通常采取向污染物場地添加氮源等營養(yǎng)物質(zhì)來加速修復(fù)效率[15]。郭西倩[16]向石油污染土壤(5年以上)中分別添加了KNO3和有機(jī)肥,結(jié)果表明,KNO3和有機(jī)肥在土壤中石油烴的去除率可分別達(dá)到40.28%和43.79%?？梢?氮源等營養(yǎng)物質(zhì)在生物修復(fù)過程中起著不可替代的作用。

2.2.2 溫度、pH、NaCl質(zhì)量濃度對菌株BC-1原油降解的影響

在微生物修復(fù)過程中,微生物的生長往往會受到土壤的溫度、pH、土質(zhì)等環(huán)境因素的影響,進(jìn)而會影響到菌株對原油的代謝[17]。考察溫度、pH和NaCl質(zhì)量濃度對BC-1菌株的原油降解效率的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 環(huán)境因素對菌株BC-1原油降解的影響Fig.3 Effects of environmental factors on the degradation of crude oil by strain BC-1

一般來說,石油污染物場土壤的pH通常在6～9,溫度通常在10～45 ℃[18]。土壤環(huán)境因素影響著生物修復(fù)效果,低溫會改變微生物的生理生化性質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞活力降低,細(xì)胞代謝受到抑制,使得烴降解速率降低,修復(fù)過程變得漫長[19-20]。因此篩選到能夠在低溫環(huán)境中高效降解石油烴的微生物是進(jìn)行低溫修復(fù)的關(guān)鍵所在。菌株BC-1在20～37 ℃溫度下的原油降解率均可達(dá)到40%以上,在30 ℃原油降解率達(dá)到最高49.8%。菌株BC-1在pH 5～9的環(huán)境條件下的原油降解率均可達(dá)到45%以上,當(dāng)pH為7時(shí),原油降解率為最高55.25%。尤其值得關(guān)注的是,菌株BC-1還具有寬泛的耐鹽性能,當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度在0～30 g/L時(shí),原油降解率均在45%以上。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí),原油降解率可達(dá)54.06%。據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道,隨著土壤鹽漬化程度增加,石油烴污染物降解速率會顯著降低,持久性也會逐漸增強(qiáng)。菌株BC-1能耐受NaCl質(zhì)量濃度達(dá)30 g/L,意味著該菌株在NaCl質(zhì)量濃度相對較低的近岸海域也具有較好的環(huán)境適應(yīng)性。以上結(jié)果表明菌株BC-1對環(huán)境條件不敏感,能夠滿足石油污染物場地的環(huán)境條件,尤其是菌株BC-1的烴降解能力適用于一定的低溫和NaCl質(zhì)量濃度,解決了低溫條件下石油去除效率緩慢、微生物活性低等難點(diǎn)。

已報(bào)道的具有烴降解功能的芽孢桿菌屬菌株較為豐富,尤其是中高溫解烴菌較多,表1列舉了部分具有原油降解能力的芽孢桿菌及其應(yīng)用特征。從表1中可以看出,菌株BC-1對環(huán)境的適應(yīng)性較好,在20 ℃低溫以及耐鹽性方面,BC-1具有較為顯著的優(yōu)勢。下一步的工作可以將菌株BC-1進(jìn)行高密度發(fā)酵并制備成菌劑,通過在石油污染場地投放菌劑的方式進(jìn)行微生物修復(fù),這種修復(fù)方法不僅有助于節(jié)省人力物力,而且菌株可以快速適應(yīng)污染物場地的環(huán)境條件,從而達(dá)到快速修復(fù)的效果。

表1 具有烴降解功能的芽孢桿菌及其應(yīng)用特征

2.2.3 表面活性劑對菌株原油降解的影響

通常來說,表面活性劑具有兩親性,能夠減小油水兩相之間的斥力,降低界面張力,促進(jìn)疏水物質(zhì)的溶解[25]。但表面活性劑自身對細(xì)胞也具有一定的毒性,影響菌株對原油的攝取與降解。因此,針對具體的功能菌株,有必要開展表面活性劑的適配性篩選。菌株BC-1自身不能合成表面活性劑,既不能夠降低發(fā)酵液表面張力,也不能夠乳化原油。考察外源添加200 mg/L的表面活性劑對BC-1菌株的原油降解效率影響,結(jié)果如圖4所示,菌株BC-1的烴降解效率發(fā)生了顯著變化。

