韓雪瑩，崔 豐，李 雋

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005)

乳腺癌(breast cancer)是全世界女性最常見的惡性腫瘤[1]，其中，三陰性乳腺癌(指雌激素受體，estrogen receptor，ER、孕激素受體，progesterone receptor，PR和人表皮生長(zhǎng)因子受體2 ，human epidermal growth factor receptor 2，HER2均為陰性的乳腺癌)(triple-negative breast cancer, TNBC)是難治療的乳腺癌亞型之一。降低乳腺癌病死亡率的關(guān)鍵是早期診斷和治療[2]，傳統(tǒng)的預(yù)后和預(yù)測(cè)指標(biāo)不能達(dá)到早期診斷的目的[3]。因此需要新的標(biāo)志物來盡早幫助區(qū)分預(yù)后是否良好。乳腺癌缺失因子1(deleted in breast cancer 1, DBC1)是一種核蛋白，因最初被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中發(fā)生8p21區(qū)域的純合子缺失而得名[4]。DBC1參與了DNA損傷修復(fù)(DNA damage repair, DDR)，在DNA損傷時(shí)，DBC1通過抑制SIRT1，促進(jìn)p53乙?；瘡亩T導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。DNA損傷反應(yīng)會(huì)激活DNA損傷修復(fù)途徑[6]，有研究表明DNA損傷修復(fù)蛋白、RecQ家族DNA解旋酶之一的Bloom綜合征蛋白(Bloom’s syndrome helicase, BLM)的突變會(huì)呈現(xiàn)出腫瘤易感性和早衰[7-8]，而且BLM在體內(nèi)和體外能夠結(jié)合p53介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。另有研究表明三陰性乳腺癌細(xì)胞系HCC-70和MDA-MB-231對(duì)黃連素的敏感性不同[10]。因此，本研究將從比較兩種細(xì)胞中的DBC1與BLM的相對(duì)蛋白水平差異入手，探究它們?cè)谌橄侔┘?xì)胞中對(duì)DNA損傷試劑誘導(dǎo)凋亡的敏感性的影響和可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系HCC-70，人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，人胚腎細(xì)胞系HEK-293T (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 試劑和試劑盒:無四環(huán)素的胎牛血清(Gibco公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基(Corning公司)；Annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒(Biolegend公司)；CCK8(北京聚德安泰有限公司)；DBC1抗體、BLM抗體(Bethyl Labotatories公司)；p21抗體(BD Biosciences公司)；GAPDH抗體(Millipore公司)；ML216(MCE公司)；依托泊苷(etoposide,Etop)(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：將HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、1%的青霉素和鏈霉素)，在6孔板中接種細(xì)胞，待細(xì)胞增殖至50%～60%匯合時(shí)，將目的質(zhì)粒1 μg、包裝質(zhì)粒psPAX2 7.5 μg、包膜質(zhì)粒pMD2.G 2.5 μg按Lipofectamine 2000 Reagents說明書加入DMEM中，靜置5 min，加入HEK-293T細(xì)胞中。48 h后收集病毒上清，并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立：將HCC-70細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、1%的青霉素和鏈霉素)，待增殖至50%～60%匯合時(shí)加入病毒上清和8 μg/mL的Polybrene，48 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基并加入2 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株。

1.2.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率：將細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種到96孔板中，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，etoposide(100 μmol/L，48 h)或與ML216(50 μmol/L，48 h)[11]聯(lián)合處理后，將10 μL CCK-8和100 μL PBS加入每個(gè)孔中，在37 ℃，5% CO2下再培養(yǎng)2 h。最后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm的吸光度值以代表細(xì)胞存活率。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收獲etoposide (100 μmol/L，48 h)或與ML216(50 μmol/L，48 h)[11]聯(lián)合處理后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次并細(xì)胞計(jì)數(shù)，1 000 r/min離心5 min，用1×結(jié)合緩沖液將細(xì)胞稀釋成1×106個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸浮液，先后加入annexin Ⅴ和PI工作液各5 μL，混勻后室溫避光孵育15 min后，補(bǔ)加1×結(jié)合緩沖液400 μL后，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測(cè)不同組細(xì)胞中DBC1，BLM，p21蛋白的表達(dá)水平：胰蛋白酶消化etoposide(100 μmol/L，48 h)處理后的各組細(xì)胞，用PBS緩沖液洗1遍，1 000 r/min，5 min離心收獲細(xì)胞。使用Triton-X 100裂解液裂解，冰上孵育30 min，13 500 r/min離心10 min，取蛋白質(zhì)上清于離心管中。然后使用分光光度計(jì)測(cè)595 nm的吸光度值然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。制備相同蛋白質(zhì)量的樣品，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后300 mA轉(zhuǎn)膜1 h。5%的脫脂牛奶封閉10 min，孵育一抗(1∶1 000)過夜。孵育二抗(1∶3 000)1 h后顯影并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MDA-MB-231比HCC-70細(xì)胞對(duì)Etop誘導(dǎo)的凋亡更加敏感

