袁小晶，王 佳

(1.延安市中醫(yī)醫(yī)院,陜西 延安 716099；2.西安市中心醫(yī)院，陜西 西安 710004)

資料顯示，膿毒血癥在歐洲重癥加強(qiáng)護(hù)理病房中的發(fā)病率高達(dá)30%，其病死率高達(dá)35%～55%，在美國與惡性腫瘤、心臟病共同被列為三大常見死因[1]。膿毒血癥是機(jī)體內(nèi)真菌、細(xì)菌或病毒感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是由某種內(nèi)毒素結(jié)合白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞引發(fā)的炎癥反應(yīng)失控，造成內(nèi)環(huán)境紊亂及全身多器官功能障礙，該病不僅病情危急，且具有較高的病死率[2]。因此，如何有效地治療膿毒血癥，預(yù)防疾病進(jìn)一步進(jìn)展，對臨床具有重要意義。替格瑞洛是新型抗血小板藥物，能夠緩解大腦缺血再灌注損傷；且對小鼠樹突狀細(xì)胞免疫功能具有抑制作用，可為冠心病的防治提供理論依據(jù)[3]。但目前，臨床關(guān)于替格瑞洛對膿毒血癥小鼠高遷移率蛋白1(HMGB-1)及免疫功能影響的研究甚少?；诖耍狙芯繉⑻接懱娓袢鹇鍖δ摱狙Y小鼠HMGB-1及免疫功能的影響，以期為臨床防治膿毒血癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取100只同月齡健康SPF級BALB/c小鼠，均為雄性，體重(200±20)g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司(合格證號：1804033)，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(滬)，2020-0019，飼養(yǎng)于我院動物室，飼養(yǎng)條件為不限水、食物，溫度22～26 ℃，濕度50.00%～60.00%，明暗交替12 h/12 h。替格瑞洛(批號：20180226)；美國Abcam公司生產(chǎn)的辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，igG)二抗；美國Invitrogen公司生產(chǎn)的兔抗鼠HMGB-1抗體；美國Santa Cruz公司生產(chǎn)的兔抗鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X，Bax)抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)；武漢碧云天生物科技有限公司生產(chǎn)的白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)；杭州昊鑫生物科技有限公司生產(chǎn)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamate pyruvate aminotransferase,GPT)；上?？道噬锟萍加邢薰旧a(chǎn)的谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamate oxaloacetate transaminase，GOT);美國Thermo公司生產(chǎn)的Multiskan Sky High酶標(biāo)儀；美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀Cy-tomics FC 500。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備：隨機(jī)選取80只小鼠制備膿毒血癥小鼠模型：進(jìn)食12 h后，將10%水合氯醛注射入小鼠腹腔進(jìn)行麻醉，麻醉后，切開腹部將回腸與盲端分離，采用環(huán)形結(jié)扎盲腸根部(回腸盲端1.5～2.0 cm處)，保持腸道順暢，腸壁采用針頭貫穿穿刺，穿刺2次后將腹腔關(guān)閉，在小鼠體內(nèi)頸皮下注射50 mg/kg生理鹽水。

1.2.2 分組及治療：將20只未制備膿毒血癥小鼠模型的小鼠設(shè)為空白組，其余制備80只膿毒血癥小鼠模型的小鼠依次設(shè)為對照組及替格瑞洛低、中、高劑量組，每組20只。其中空白組和對照組在制備模型后12 h灌胃10 mg/kg蒸餾水；替格瑞洛低、中、高劑量組相同時(shí)間點(diǎn)灌胃5、10、15 mg/kg替格瑞洛。

