張言言，韓 剛，曹 羽，張 云，張 旭，胡 建，龔航軍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院胃腸外科,上海 200021)

結(jié)直腸癌為全球病死率第四癌癥，約占全球因腫瘤或腫瘤相關(guān)疾病死亡人數(shù)的10%[1]。對于進展期的結(jié)直腸癌，根治效果較差。以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為主的化療對于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和提高患者生存率具有一定的作用，但是由于耐藥問題而出現(xiàn)化療失敗[2-5]。因此，開展分子靶點研究有助于增強化療藥物療效，提高患者生存率。

同源盒基因(Homeobox gene，HOXD)家族近年來報道為靶向致癌相關(guān)蛋白的重要轉(zhuǎn)錄因子[6-10]，其中HOXD10被認為是負調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的主要效應(yīng)物，其表達受DNA甲基化的調(diào)控，在結(jié)直腸癌中出現(xiàn)高甲基化低mRNA表達的情況[11-15]。此外，有文獻報道胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)是HOXD10的轉(zhuǎn)錄靶點，而IGFBP3作為胰島素樣生長因子通路的主要結(jié)合分子，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用[16-17]。盡管HOXD10-IGFBP3調(diào)控軸在結(jié)直腸癌進展中起到關(guān)鍵作用，但是否與化療藥物抵抗有關(guān)，目前報道較少。

本研究擬分析HOXD10和IGFBP3在原代腸癌細胞及耐藥株細胞中表達情況，證實HOXD10和IGFBP3在腸癌中的調(diào)控關(guān)系，明確HOXD10- IGFBP3調(diào)控軸對腸癌耐藥表型的影響，為腸癌患者精準化療提供干預(yù)靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人結(jié)直腸癌細胞SW480購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞資源中心；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司；細胞用青霉素和鏈霉素購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；總RNA分離提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司； siRNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM 3000試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、鼠抗人GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠及抗兔二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore公司；HOXD10、IGFBP3蛋白一抗購自CST公司；引物、siRNA及HOXD10過表達質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；5-Fu購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及5-Fu耐藥株獲得：人結(jié)直腸癌細胞SW480購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞資源中心。用含10%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素和 100 U/ml青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于27 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。5-Fu用DMSO配成母液后分裝凍存。候選試驗將母液用DMEM稀釋配制。本實驗室采用較大劑量間歇誘導(dǎo)法進行篩選,再采用濃度梯度遞增法作用,至SW480細胞可長期在5-Fu濃度為2.0 mg/L的細胞培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。

1.2.2 實驗分組：根據(jù)SW480腸癌細胞對5-Fu是否耐藥，分為5-Fu耐藥細胞組和5-Fu原代細胞組。對于靶基因敲減實驗：①HOXD10敲減，分為對照組(NC)即siRNA陰性對照，以及2條HOXD10 siRNA敲減組分別為siHOXD10-1和siHOXD10-2。②IGFBP3的敲減，分為對照組(NC)即siRNA陰性對照，以及2條IGFBP3 siRNA敲減組分別為siIGFBP3-1和siIGFBP3-2。對于靶基因過表達試驗，分為空載轉(zhuǎn)染(EV)及HOXD10過表達(pCMV-HOXD10)組。

1.2.3 siRNA、過表達質(zhì)粒構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染：siRNA陰性對照序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。HOXD10的2條特異siRNA序列分別為siHOXD10-1：5’-CCGAACAGAUCUUGUCGAATT-3’；siHOXD10-2：5’-GAUAAGCGCAACAAACUCATT-3’。IGFBP3的2條特異siRNA序列分別為siIGFBP3-1：5’-GCACAGAUACCCAGAACUUUU-3’；siIGFBP3-2：5’-GCACAGAUACCCAGAACUU-3’。空載質(zhì)粒為pcDNA3.1，并在此質(zhì)粒上構(gòu)建HOXD10過表達載體。siRNA及所有載體轉(zhuǎn)染腸癌細胞株按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000說明書進行操作。

1.2.4 實時熒光定量PCR:總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR按試劑盒說明書操作。Real-time定量PCR條件為95 °C 10 min后,95 °C 15 s，60 °C 1 min，40 循環(huán)。Real-time定量PCR使用ABI 7500儀器進行。根據(jù)待測標本的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計算相對表達倍數(shù)變化。其中各基因引物為HOXD10：F:5’-GACATGGGGACCTATGGAATGC-3’，R:5’-TGGTGGTTCACTTCTCTTTTGG-3’；IGFBP3：F:5’-GGCAGATGAAGCAGGATGTA-3’，R:5’-GACAGCAGTGTCTTGTTGTTG-3’；GAPDH：F:5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，R:5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。

