張力丹, 龔旭平, 彭薪霏, 石福明, 常巖林

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院, 河北省動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北保定 071002)

消化道是消化系統(tǒng)的重要組成部分，其主要功能是提高食物消化與吸收的效率，保護(hù)生物體免受有害化學(xué)物質(zhì)、微生物和食物機(jī)械損傷的傷害，昆蟲消化道的結(jié)構(gòu)和功能反映出對食物的高度適應(yīng)性(Klowden, 2013; Holtofetal., 2019)。昆蟲中腸是消化道結(jié)構(gòu)和功能的中心，中腸前端的胃盲囊是長期進(jìn)化的結(jié)果。中腸上皮行使小分子的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)、離子和水的運(yùn)輸，是內(nèi)外環(huán)境的分界(Lietal., 2018; Cacciaetal., 2019)。目前，國內(nèi)外對蝗蟲消化系統(tǒng)的研究報(bào)道較多，包括消化道的基本結(jié)構(gòu)與中腸細(xì)胞吸收、代謝的功能等(Chauvin, 1938; Droste and Zebe, 1974; Maranaetal., 1997; 甘雅玲和郭中偉, 2002; 張小民等, 2006)。對蟋蟀科消化系統(tǒng)的形態(tài)、中腸細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及分泌機(jī)制等方面也有研究結(jié)果，如蟋蟀科的消化道中腸具有兩個(gè)胃盲囊，中腸主要由柱狀細(xì)胞和再生細(xì)胞組成，柱狀細(xì)胞中同時(shí)存在局部分泌和頂漿分泌兩種分泌機(jī)制；中腸細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)表明它們參與液體的分泌(從細(xì)胞到內(nèi)腔)和吸收(從內(nèi)腔到細(xì)胞)等(Woodring and Lorenz, 2007; Biagioetal., 2009; ?akici and Ergen, 2012)。此外，Li等(2018)對螽斯科優(yōu)雅蟈螽Gampsocleisgratiosa的中腸結(jié)構(gòu)、中腸細(xì)胞類型及分泌途徑等也有報(bào)道。但是，關(guān)于駝螽科消化系統(tǒng)的研究，卻罕見報(bào)道。

當(dāng)食物分解，營養(yǎng)被吸收后，剩余的殘留物與代謝產(chǎn)物必須排出體外或隔離，以防止影響其他新陳代謝途徑。昆蟲的排泄系統(tǒng)主要是馬氏管，它的作用是調(diào)節(jié)滲透壓、清除新陳代謝最后產(chǎn)物，并將有毒化合物儲(chǔ)存隔離或轉(zhuǎn)移到后腸，最后經(jīng)肛門排出體外(Klowden, 2013; Amutkan-Mutlu and Suludere, 2020)。 Polat等(2017)發(fā)現(xiàn)蟋蟀科的Grylluscampestris馬氏管的管腔側(cè)有緊密排列的微絨毛結(jié)構(gòu)，但微絨毛中沒有線粒體；微絨毛端部膨大呈圓球狀，此結(jié)構(gòu)包含的囊泡被證實(shí)是頂漿分泌物；Amutkan-Mutlu等(2021)利用光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察了螽斯科的Leptophyesalbovittata馬氏管上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，依據(jù)細(xì)胞質(zhì)電子密度的差異認(rèn)為馬氏管細(xì)胞中有2種細(xì)胞類型，此外發(fā)現(xiàn)馬氏管細(xì)胞中的球晶富含碳、磷和錳化學(xué)成分。

庭疾灶螽Tachycinesasynamorus隸屬于直翅目(Orthoptera)駝螽科(Rhaphidophoridae)，體型中等偏小，分布廣泛。駝螽科昆蟲完全無翅，體側(cè)扁，體背隆突；頭頂具縱溝；足較細(xì)長，缺跗墊，前足基節(jié)背面通常具小刺，前足脛節(jié)無聽器(Adelung, 1902)；通常群居生活，棲息于石縫、枯枝落葉層、洞穴等較陰暗潮濕的環(huán)境，是直翅目僅有的腐生性類群。Novak和Kustor(1983)發(fā)現(xiàn)駝螽科的Troglophiluscavicola和Troglophilusneglectus的生活史為2年，并以成蟲越冬；Ander(1939)對螽亞目進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析認(rèn)為駝螽科是最原始的螽斯類昆蟲。本研究以庭疾灶螽為材料，應(yīng)用光學(xué)顯微技術(shù)、激光共聚焦顯微技術(shù)和透射電鏡技術(shù)對其消化道的形態(tài)結(jié)構(gòu)、中腸和馬氏管的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，旨在為駝螽科物種的內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究提供基礎(chǔ)資料，探索消化系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上與食性的適應(yīng)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

庭疾灶螽成蟲，于2020年9月及2021年8月采集于河北省保定市蓮池區(qū)河北大學(xué)校園。

1.2 解剖學(xué)觀察

選取雌、雄成蟲各5頭，在LEICA M250A體視鏡下，用眼科剪沿蟲體側(cè)膜剪開后去掉體壁，去除氣管、脂肪組織后，露出完整的消化道。將解剖分離的消化道投放到盛有PBS緩沖液的干凈培養(yǎng)皿中進(jìn)行拍照，所用單反相機(jī)型號是Canon E0S 7D。