1.3 觀察指標(biāo) ①小鼠存活率：統(tǒng)計(jì)各組小鼠存活數(shù)量，對小鼠存活率進(jìn)行計(jì)算。②小鼠脾指數(shù)：所有小鼠均在術(shù)后24 h處死，摘除眼球取血，采集血液2 ml，將其置于FP管內(nèi)，30 min，離心，速度為3000 r/min，10 min后，保留上清液，保存于-40 ℃冰箱內(nèi)。采集血液后用脫頸法將小鼠處死，將脾臟摘除，將其保存于液氮中。脾指數(shù)根據(jù)液氮中保存的脾臟進(jìn)行計(jì)算。脾指數(shù)=脾重(mg)/體重(g)×1000。③GPT、GOT水平：取上述保存的血清，GPT、GOT水平采用生化分析儀測定。④免疫功能：取上述保存的血清，CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Reg-ulatory T cell，Treg)水平采用流式細(xì)胞儀檢測。⑤Bax、Bcl-2、HMGB-1蛋白表達(dá)：將脾組織及血清濃度采用BCA法測定，暗室內(nèi)曝光顯影后，各條帶采用自動凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠存活率比較 空白組、對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組小鼠存活率依次為100%(20/20)、35%(7/20)、55%(11/20)、60%(12/20)、80%(16/20)，空白組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 各組小鼠脾指數(shù)、Bax和Bcl-2蛋白水平比較 空白組脾指數(shù)、Bax、Bcl-2蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組脾指數(shù)、Bax、Bcl-2蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組脾指數(shù)、Bax、Bcl-2蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組脾指數(shù)、Bax、Bcl-2蛋白水平優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠脾指數(shù)、Bax和Bcl-2蛋白水平比較

2.3 各組小鼠GPT、GOT水平比較 空白組GPT、GOT水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組GPT、GOT水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組GPT、GOT水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組GPT、GOT水平優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠GPT、GOT水平比較(U/L)

2.4 各組小鼠免疫功能比較 空白組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠免疫功能比較(%)

2.5 各組小鼠HMGB-1蛋白水平比較 空白組、對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組小鼠HMGB-1蛋白水平依次為(0.19±0.03)、(0.93±0.06)、(0.61±0.04)、(0.39±0.03)、(0.21±0.02)?？瞻捉MHMGB-1蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組HMGB-1蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組HMGB-1蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組HMGB-1蛋白水平優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

3 討 論

膿毒血癥是一種由病原微生物感染誘發(fā)，最終致使機(jī)體內(nèi)多器官功能衰竭的疾病綜合征。膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚不完全清楚，可能與機(jī)體內(nèi)的多系統(tǒng)、多器官生理病理改變有關(guān)，且可能與組織損害、凝血功能障礙、炎癥、感染等相關(guān)，已成為臨床棘手問題[4]。目前，臨床并無行之有效的方法治療膿毒血癥，常采用及時(shí)診斷及時(shí)對癥治療(輔助治療包括正性肌力藥物治療、血管升壓藥物治療及常規(guī)治療包括血流動力學(xué)支持、液體復(fù)蘇、感染源的控制與預(yù)防及抗生素治療等)以緩解膿毒血癥患者的臨床癥狀[5]。近年來，關(guān)于膿毒血癥的研究較多，但多個(gè)新藥在動物實(shí)驗(yàn)上結(jié)果證實(shí)療效較好，但在臨床并無取得明顯的療效。替格瑞洛是新一代的ADP受體拮抗劑，屬于新型環(huán)戊基三唑咪啶類口服抗血小板藥物，不需要活化，可逆地、迅速阻斷血小板二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集[6]。以往的研究已證實(shí)，替格瑞洛對心肌梗死患者具有較好的療效，且能夠有效治療糖尿病合并冠心病患者[7-9]。

本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒血癥小鼠模型，術(shù)后解剖小鼠腹腔發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)存在腐臭味，可觀察到膿液，同時(shí)盲腸段結(jié)扎部位存在發(fā)黑壞死，提示盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒血癥小鼠模型成功。動物免疫系統(tǒng)的第一道防線為脾臟，故體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物的特異性免疫與非特異性免疫的最基本指標(biāo)為脾臟重量，若小鼠的免疫功能減退則脾臟指數(shù)則明顯降低，且低于正常小鼠[10]。本研究結(jié)果顯示，空白組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組存活率明顯高于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組高于對照組(均P<0.05)，且空白組脾指數(shù)、Bax、Bcl-2蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組脾指數(shù)、Bax、Bcl-2蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組脾指數(shù)、Bax、Bcl-2蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組脾指數(shù)、Bax、Bcl-2蛋白水平優(yōu)于對照組(均P<0.05)，提示替格瑞洛可提高膿毒血癥小鼠存活率，恢復(fù)脾臟重量，降低機(jī)體內(nèi)損傷，發(fā)揮保護(hù)免疫損傷的功能，且其作用強(qiáng)度與劑量密切相關(guān)。