1.2.5 蛋白免疫印跡(WB)：采用RIPA裂解每組樣品抽提總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒說明書進行蛋白定量。每組細胞取50 μg蛋白上樣，在10%的SDS-PAGE中進行電泳2 h，然后將蛋白轉(zhuǎn)膜至甲醇預(yù)處理的PVDF膜1 h，以5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入1∶1000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，次日PBST漂洗3次，每次10 min，加入1∶5000稀釋的HRP標記的二抗室溫孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min后，用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯色。

1.2.6 CCK-8實驗：對照組及處理組胰腺癌細胞以1×105細胞接種96孔板，加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。通過酶標儀測量該樣品在450 nm處的吸光度值。

1.2.7 細胞克隆形成實驗：取對數(shù)生長期細胞以500個/孔細胞接種與6孔板，培養(yǎng)7～14 d，待有單克隆生長進行4%多聚甲醛固定，0.2%結(jié)晶紫染色，用水洗滌，晾干，照片計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥細胞組與原代細胞組對5-Fu敏感性比較 利用CCK-8實驗，發(fā)現(xiàn)SW480耐藥株在各5-Fu濃度下(2.5、5、10 μg/ml)的增殖活性，與0 μg/ml的5-Fu增殖活性無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。而原代SW480細胞在5 μg/ml的增殖活性出現(xiàn)下降，與0 μg/ml的5-Fu增殖活性相比有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.01)。見表1。

表1 原代及耐藥細胞組在不同5-Fu濃度下細胞增殖活性比較

2.2 HOXD10及其靶基因IGFBP3在耐藥細胞組及原代細胞組中表達的比較 qPCR結(jié)果表明耐藥細胞組HOXD10的相對表達倍數(shù)(0.51±0.096)與原代細胞組(1.00±0.091)比較下調(diào)，兩組表達比較有統(tǒng)計學(xué)差異(t=6.486,P=0.0029)；而耐藥細胞組的IGFBP3相對表達倍數(shù)(4.21±0.32)顯著高于原代細胞組(1.00±0.22)，兩組表達比較有統(tǒng)計學(xué)差異(t=14.12,P=0.0001)。WB也證實了耐藥細胞組較原代細胞組有較低的HOXD10和更高的IGFBP3表達水平(圖1)。

圖1 原代及耐藥細胞組HOXD10、IGFBP3表達

2.3 過表達或敲減HOXD10水平對IGFBP3表達的影響 我們成功在原代細胞組中進行HOXD10的敲減，2條siRNA均減低HOXD10表達水平，同時IGFBP3的表達水平較對照組增高(圖2)。此外，我們在耐藥細胞組中過表達HOXD10，IGFBP3的表達水平較對照組顯著減低(圖3)。

圖2 原代細胞組敲減后IGFBP3表達變化

圖3 耐藥細胞組過表達后IGFBP3表達變化

2.4 敲減IGFBP3對5-Fu誘導(dǎo)作用耐藥細胞組增殖活性的影響 如圖4所示，IGFBP3兩條特異性siRNA轉(zhuǎn)染耐藥組細胞，并成功敲減IGFBP3的表達水平。我們將對照組及兩個敲減組細胞進行各濃度的5-Fu處理，利用CCK-8發(fā)現(xiàn)：NC組各濃度處理下的細胞增殖活性比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)，siIGFBP3-1組細胞在5 μg/ml濃度下出現(xiàn)細胞增殖活性下降，與0 μg/ml濃度比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，siIGFBP3-2組細胞在2.5 μg/ml濃度下出現(xiàn)細胞增殖活性下降，與0 μg/ml濃度比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表2。細胞克隆試驗表明：siIGFBP3-1組細胞(克隆形成數(shù)：12.00±2.00個)及在siIGFBP3-2組細胞(克隆形成數(shù)：9.00±2.00個)在5 μg/ml的5-Fu濃度下的克隆形成數(shù)，與對照組(克隆形成數(shù)：45.00±3.00個)比較，顯著減少(siIGFBP3-1組細胞與對照組比較，t=21.53，P<0.0001；siIGFBP3-1組細胞與對照組比較t=23.45，P<0.0001)，見圖5。