1.3 顯微結(jié)構(gòu)觀察

1.3.1蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, H.E.)染色：將中腸及馬氏管置于Bouin氏固定液中固定，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟滲透包埋后，石蠟切片機(jī)切片。室溫下進(jìn)行常規(guī)的蘇木精-伊紅染色，Olympus BX51光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.3.2高碘酸-Schiff試劑(periodic acid Schiff, PAS)染色：固定、脫水等制作石蠟切片步驟同1.3.1節(jié)。PAS染色時(shí)先經(jīng)過二甲苯脫蠟，之后經(jīng)過梯度酒精直至到蒸餾水，之后在4%的高碘酸水溶液中處理5 min， PAS中染色15 min。再經(jīng)過3次亞硫酸水溶液處理，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，后續(xù)過程經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后，中性樹膠封片，Olympus BX51光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.3.3微絲、微管熒光染色：選取消化道的中腸部分置于4%多聚甲醛溶液中，4℃下固定24 h。然后在0.5 mol/L蔗糖中脫水，-20℃下用O.C.T.包埋。用Leica CM1860冷凍切片機(jī)將包埋塊切成5 μm厚的冰凍切片，并粘附于載玻片上。

將10余根馬氏管置于滴有4%多聚甲醛溶液的多聚賴氨酸載玻片上，固定10 min。然后用蒸餾水沖洗干凈，用吸水紙吸去多余水分后晾干。

在室溫下，用1% Triton X-100將中腸切片及馬氏管裝片處理30 min。然后用5% BSA封閉處理1 h；接著用異硫氰酸標(biāo)記的抗α-微管蛋白鼠單克隆抗體(anti-α-tubulin-FITC， mouse monoclonal, Sigma-Aldrich)1∶100稀釋，室溫下孵育1 h，PBS漂洗3次。再將組織用鬼筆環(huán)肽-羅丹明(phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate, Sigma-Aldrich)染色45 min，PBS漂洗。接著，DAPI染色15 min，PBS漂洗。之后在FV3000激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.4 超微結(jié)構(gòu)觀察

將切割成約1 mm3的新鮮中腸及馬氏管置于2.5%戊二醛溶液中前固定。后轉(zhuǎn)至四氧化鋨溶液中進(jìn)行后固定。梯度酒精脫水后，分別在丙酮、丙酮/環(huán)氧樹脂Epon812(1∶1, v/v)和純環(huán)氧樹脂Epon812中滲透。最后于純Epon812中進(jìn)行室溫下聚合12 h，60℃聚合48 h。用Reichert-Jung超薄切片機(jī)切成厚度70 nm的超薄切片，用檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染后，在日立HT7800透射電子顯微鏡下觀察(加速電壓80 kV)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 消化道形態(tài)

庭疾灶螽的消化道由前腸、中腸和后腸3部分構(gòu)成。前腸包括咽、食道、嗉囊和前胃；中腸包括前端的胃盲囊和中腸；后腸包括回腸、結(jié)腸、直腸和肛門(圖1: C)。咽與食道較短，前端囊狀的為接納和臨時(shí)貯存食物的嗉囊，嗉囊是消化道中除中腸以外最長的部位，整體呈不規(guī)則形，前端細(xì)，后端則明顯膨脹，背面呈圓弧形，腹面弧度較小(圖1: C)。嗉囊后端縮細(xì)與前胃相連。在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上，前胃是消化道最為骨化的部分(圖2: A-B)。從胃盲囊延伸到馬氏管著生處的管道為中腸。細(xì)長的馬氏管在中、后腸交界處著生。馬氏管著生處之后的腸道為后腸，后腸的前部分粗細(xì)均勻，屬于回腸；中部細(xì)而長，屬于結(jié)腸；后端有所膨大，為直腸，直腸通向肛門。

圖1 庭疾灶螽生態(tài)照片及雄性消化道解剖結(jié)構(gòu)Fig. 1 Ecological image and anatomy of male digestive tract of Tachycines asynamorusA: 雌成蟲Female adult; B: 雄成蟲Male adult; C: 雄成蟲消化道解剖結(jié)構(gòu)Anatomical structure of digestive tract of male adult. Co: 結(jié)腸Colon; Cr: 嗉囊Crop; Gc: 胃盲囊Gastric caeca; Il: 回腸Ileum; Mt: 馬氏管Malpighian tubules; Pv: 前胃Proventriculus; Re: 直腸Rectum.