HCC-70細(xì)胞在DNA損傷前后，細(xì)胞存活率的變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而MDA-MB-231細(xì)胞則在DNA損傷后細(xì)胞存活率顯著降低(圖1A)。HCC-70細(xì)胞在DNA損傷后細(xì)胞凋亡水平的變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MDA-MB-231細(xì)胞在DNA損傷后細(xì)胞凋亡水平顯著增加(圖1B，C)(P<0.001)。

2.2 HCC-70和MDA-MB-231中DBC1和BLM的蛋白水平有負(fù)相關(guān)性

分析癌細(xì)胞系百科全書數(shù)據(jù)庫(kù) (Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)中乳腺癌細(xì)胞相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)DBC1與BLM在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖2A)。HCC-70細(xì)胞相比較MDA-MB-231細(xì)胞，DBC1蛋白水平較高，BLM蛋白水平較低。當(dāng)使用Etop誘導(dǎo)DNA損傷后， BLM蛋白水平在兩種細(xì)胞中均減少，但是HCC-70降低的更多；同時(shí)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21蛋白水平均升高，但是在HCC-70細(xì)胞中上升的更加明顯(圖2B)。

2.3 敲低DBC1的HCC-70細(xì)胞的凋亡水平與MDA-MB-231細(xì)胞接近

敲低DBC1的HCC-70細(xì)胞中DBC1水平與MDA-MB-231接近。在Etop誘導(dǎo)DNA損傷后，敲低DBC1的HCC-70中，BLM的蛋白水平上升，p21蛋白水平下降，這些變化均與MDA-MB-231的表現(xiàn)接近(圖3A)。同時(shí)，敲低DBC1使HCC-70的細(xì)胞存活率下降(圖3B)；細(xì)胞凋亡率上升(圖3C，D)；兩個(gè)參數(shù)的測(cè)量結(jié)果均與MDA-MB-231的數(shù)據(jù)接近。

A.CCK-8 kit was used to detect the survival rate of HCC-70 and MD-MB-231 cells treated with Etop; *P<0.001 compared with MDA-MB-231 no treament group; B.HCC-70 and MD-MB-231 cells were treated with Etop, and cells apoptosis rates were detected by annexin V-APC/PI staining,*P<0.001 compared with MDA-MB-231 no treament group; C.relative apoptosis rate was normalized to no treatment

A.Pearson correlation of DBC1 and BLM relative expressions in breast cancer cells (data from CCLE database),r=0.425 0; B.Western blot was used to detect BLM, DBC1 and p21 protein levels in HCC-70 and MDA-MB-231 cells treated with Etop

A.Western blot was used to detect BLM, DBC1 and p21 protein levels in DBC1 knockdown HCC-70 cells and MDA-MB-231 cells treated with Etop; B.CCK-8 kit was used to detect the survival rate of DBC1 knockdown HCC-70 cells and MD-MB-231 cells treated with Etop; **P<0.001 compared with HCC-70 shCtrl Etop group; C.DBC1 knockdown HCC-70 cells and MD-MB-231 cells were treated with Etop, and cells apoptosis was detected by annexin V-APC/PI staining; D.relative apoptosis rate was normalized to no treatment; *P<0.01 compared with HCC-70 shCtrl Etop group

2.4 ML216和Etop的聯(lián)合用藥能夠增加MDA-MB-231的細(xì)胞凋亡

Etop和ML216聯(lián)合用藥后，HCC-70細(xì)胞的存活率和凋亡率與單獨(dú)使用Etop相比沒有明顯變化，而在MDA-MB-231細(xì)胞中聯(lián)合用藥能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞存活率，增加細(xì)胞凋亡水平，敲低DBC1的HCC-70的細(xì)胞存活率和凋亡率的聯(lián)合用藥效果介于HCC-70和MDA-MB-231之間并向后者接近(圖4)。