圖4 在耐藥組中轉(zhuǎn)染IGFBP3兩條siRNA后IGFBP3的表達變化

表2 對照組、siIGFBP3-1及siIGFBP3-2組耐藥細胞在不同5-Fu濃度下細胞增殖活性比較

圖5 對照組、siIGFBP3-1及siIGFBP3-2組耐藥細胞在5 μg/ml的5-Fu濃度下的克隆形成數(shù)比較(結(jié)晶紫染色，×4)

2.5 過表達HOXD10對5-Fu誘導(dǎo)作用耐藥腸癌細胞株增殖活性的影響 如表3所示，空載轉(zhuǎn)染耐藥細胞株在各藥物5-Fu濃度下與0 μg/ml細胞增殖活性比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，HOXD10過表達耐藥細胞株在5～10 μg/ml濃度下細胞增殖活性下降，與0 μg/ml細胞增殖活性比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.0001)。細胞克隆試驗表明(圖6)，在耐藥細胞中過表達HOXD10后，耐藥細胞組在5 μg/ml細胞克隆數(shù)(6.00±1.00個)顯著減低，與空載轉(zhuǎn)染耐藥細胞組克隆形成數(shù)(45.00±2.00個)相比顯著較少，比較有統(tǒng)計學(xué)差異(t=30.21，P<0.0001)。

表3 空載轉(zhuǎn)染及HOXD10過表達耐藥細胞組在不同5-Fu濃度下細胞增殖活性的比較

圖6 空載轉(zhuǎn)染及HOXD10過表達耐藥細胞在5 μg/ml的5-Fu濃度下的克隆形成數(shù)比較(結(jié)晶紫染色，×4)

3 討 論

結(jié)直腸癌耐藥抵抗是臨床亟待解決問題，本研究揭示了HOXD10及其靶基因IGBPF3在腸癌5-Fu耐藥株中的重要作用。本實驗室前期成功獲得了5-Fu耐藥的腸癌細胞株SW480。此耐藥株在5-Fu各藥物濃度(5～20 μg/ml)下與0 μg/ml的5-Fu增殖活性無顯著變化，而原代細胞則顯著下降，表明本研究耐藥組誘導(dǎo)成功，可用于候選研究。近年研究發(fā)現(xiàn)，HOXD10在包括腸癌在內(nèi)的如腎癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、消化道等多種實體腫瘤中表達失活[11-17]，并且過表達HOXD10可發(fā)揮如細胞增殖抑制、轉(zhuǎn)移和侵襲減低等抑癌活性。本研究揭示HOXD10表達在腸癌耐藥株細胞比原代細胞更低；同時在耐藥株中過表達HOXD10后，耐藥株對5-Fu敏感性增強，細胞克隆形成能力顯著減低，表明HOXD10與腸癌5-Fu抵抗有著密切聯(lián)系。

既然HOXD10與腸癌細胞5-Fu敏感性有關(guān)，那么HOXD10作為轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控其靶基因發(fā)揮生物學(xué)作用。近年有文獻報道，HOXD10可在腫瘤細胞內(nèi)結(jié)合IGFBP3啟動子，抑制其轉(zhuǎn)錄表達[15-16]。高水平IGFBP-3被廣泛認為與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)[18-20]，但在腸癌5-Fu報道研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-3在耐藥組中表達較原代細胞表達更高，提示IGFBP3在耐藥抵抗起到關(guān)鍵作用。為確認HOXD10在腸癌耐藥株中對IGFBP3的調(diào)控作用，我們在耐藥組細胞中過表達HOXD10，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGFBP3表達水平被顯著抑制；而我們在原代細胞中敲減HOXD10后，IGFBP3的表達水平明顯增加，上述結(jié)果證實了HOXD10-IGFBP3調(diào)控軸的確在腸癌耐藥株中存在。

那么IGFBP3是否與腸癌耐藥表型有關(guān)呢？我們在耐藥組中進行IGFBP3敲減，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥組對5-Fu敏感性增強，細胞增殖活性顯著減弱，細胞克隆形成能力下降，表明IGFBP3高水平與維持腸癌耐藥表型有緊密聯(lián)系，而高水平IGFBP3由于失去低水平表達HOXD10調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，腸癌耐藥株與原代細胞相比具有低水平的HOXD10及更高表達的IGFBP3。在腸癌原代細胞及耐藥細胞中調(diào)節(jié)HOXD10表達可顯著影響IGFBP3的表達。腸癌耐藥株中過表達HOXD10或敲減IGFBP3可增強耐藥株對5-Fu的敏感性，靶向作用HOXD10-IGFBP3調(diào)控軸可能在減緩腸癌5-Fu化療抵抗及增強治療效果中具有臨床轉(zhuǎn)化價值。