2.2 胃盲囊顯微結(jié)構(gòu)

胃盲囊是中腸前部3個(gè)向前延伸的球狀結(jié)構(gòu)(圖2: A)。3個(gè)胃盲囊合抱前胃，是中腸的起始部位(圖2: A-B)。胃盲囊內(nèi)無幾丁質(zhì)內(nèi)膜。胃盲囊上皮細(xì)胞排列有一定規(guī)律性，可見2類上皮細(xì)胞交替排列。一類為靠近基部的再生細(xì)胞，另一類是端部覆蓋有微絨毛的柱狀上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞外側(cè)依次為環(huán)肌和縱肌(圖2: C)。胃盲囊上皮細(xì)胞基底膜處PAS染色為紅色(圖2: D)，推測基底膜具有復(fù)合糖成分。

圖2 庭疾灶螽胃盲囊Fig. 2 Gastric caeca of Tachycines asynamorusA: 胃盲囊解剖結(jié)構(gòu)Dissected gastric caeca; B: 胃盲囊整體橫切石蠟切片H.E.染色 Paraffin transection of gastric caeca stained with hematoxylin-eosin; C: 胃盲囊部分橫切石蠟切片H.E.染色Part of gastric caeca transection stained with hematoxylin-eosin; D: 胃盲囊部分橫切石蠟切片PAS-蘇木精染色Part of gastric caeca transection stained with PAS-hematoxylin. Bl: 基膜Basal lamina; Cc: 柱狀細(xì)胞Columnar cell; Cm: 環(huán)肌Circular muscle; Gc: 胃盲囊Gastric caeca; Lm: 縱肌Longitudinal muscle; Mv: 微絨毛Microvilli; Pv: 前胃Proventriculus; Rc: 再生細(xì)胞Regenerative cell.

2.3 中腸顯微結(jié)構(gòu)

中腸橫切面近環(huán)形(圖3: A-B)。中腸壁結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)可以分為5層：漿膜、環(huán)肌、縱肌、基底膜、上皮層。中腸上皮細(xì)胞排列整齊，由柱狀上皮細(xì)胞、再生細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞組成，其中柱狀上皮細(xì)胞與內(nèi)分泌細(xì)胞由再生細(xì)胞分化而來。柱狀上皮細(xì)胞形態(tài)大小均一，緊密相貼，在端部特化成整齊排布的微絨毛，被鬼筆環(huán)肽-羅丹明染成紅色；核大呈圓形，被DAPI染成藍(lán)色(圖3: B)。

再生細(xì)胞位于上皮層基部，聚集形成龕(niche)。再生細(xì)胞體積較柱狀細(xì)胞小，細(xì)胞核相對大，包括干細(xì)胞和分化中的細(xì)胞。有的再生細(xì)胞龕中可以觀察到正在進(jìn)行有絲分裂的干細(xì)胞(圖3: C-D)。內(nèi)分泌細(xì)胞分布于柱狀上皮細(xì)胞中，數(shù)量較少。光學(xué)顯微鏡下，內(nèi)分泌細(xì)胞不易與柱狀上皮細(xì)胞區(qū)分。

中腸肌肉的層次排列為縱肌在內(nèi)，環(huán)肌在外。在中腸多見頂漿分泌，頂漿分泌時(shí)，細(xì)胞膜頂端多處發(fā)生破裂，將細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器及其分泌物一起排入中腸腔中(圖3: C)。此外，在整個(gè)中腸腔內(nèi)觀察到圍食膜包裹食物團(tuán)，并且在圍食膜和上皮之間有間隙(圖3: A)。中腸基底膜較厚，經(jīng)過PAS染成紅色(圖3: D)。

圖3 庭疾灶螽中腸Fig. 3 Midgut of Tachycines asynamorusA: 中腸整體橫切石蠟切片H.E.染色，方框內(nèi)局部結(jié)構(gòu)為圖C所示Paraffin transection of midgut stained with hematoxylin-eosin and the local structure in line frame shown in Fig. C; B: 中腸冰凍切片免疫熒光染色Frozen section of midgut stained with immunofluorescence; C: 中腸橫切石蠟切片H.E.染色，圓圈內(nèi)為龕, 箭頭示球狀分泌物質(zhì)和三角形示線團(tuán)狀分泌物質(zhì)Paraffin transection of midgut stained with hematoxylin-eosin, inside the circle being the niche, the arrows indicating the secretory substances in spherical particle and triangles indicating the secretory substance like linear clump; D: 中腸石蠟切片PAS染色顯示基膜呈紅色，中腸腔內(nèi)有明顯圍食膜Paraffin section of midgut stained with PAS-hematoxylin showing the basal lamina stained in red and a distinct peritrophic matrix in the lumen. Bl: 基膜Basal lamina; Cc: 柱狀細(xì)胞Columnar cell; Cm: 環(huán)肌Circular muscle; Ep: 上皮Epithelium; L: 內(nèi)腔Lumen; Lm: 縱肌Longitudinal muscle; Mv: 微絨毛Microvilli; Pm: 圍食膜Peritrophic matrix; Rc: 再生細(xì)胞Regenerative cell.

2.4 中腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.4.1柱狀上皮細(xì)胞：細(xì)胞端部伸到腸腔，細(xì)胞的游離面較寬，基部較細(xì)(圖4: A)。細(xì)胞中含有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、大量線粒體和電子密度不同、大小不等的分泌泡分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖4: A)。核周區(qū)和端部的細(xì)胞器類型一致。在細(xì)胞端部區(qū)域，細(xì)胞緊密地貼在一起，較長的間壁連接呈直線型，維持著上皮細(xì)胞間的聯(lián)系(圖4: B)。細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞的基部區(qū)域，包含明顯的核仁和隨機(jī)分布的不規(guī)則團(tuán)塊狀的異染色質(zhì)。柱狀上皮細(xì)胞頂膜特化形成微絨毛來擴(kuò)大吸收的表面積，在電子顯微鏡下可以看到微絨毛中軸含有縱行微絲(圖4: A-B)。