2.5 三陰性乳腺癌(TNBC)細(xì)胞系中DBC1表達(dá)較高而BLM表達(dá)較低

分析CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中61種乳腺癌細(xì)胞的DBC1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其中6種的DBC1表達(dá)較高，而BLM表達(dá)較低的細(xì)胞均為三陰性乳腺癌類型(圖5)。

A.CCK-8 kit was used to detect the survival rate of DBC1 knockdown HCC-70 cells and MD-MB-231 cells treated with Etop and ML216; *P<0.01 compared with MDA-MB-231 Etop group; B.DBC1 knockdown HCC-70 cells and MD-MB-231 cells were treated with Etop and ML216, and cells apoptosis were detected by annexin V-APC/PI staining; C.the relative apoptosis rate was normalized to no treatment; *P<0.01 compared with MDA-MB-231 Etop group

圖5 DBC1和BLM的負(fù)相關(guān)性在TNBC中表現(xiàn)明顯Fig 5 Negative co-relation of DBC1 and BLM is relatively more prominent in TNBC

3 討論

三陰性乳腺癌(TNBC)是最具侵襲性的乳腺癌類型之一，其特點(diǎn)是快速?gòu)?fù)發(fā)、早期轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良[12]，TNBC的及時(shí)發(fā)現(xiàn)并判斷嚴(yán)重程度對(duì)于治療方案的選擇和效果具有重要意義。有研究表明，聚ADP-核糖聚合酶(PARP)是治療乳腺癌基因1和2(BRCA1/2)缺陷腫瘤細(xì)胞的治療靶點(diǎn)[13]。BRCA和PARP共同參與DNA損傷修復(fù)機(jī)制，兩個(gè)基因的功能同時(shí)喪失導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但是其中之一的突變或缺陷不影響細(xì)胞存活，所以對(duì)于含有BRCA1/2突變的癌細(xì)胞使用PARP抑制劑 (PARPis) 增加了腫瘤殺傷藥物的作用，這種現(xiàn)象稱之為“合成致死效應(yīng)”[14]。本研究中，BLM抑制劑ML216能夠加強(qiáng)etoposide對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷作用，而對(duì)HCC-70細(xì)胞沒有這種作用，其中可能的原因是MDA-MB-231細(xì)胞中BLM蛋白水平相對(duì)較高。BLM是一種DNA損傷修復(fù)蛋白，ML216降低了BLM介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)效率，促使細(xì)胞凋亡增加，因而增加了Etop對(duì)DBC1蛋白水平相對(duì)較高的MDA-MB-231細(xì)胞的敏感性。而在HCC-70細(xì)胞中BLM蛋白水平較低，說明這類癌細(xì)胞可能對(duì)BLM蛋白介導(dǎo)的同源重組DNA損傷修復(fù)途徑的依賴性較低，亦或有其它DNA損傷修復(fù)途徑代償性彌補(bǔ)了BLM的功能缺失。因此，在HCC-70細(xì)胞中ML216沒有對(duì)DNA損傷試劑起到增敏作用。以上研究表明，ML216可能會(huì)為某些乳腺癌類型的治療提供一種“合成致死”聯(lián)合用藥的新選項(xiàng)。

此外，兩種乳腺癌細(xì)胞中DBC1和BLM蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且在61種乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其中6種三陰性乳腺癌細(xì)胞具有較高的DBC1蛋白水平，而BLM蛋白水平表達(dá)較低，說明在三陰性乳腺癌中這兩種蛋白的負(fù)相關(guān)關(guān)系表現(xiàn)的更為明顯。由此推測(cè)，DBC1和BLM蛋白表達(dá)量的比值可能與乳腺癌的惡性度分型有關(guān)，或者能夠成為TNBC診斷的參考指標(biāo)之一。當(dāng)然，要證明這一推斷還需要后期對(duì)大規(guī)模乳腺癌患者基因序列的分析來確認(rèn)。同時(shí)，進(jìn)一步探究DBC1如何負(fù)向調(diào)控BLM表達(dá)水平可能會(huì)為TNBC發(fā)病機(jī)制的研究提供一個(gè)新的角度。