肝腎功能的重要指標(biāo)包括GPT、GOT水平[11]，本研究結(jié)果顯示，空白組GPT、GOT水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組GPT、GOT水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組GPT、GOT水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組GPT、GOT水平優(yōu)于對照組(均P<0.05)，提示替格瑞洛可保護(hù)膿毒血癥小鼠肝腎功能，從而發(fā)揮保護(hù)機(jī)體內(nèi)重要臟器的作用，且作用越強(qiáng)則劑量越高。

CD4+屬于一類輔助性T細(xì)胞，其活化后能夠刺激大量細(xì)胞因子釋放，從而正向調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫；而CD8+T細(xì)胞又被稱為抑制性T細(xì)胞，可負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫作用[12]。另外CD4+T細(xì)胞屬于重要的Th細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞參與免疫反應(yīng)的整個(gè)過程，根據(jù)其分泌的不同細(xì)胞因子，可分為2個(gè)細(xì)胞亞群分別為Th1和Th2,其中Th1主要參與分泌腫瘤壞死因子-α、IFN-γ、IL-2，參與細(xì)胞免疫，介導(dǎo)心包毒性T細(xì)胞反應(yīng)，促使免疫應(yīng)答提高[13]；Th2細(xì)胞可參與體液免疫，主要分泌IL-2、IL-6、IL-10等，發(fā)揮抑制免疫的作用。當(dāng)機(jī)體內(nèi)Th2細(xì)胞因子占主導(dǎo)地位時(shí)，可發(fā)生抑制免疫，致使病情加重。Th17細(xì)胞是一種可特異性分泌IL-17，但與Th1及Th2的CD4+不同；當(dāng)機(jī)體內(nèi)發(fā)生感染時(shí)，可通過分泌IL-17、上調(diào)特殊細(xì)胞因子、促炎性細(xì)胞因子與募集中性粒細(xì)胞及集落刺激因子，使其遷移到炎癥部位，導(dǎo)致免疫損傷。另外，其分泌的IL-17可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞動員興奮，發(fā)揮介導(dǎo)前炎癥反應(yīng)的作用[14-15]。Treg細(xì)胞具有一群具有抑制免疫作用的細(xì)胞群，Treg細(xì)胞活化后，可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β和免疫抑制因子IL-10的分泌機(jī)制，抑制效應(yīng)T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的激活，致使效應(yīng)T細(xì)胞活化及增殖抑制。而抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖分化則表示機(jī)體陷入免疫抑制狀態(tài)，致使機(jī)體內(nèi)炎癥因子水平降低[16-17]。本研究結(jié)果顯示，空白組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平優(yōu)于對照組(均P<0.05)，提示膿毒血癥小鼠CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平失衡，而替格瑞洛可恢復(fù)膿毒血癥小鼠CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平平衡，進(jìn)而抑制炎癥因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用，作用與劑量密切相關(guān)。

HMGB-1主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生非組核蛋白，屬于細(xì)胞外分子，其水平與巨噬細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)[18-20]。本研究結(jié)果顯示，空白組HMGB-1蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中、高劑量組，替格瑞洛高劑量組HMGB-1蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低、中劑量組，替格瑞洛中劑量組HMGB-1蛋白水平優(yōu)于對照組、替格瑞洛低劑量組，替格瑞洛低劑量組HMGB-1蛋白水平優(yōu)于對照組(均P<0.05)，提示替格瑞洛可降低膿毒血癥小鼠HMGB-1蛋白水平，其通過下調(diào)HMGB-1蛋白水平恢復(fù)其免疫機(jī)制。

綜上所述，替格瑞洛可提高膿毒血癥小鼠存活率，提高脾指數(shù)，降低GPT、GOT水平，避免肝腎功能受損損傷，調(diào)節(jié)CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg水平平衡，調(diào)節(jié)免疫功能，其可通過下調(diào)HMGB-1蛋白水平恢復(fù)其免疫機(jī)制，其作用與劑量密切相關(guān)。