電子顯微鏡下可以觀察到柱狀細(xì)胞在靠近微絨毛的細(xì)胞質(zhì)中，有兩類被細(xì)胞質(zhì)包裹的分泌物：一種是由電子密度低的物質(zhì)包被的線團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，另一種是電子密度很高的球狀結(jié)構(gòu)(圖4: C)。柱狀上皮細(xì)胞微絨毛可以被鬼筆環(huán)肽-羅丹明染成紅色，同時(shí)線團(tuán)狀結(jié)構(gòu)被鬼筆環(huán)肽-羅丹明染成鮮亮的紅色(圖4: G)，但線團(tuán)狀結(jié)構(gòu)被異硫氰酸標(biāo)記的抗α-微管蛋白抗體染的綠色不明顯(圖4: F)。結(jié)合電鏡超微結(jié)構(gòu)，推測柱狀上皮細(xì)胞微絨毛的主要成分是微絲，柱狀上皮細(xì)胞分泌物的線團(tuán)狀結(jié)構(gòu)主要由大量微絲包裹而成，最后通過頂漿分泌運(yùn)輸?shù)桨?圖4: C-D)。此外，一些電子密度程度不同的分泌物囊泡也通過此類方式移出胞外(圖4: E)。

圖4 庭疾灶螽中腸的柱狀上皮細(xì)胞Fig. 4 Columnar cells of Tachycines asynamorusA: 中腸柱狀上皮細(xì)胞Columnar cells of the midgut; B: 細(xì)胞微絨毛端部形成囊泡釋放入管腔中，小圖示微絨毛橫切Apical part of microvilli of columnar cell generates small vesicles and releases into the central lumen, and the inset shows the detail of microvilli transection; C: 細(xì)胞近端部分布2種分泌物質(zhì)，一種呈線團(tuán)狀，一種呈球狀顆粒， 小圖示包被分泌物質(zhì)的囊泡橫切Two secretory substances are distributed within the cell, one is like linear clump and the other is in spherical particle, and the inset shows the transverse section of vesicles containing secretions; D: 胞外分泌物質(zhì)Exocrine substances; E: 靠近微絨毛的分泌囊泡Secretory vesicles near microvilli; F: 中腸冰凍切片免疫熒光染色, 熒光顯示細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)被染成綠色(微管蛋白) Frozen section of midgut stained with immunofluorescence, cytoplasmic matrix being strained in green (tubulin); G: 中腸冰凍切片免疫熒光染色, 熒光染色顯示柱狀上皮細(xì)胞的分泌物質(zhì)(三角形指示)和微絨毛被染成紅色Frozen section of midgut stained with immunofluorescence, secretory substances (indicated by triangle) and microvilli of columnar cells being stained in red; H: 中腸冰凍切片熒光染色疊加圖Merge of immunofluorescent image of frozen section of midgut. 星號示基底膜。The asterisk indicates the basal lamina. M: 線粒體Mitochondrion; Mi: 微絲Microfilaments; Mv: 微絨毛Microvilli; Nu: 細(xì)胞核Nucleus; RER: 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Rough endoplasmic reticulum; Sj: 間壁連接Septate junction; V: 囊泡Vesicle.

2.4.2再生細(xì)胞：細(xì)胞位于中腸上皮組織基部，其體積較小、細(xì)胞質(zhì)有限，通常為多個(gè)細(xì)胞聚集在一起形成龕(圖3: C-D)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核大，近橢圓形，占據(jù)細(xì)胞大部分空間(圖5: A-B)。細(xì)胞核仁明顯，異染色質(zhì)團(tuán)塊清晰，細(xì)胞質(zhì)中可見大量球狀或長條狀線粒體和少量低電子密度囊泡(圖5: B)。細(xì)胞基部細(xì)胞膜與基膜緊密相連。當(dāng)柱狀上皮細(xì)胞凋亡或損傷時(shí)，再生細(xì)胞分化形成柱狀上皮細(xì)胞，通過細(xì)胞逐漸延長至端部到達(dá)管腔。

2.4.3內(nèi)分泌細(xì)胞：細(xì)胞通常位于再生細(xì)胞龕的外圍，其核位于細(xì)胞端部，比大多數(shù)的柱狀上皮細(xì)胞的卵圓形核小得多(圖5: C)。細(xì)胞質(zhì)向下延伸到基膜，向上不到達(dá)管腔，內(nèi)有大量的中等電子密度的分泌顆粒(圖5: D-E)。

圖5 庭疾灶螽中腸的再生細(xì)胞及內(nèi)分泌細(xì)胞Fig. 5 Regenerative cells and endocrine cells of the midgut of Tachycines asynamorusA: 龕中的再生細(xì)胞Regenerative cells in the niche; B: 細(xì)胞核周圍的線粒體Mitochondria around the nucleus; C: 中腸內(nèi)分泌細(xì)胞與再生細(xì)胞基部相鄰Endocrine cells adjacent to the basal region of the regenerative cells; D: 內(nèi)分泌細(xì)胞基部與發(fā)達(dá)的基膜相連Basal region of endocrine cell connecting with developed basal lamina; E: 內(nèi)分泌細(xì)胞包含的分泌顆粒Secretory granules in endocrine cells. Bl: 基膜Basal lamina; Lm: 縱肌Longitudinal muscle; M: 線粒體Mitochondrion; Nu: 細(xì)胞核Nucleus.