圖4 表面活性劑對菌株BC-1原油降解的影響Fig.4 Effects of surfactants on the degradation of crude oil by strain BC-1

由圖4可知:生物表面活性劑鼠李糖脂能夠顯著促進(jìn)菌株BC-1對原油的降解,能夠?qū)⒃徒到饴侍岣呓?0%左右;而添加Tween 80后對菌株BC-1的原油降解率并無顯著影響;相反,添加SDS后,原油降解率大幅度下降。生物表面活性劑鼠李糖脂對原油降解率的促進(jìn)效果明顯優(yōu)于化學(xué)表面活性劑Tween 80和SDS,這也印證了生物表面活性劑具有更好的生物相容性以及環(huán)境友好性,更適用于石油污染的修復(fù)治理[26]。

2.3 菌株BC-1的烴降解特性研究

為了解析菌株BC-1的烴代謝特征,采用柴油和混合烴作為降解底物,采用GC-MS分析降解后的組分,計(jì)算各種烴的降解率,如圖5所示。

由圖5(a)可知,菌株BC-1對柴油的降解過程中會優(yōu)先降解短鏈烷烴,短鏈烷烴的降解率明顯高于長鏈烷烴的降解率。菌株BC-1對柴油的平均降解率為63.21%;其中C11—C15的平均降解率為77.93%,C16—C21的平均降解率為49.74%。采用人工構(gòu)建的C12—C18烷烴以及多環(huán)芳烴菲和芘的混合體系為底物時(shí),菌株BC-1同樣表現(xiàn)出對C12烷烴的高效降解,如圖5(b)所示。菌株BC-1也能夠降解多環(huán)芳烴;對菲的降解率為30.69%,對芘的降解率為27.01%。以上研究結(jié)果表明BC-1對烷烴和多環(huán)芳烴均有降解能力,具有優(yōu)先降解短鏈烷烴的特點(diǎn)。在后續(xù)的工作中,可嘗試將BC-1菌株與高效降解長鏈烴的菌株進(jìn)行復(fù)配,以達(dá)到更佳的修復(fù)效果。

圖5 菌株BC-1的烴降解圖Fig.5 Hydrocarbon degradation diagram of strain BC-1

2.4 菌株BC-1的細(xì)胞表面疏水性

細(xì)胞表面疏水性高低用于評估細(xì)胞對疏水烴類的吸附能力。一般來說,當(dāng)CSH大于80%時(shí),表明細(xì)胞是高度疏水的;當(dāng)CSH小于20%時(shí),表明細(xì)胞是高度親水的[12]。將BC-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,分別測定BC-1菌株對4種疏水底物的細(xì)胞表面疏水性,結(jié)果如圖6所示。

圖6 菌株BC-1對不同疏水底物的細(xì)胞表面疏水性Fig.6 Cell surface hydrophobicity(CSH) of strain BC-1 to different hydrophobic substances

菌株BC-1對4種烴的CSH均低于20%,這也表明此時(shí)菌株細(xì)胞表面是高度親水的。通常認(rèn)為,細(xì)菌細(xì)胞表面的高CSH有助于吸附和攝取烴類;而BC-1作為烴降解菌株,其細(xì)胞表面對烴的吸附能力并不強(qiáng)。此前,篩選獲得一株具有中高溫?zé)N降解功能的枯草芽孢桿菌BL-27也同樣具有親水性細(xì)胞表面[13]。因此,筆者認(rèn)為細(xì)胞表面高疏水性可能并不是影響菌株烴降解功能的必要條件。

3 結(jié)論

從大慶油田石油污染土壤中,通過高溫?zé)崽幚矸êY選獲得了一株能夠降解原油的土著芽孢桿菌菌株BC-1,經(jīng)16S rDNA鑒定,該菌株為蠟狀芽孢桿菌。BC-1菌株能夠滿足石油污染場地的環(huán)境條件,尤其是其烴降解能力適用于一定的低溫和NaCl質(zhì)量濃度。在最適條件下,BC-1菌株在5 d內(nèi)對原油降解率可達(dá)到55.25%,添加生物表面活性劑鼠李糖脂后能夠提升原油降解率至73.8%?；诨旌蠠N底物分析,菌株BC-1可優(yōu)先降解短鏈烴,也能降解多環(huán)芳烴。芽孢桿菌BC-1具有開發(fā)成烴降解菌劑的潛力。