2.5 中腸基底超微結(jié)構(gòu)

無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基膜是一類細(xì)胞外基質(zhì)，位于上皮組織與結(jié)締組織之間。庭疾灶螽的基膜厚度約1～2 μm，較發(fā)達(dá)，與縱肌緊密相連(圖6: A-C)。當(dāng)管腔中未被食物充滿時(shí)，基膜向上皮組織基部內(nèi)折。當(dāng)管腔充滿食物時(shí)，基膜會(huì)展開為食物提供更大的空間?；ね庵苡煽v肌與環(huán)肌內(nèi)外嵌合而成，為腸道的蠕動(dòng)提供機(jī)械支持(圖6: D-E)。在肌肉層周圍散布著的氣管細(xì)胞可幫助腸道進(jìn)行呼吸交換氣體(圖6: F)。

圖6 庭疾灶螽的中腸基底Fig. 6 Basal region of the midgut of Tachycines asynamorusA: 中腸基膜Basal lamina of the midgut; B: 分布在基膜下的縱肌Distribution of the longitudinal muscle below the basal lamina; C: 中腸基膜的細(xì)節(jié)圖Detailed image of basal lamina of the midgut; D: 中腸環(huán)肌肌肉層Circular muscle layer of the midgut; E: 形狀不規(guī)則的肌細(xì)胞核Irregularly-shaped muscle nucleus; F: 中腸漿膜及氣管細(xì)胞Serosa and trachea cells of midgut. Bl: 基膜Basal lamina; Cm: 環(huán)肌Circular muscle; Lm: 縱肌Longitudinal muscle; Nu: 細(xì)胞核Nucleus; Tr: 微氣管Tracheole.

免疫熒光染色顯示，基膜經(jīng)鬼筆環(huán)肽-羅丹明染成紅色(圖4: G)。由于鬼筆環(huán)肽特異性地與細(xì)胞中的微絲結(jié)合，故推測基膜上有微絲的成分可能對組織起到支撐作用。中腸基膜經(jīng)過PAS染成紅色(圖3: D)，推測基膜含有復(fù)合糖成分。

2.6 馬氏管顯微結(jié)構(gòu)

庭疾灶螽的馬氏管數(shù)目220～260根，基部著生于中后腸的交界處，端部封閉游離于血腔中(圖1: C)。馬氏管的管壁為具有大的細(xì)胞核的單層上皮細(xì)胞，有3～5個(gè)大型細(xì)胞圍繞管腔。馬氏管靠管腔內(nèi)為一層長而密集的微絨毛(圖7: A-B)。熒光染色觀察顯示， 馬氏管管腔內(nèi)的微絨毛被鬼筆環(huán)肽-羅丹明染成紅色(圖7: C-F)。

圖7 庭疾灶螽馬氏管的顯微結(jié)構(gòu)Fig. 7 Microstructure of the Malpighian tubules of Tachycines asynamorusA: 馬氏管橫切石蠟切片H.E.染色Paraffin transection of Malpighian tubules stained with hematoxylin-eosin; B: 馬氏管橫切石蠟切片細(xì)節(jié)圖Detailed image of paraffin transection of Malpighian tubules; C: 馬氏管免疫熒光染色圖, 熒光染色顯示馬氏管細(xì)胞核被染成藍(lán)色(DAPI) Immunofluorescent image of Malpighian tubules, the nuclei being stained in blue (DAPI); D: 馬氏管免疫熒光染色圖, 熒光染色顯示細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)被染成綠色(微管蛋白) Immunofluorescent image of Malpighian tubules, cytoplasmic matrix being stained in green (tubulin); E: 馬氏管免疫熒光染色圖, 熒光染色顯示馬氏管管腔微絨毛被染成紅色(微絲) Immunofluorescent image of Malpighian tubules, the microvilli in the lumen of Malpighian tubules being stained in red (microfilaments); F: 馬氏管免疫熒光染色疊加圖Merge of immunofluorescent image of Malpighian tubules. Mi: 微絲Microfilaments; Mv: 微絨毛Microvilli; Nu: 細(xì)胞核Nucleus.

2.7 馬氏管超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下觀察到馬氏管從外向內(nèi)依次由無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基膜、單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的上皮組織、中央管腔等組成。微絨毛位于端部細(xì)胞膜，排列致密，伸入中央管腔內(nèi)(圖8: A-B)。

單層細(xì)胞的細(xì)胞核大且明顯，位于細(xì)胞中央?yún)^(qū)域，含有異染色質(zhì)形成的小塊(圖8: D)。相鄰的細(xì)胞間存在間壁連接(圖8: A)。

細(xì)胞基部的細(xì)胞膜(基底膜)高度內(nèi)褶形成膜質(zhì)迷路，可占細(xì)胞近1/3，其中分布大量的形狀各異的線粒體與少量的空泡，并垂直于基膜(圖8: C)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布著電子致密的同心圓球晶體，同心圓間很有層次感，規(guī)則排列。馬氏管細(xì)胞的外表面由肌肉層和氣管環(huán)繞(圖8: E-F)。

圖8 庭疾灶螽馬氏管的超微結(jié)構(gòu)Fig. 8 Ultrastructure of the Malpighian tubules of Tachycines asynamorusA: 相鄰細(xì)胞間存在間壁連接，細(xì)胞質(zhì)頂端部具有纖細(xì)的微絨毛Septate junction between two neighboring cells and apical cytoplasm with slender microvilli; B: 分布在細(xì)胞質(zhì)中電子密度不等的囊泡Vesicles with varying electron densities distributed in the cytoplasm; C: 上皮細(xì)胞基部細(xì)胞膜深度內(nèi)折形成膜迷路(黑色箭頭指示)Basement membrane of epithelial cell with typical multiple infoldings, generating a membrane labyrinth indicated by black arrow; D: 細(xì)胞核形狀不規(guī)則，含有異染色質(zhì)形成的小塊Nucleus in irregular shape, containing several small patches of heterochromatin; E: 細(xì)胞的端部和基底部區(qū)含有大量的同心圓球晶體Numerous concentrically layered spherites in the apical and basal region of the cell; F: 電子密度不等的同心圓球晶體Concentrically layered spherites with varying electron densities. Lm: 縱肌Longitudinal muscle; Lu: 管腔Lumen; M: 線粒體Mitochondrion; Mv: 微絨毛Microvilli; Nu: 細(xì)胞核Nucleus; S: 球晶體Spherite; Sj: 間壁連接Septate junction; Tr: 微氣管Tracheole; V: 囊泡Vesicle.

3 討論

3.1 中腸的結(jié)構(gòu)與功能

昆蟲多樣化的食性與其消化道的結(jié)構(gòu)和功能相適應(yīng)(Nation, 2011)。其消化道由單層上皮細(xì)胞構(gòu)成，外圍有基底膜和橫紋肌。通常認(rèn)為消化道是從口到肛門的管狀結(jié)構(gòu)，其縱貫于血腔中央，具有運(yùn)送、消化食物和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的作用，是個(gè)體完成生長、發(fā)育和繁殖的基礎(chǔ)(Chapman, 2013)。昆蟲前腸和后腸起源于外胚層，前腸在儲(chǔ)存食物和消化方面具有相當(dāng)重要的作用，但在吸收方面作用不顯著；而后腸具有回收水和排便的作用(Chapman, 2013)。

中腸是消化道中唯一內(nèi)胚層起源的部分，中腸胃盲囊的形態(tài)、數(shù)量、大小和著生位置因昆蟲種類不同而異，主要功能是增加中腸的表面積，有利于產(chǎn)生消化酶和吸收營養(yǎng)物質(zhì)(Chapman, 2013)，這可能與昆蟲的食性相關(guān)。直翅目中不同科的胃盲囊數(shù)量具有差異，如蝗科具6個(gè)胃盲囊，且每個(gè)分成前后2葉；在螽斯科和蟋蟀科的一些種類中，胃盲囊著生于中腸前端，數(shù)量僅有2個(gè)，其基部較寬，遠(yuǎn)端部較窄(劉玉素和廬寶廉, 1955; Biagioetal., 2009; ?akici and Ergen, 2012; Lietal., 2018)。本研究發(fā)現(xiàn)庭疾灶螽有3個(gè)胃盲囊，其表面排布有網(wǎng)狀氣管(圖2: A)，表明胃盲囊有很多需氧的代謝活動(dòng)，如大分子營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、消化酶的分泌等。

中腸細(xì)胞積極參與消化酶的產(chǎn)生和分泌以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因此中腸是消化道的功能核心(Chapman, 2013)。中腸主要有兩種分化后的細(xì)胞類型，即柱狀上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞。幾個(gè)再生細(xì)胞聚集在一起形成再生細(xì)胞龕。此外，中腸細(xì)胞中還有一種杯狀細(xì)胞，在鱗翅目、毛翅目、蜉蝣目及襀翅目的消化道中常見(Chapman, 2013)。本研究結(jié)果表明，庭疾灶螽中腸的顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察沒有發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞，該種中腸細(xì)胞共有3種類型：再生細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞。

再生細(xì)胞主要補(bǔ)充受損或凋亡的柱狀上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞(Nation, 2011)。再生細(xì)胞位于腸壁細(xì)胞基部的再生細(xì)胞龕內(nèi)，在龕中有一個(gè)特殊的微環(huán)境保持它們的干細(xì)胞特征(Illa-Bochaca and Montuenga, 2006)。飛蝗Locustamigratoria的再生細(xì)胞聚集在中腸上皮基部的龕內(nèi)，并沿胃盲囊和中腸分布。蟋蟀Achetadomesticus中腸再生細(xì)胞是上皮的干細(xì)胞，增殖密集。位于龕內(nèi)頂端的細(xì)胞具有上皮特征并分化為上皮細(xì)胞，那些退化的上皮細(xì)胞則從基膜分離而消失，中腸細(xì)胞的再生是連續(xù)的(Rost-Roszkowska, 2008)。膜翅目中Meliponaquadrifasciataanthidioides成蟲的再生細(xì)胞龕的位置是等距的，若蟲細(xì)胞龕則不規(guī)律分布在柱狀上皮細(xì)胞間；在變態(tài)過程中，幼蟲中腸上皮退化，在幼蟲的再生細(xì)胞分化過程中形成新的成蟲中腸上皮(Martinsetal., 2006)。本研究結(jié)果表明，庭疾灶螽的再生細(xì)胞龕位于中腸上皮基部，數(shù)量多且排布較整齊，緊貼于基膜內(nèi)側(cè)(圖3: C-D)；通過超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)再生細(xì)胞包含數(shù)量多、形狀不規(guī)則的線粒體(圖5: B)。再生細(xì)胞有絲分裂后，進(jìn)一步分化出柱狀上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞。

柱狀上皮細(xì)胞是所有昆蟲中腸的主要細(xì)胞類型，承擔(dān)消化酶的產(chǎn)生和營養(yǎng)的吸收，頂膜上有微絨毛，增加了中腸的表面積?；认xAbracrisflavolineata中腸的柱狀上皮細(xì)胞微絨毛被糖萼覆蓋，微絨毛間有深色顆粒，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量的高爾基體靠近細(xì)胞核，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富(Maranaetal., 1997)。本研究發(fā)現(xiàn)，庭疾灶螽中腸柱狀上皮細(xì)胞微絨毛密集，有利于與腸腔物質(zhì)交換(圖4: A-B)。胞內(nèi)大量與分泌相關(guān)的細(xì)胞器表明柱狀上皮細(xì)胞的分泌活動(dòng)強(qiáng)烈。柱狀上皮細(xì)胞有兩種明顯的分泌顆粒(圖4: C)，一種是線團(tuán)狀顆粒，熒光染色與超微結(jié)構(gòu)表明該顆粒由微絲包裹有固定形態(tài)的胞內(nèi)物質(zhì)而形成，推測該分泌顆粒是為了將細(xì)胞內(nèi)的多余結(jié)構(gòu)排出；另一種是電子密度很高的球狀顆粒，可能包含消化酶。對于2種物質(zhì)的具體組成及其作用，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

內(nèi)分泌細(xì)胞有兩種不同的形態(tài)特征：開放型內(nèi)分泌細(xì)胞與中腸腔直接接觸，基膜位于中腸基板上；閉合型內(nèi)分泌細(xì)胞不會(huì)延伸到整個(gè)中腸上皮，因此也不會(huì)到達(dá)管腔，與基膜接觸面小(Cacciaetal., 2019)。 內(nèi)分泌細(xì)胞的分泌特性體現(xiàn)在其細(xì)胞質(zhì)中有許多電子致密顆粒(Bonellietal., 2019)。 Neves等(2003)發(fā)現(xiàn)膜翅目的Meliponaquadrifasciataanthidioides中腸細(xì)胞中閉合型內(nèi)分泌細(xì)胞體積較小，有不規(guī)則的分泌顆粒，電子密度低于開放型內(nèi)分泌細(xì)胞；開放型內(nèi)分泌細(xì)胞的分泌顆粒及線粒體主要位于細(xì)胞質(zhì)基部。 直翅目昆蟲中，Illa-Bochaca和Montuenga(2006)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)飛蝗Locustamigratoria中腸內(nèi)分泌細(xì)胞通常位于細(xì)胞龕的外圍，增殖速度慢，其細(xì)胞核比大多數(shù)上皮細(xì)胞的核小，通過細(xì)長的細(xì)胞質(zhì)延伸到達(dá)中腸腔。本研究發(fā)現(xiàn)，庭疾灶螽只有一種位于再生細(xì)胞龕外圍的閉合型內(nèi)分泌細(xì)胞(圖5: C)，沒有膜迷路，在基底細(xì)胞區(qū)有較大的分泌顆粒聚集，推測它們通過基膜排出內(nèi)容物到血腔中。內(nèi)分泌細(xì)胞在昆蟲中腸中所起的作用尚不清楚，但與脊椎動(dòng)物一樣，這些細(xì)胞可能在調(diào)節(jié)腸道活動(dòng)方面起作用(Lehaneetal., 1996)。

本研究結(jié)果表明，庭疾灶螽的中腸基底層由基膜、肌肉以及其他結(jié)締組織組成。在光學(xué)顯微鏡下觀察，基膜位于再生細(xì)胞與肌肉層之間，呈線狀，結(jié)構(gòu)清晰完整(圖3: C-D)?；ぽ^厚，約1～2 μm，PAS染色呈現(xiàn)明顯的紅色，表明基膜包含大量的復(fù)合糖成分，熒光染色觀察到基膜上具有微絲(圖4: G)。電子顯微鏡下，基膜由靠近細(xì)胞膜的基板和外圍的網(wǎng)板構(gòu)成，基板的質(zhì)地均勻且連續(xù)，網(wǎng)板的結(jié)構(gòu)類似于網(wǎng)格狀，較疏松(圖6: C)。致密且收縮性不強(qiáng)的基板為中腸上皮細(xì)胞提供了穩(wěn)定的機(jī)械支撐，質(zhì)地疏松的網(wǎng)板為中腸的收縮運(yùn)動(dòng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。推測基膜的基板與網(wǎng)板的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)通過對中腸上皮細(xì)胞的支撐作用為腸道的蠕動(dòng)提供保障。

綜上所述，庭疾灶螽中腸符合昆蟲中腸的基本結(jié)構(gòu)，中腸壁結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次為漿膜、環(huán)肌、縱肌、基底膜和上皮層。但胃盲囊的數(shù)量與直翅目蝗蟲、蟋蟀皆不同，為3個(gè)。作為消化道的功能核心，庭疾灶螽中腸細(xì)胞類型有再生細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞，沒有杯狀細(xì)胞；中腸3類細(xì)胞的著生位置與直翅目其他種相似，同時(shí)我們首次觀察到了庭疾灶螽中腸內(nèi)分泌細(xì)胞，推測是封閉式中腸內(nèi)分泌細(xì)胞；結(jié)合熒光染色，我們認(rèn)為，庭疾灶螽中腸柱狀上皮細(xì)胞的線團(tuán)狀顆粒由微絲包裹。另外庭疾灶螽中腸基膜發(fā)達(dá)，包含微絲蛋白和復(fù)合糖成分。

3.2 馬氏管的結(jié)構(gòu)與功能

在許多昆蟲物種中，馬氏管基部連接到中腸和后腸的交界處，遠(yuǎn)端游離于血腔中，如半翅目長紅錐蝽Rhodniusprolixus，雙翅目黑腹果蠅Drosophilamelanogaster，蛩蠊目的Grylloblattacompodeiformis等(Jarial, 1990; Martinietal., 2007; Gautam and Tapadia, 2014)。庭疾灶螽的馬氏管屬于此類，外圍豐富的微氣管說明馬氏管具有需氧的新陳代謝。但是在鱗翅目、脈翅目和鞘翅目的一些昆蟲中，馬氏管端部伸入直腸，這種馬氏管類型被稱為隱腎系統(tǒng)(Pachecoetal., 2014; Nocellietal., 2016)。

馬氏管的數(shù)量、細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)以及球晶在不同昆蟲群體中可能有很大差異，這些差異被認(rèn)為是重要的，可以用作分類特征。馬氏管的數(shù)量因昆蟲種類不同而異，半翅目有4根馬氏管，鱗翅目有6根馬氏管，蜻蜓目有50～60根馬氏管，直翅目馬氏管數(shù)目可能超過200根(Savageetal., 1956; Jarial, 1990; Pachecoetal., 2014; Amutkanetal., 2015)。庭疾灶螽的馬氏管數(shù)目超過200根，說明其代謝速率遠(yuǎn)高于其他昆蟲。

庭疾灶螽馬氏管腔內(nèi)側(cè)的大量微絨毛增加了細(xì)胞游離面，提升了物質(zhì)傳遞的效率。馬氏管細(xì)胞基部的基底迷路具有大量線粒體，表明物質(zhì)從血淋巴到小管上皮的運(yùn)輸過程需要能量，可能與馬氏管從周圍體液中吸收代謝廢物有關(guān)，類似動(dòng)物腎臟的遠(yuǎn)曲小管。

馬氏管作為排泄器官，細(xì)胞攝取液體、離子和廢物等進(jìn)入馬氏管腔。此外昆蟲對廢物的另一種策略是將其存儲(chǔ)在體內(nèi)而不排出，因?yàn)槟蛩崾遣蝗苡谒?，它可以很容易地存?chǔ)而不會(huì)與其他生理過程起沖突(Klowden, 2013; Nocellietal., 2016)。庭疾灶螽馬氏管細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量顆粒和同心圓球晶體，主要在靠近基底迷路，在微絨毛側(cè)很少見到，馬氏管管腔內(nèi)也看不到同心圓顆粒的存在，推測這些球狀晶體是一種儲(chǔ)存排泄物。對直翅目螽斯科的Leptophyesalbovittata的研究發(fā)現(xiàn)，馬氏管細(xì)胞球狀晶體的化學(xué)成分中含有大量的碳、磷和錳，這些離子是昆蟲發(fā)育和細(xì)胞中正確完成代謝活動(dòng)所必需的，馬氏管在離子的運(yùn)輸和動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控中可能起著重要的作用(Amutkan-Mutlu and Suludere, 2020; Amutkan-Mutluetal., 2021)。廣布于歐洲的駝螽科穴螽Troglophilusneglectus馬氏管細(xì)胞球晶體的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成隨著生命周期而變化，為生命周期的關(guān)鍵過程提供重要礦物質(zhì)；Troglophiluscavicola在滯育期的不同階段馬氏管細(xì)胞的自噬體的豐富度具有差異，且雌性高于雄性(Lipov?eketal., 2009; Lipov?eketal., 2016)。庭疾灶螽馬氏管的球晶體中是否包含代謝活動(dòng)所必需的離子還需要進(jìn)一步研究。

馬氏管外圍的數(shù)層基膜，其作用可能是將氣管和肌肉與馬氏管相連。氣管可以為馬氏管細(xì)胞供氧，馬氏管外圍的肌肉表明馬氏管具有一定的伸縮性，促進(jìn)血淋巴的流動(dòng)，增強(qiáng)代謝。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，庭疾灶螽的中腸和馬氏管的結(jié)構(gòu)與其他直翅目物種基本相似。本研究闡明了庭疾灶螽中腸和馬氏管的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)上與生活環(huán)境、食性的適應(yīng)關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為理解直翅目的進(jìn)化關(guān)系提供了資料。