張坤 勘武生 趙勝豪 馬中希 黃梓君 李鯤

(1武漢市第四醫(yī)院，湖北 武漢 430000；2湖北中醫(yī)藥大學(xué))

腰椎間盤退行性病變常伴隨有椎間盤突出癥和(或)退行性腰椎滑脫癥，該病具有高發(fā)病率，且其護(hù)理成本較高〔1，2〕。腰椎間盤在骨骼發(fā)育成熟時易發(fā)生退變的特征解釋了約40%人類腰疼痛病例的病因，雖然疼痛可有效抑制，但有必要探索從根本上解決腰椎間盤退行性病變的新療法〔3〕。miR-147b-5p參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程〔4，5〕，研究顯示〔6〕，miR-147b在人正常和退變的腰椎間盤髓核組織間存在表達(dá)差異，在退變髓核組織中表達(dá)下調(diào)。利用靶基因預(yù)測網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，miR-147b-5p與Notch4存在結(jié)合位點，而Notch信號通路與退變的髓核細(xì)胞關(guān)系密切〔7，8〕。推測miR-147b-5p可能參與了髓核細(xì)胞的退變過程。炎性細(xì)胞因子是椎間盤退變的主要原因之一，通過白介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α可誘導(dǎo)人髓核細(xì)胞(HNPCs)構(gòu)建腰椎間盤退變體外模型〔9〕。本研究通過IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)HNPCs退變模型，觀察miR-147b-5p對HNPCs退變的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑與儀器 細(xì)胞：HNPCs購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。主要試劑：DMEM購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、甲苯胺藍(lán)染色液(1%)、牛血清白蛋白(BSA)封閉液(5%)、Triton X-100、抗熒光淬滅封片液(含DAPI)、噻唑藍(lán)(MTT)溶液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；重組人IL-1β、TNF-α購自美國Pepro Tech公司；兔抗Ⅱ型膠原蛋白(Col Ⅱ)抗體、兔抗Notch4抗體、兔抗Hes5抗體、兔抗Hey1抗體、兔抗Hey2抗體、兔抗GAPDH抗體及二抗購自武漢貝茵萊生物技術(shù)有限公司；Trizol購自美國Ambion公司；SYBR FAST聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) Master Mix購自美國KAPA Biosystems公司；二甲基亞砜購自美國Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；PVDF膜、化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Millipore公司；PCR引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技股份有限公司合成。主要儀器：倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀購自杭州奧盛儀器有限公司；流式細(xì)胞儀購自艾森生物(杭州)有限公司；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將HNPCs從液氮罐中取出，37℃水浴至凍存液完全融化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，393 r/min離心3 min，棄上清。加入1 ml DMEM重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再加入4 ml含10%胎牛血清的DMEM，放置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng)。待80%以上的細(xì)胞匯合時進(jìn)行傳代，按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3髓核細(xì)胞退變模型構(gòu)建〔9〕收集HNPCs，調(diào)整細(xì)胞密度制作單細(xì)胞懸液，并接種于12孔板中，每孔1 ml，約1×105個細(xì)胞/孔，培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對照組和模型組，對照組更換為正常培養(yǎng)基，模型組培養(yǎng)基中加入10 ng/ml IL-1β和25 ng/ml TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行模型鑒定實驗，根據(jù)鑒定結(jié)果篩選合適的誘導(dǎo)時間。

1.4甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白聚糖表達(dá)水平 采用20%的乙醇溶液稀釋獲得0.1%甲苯胺藍(lán)染色液。棄細(xì)胞孔板中的培養(yǎng)液，PBS清洗后，加入1 ml 95%的乙醇溶液固定30 min。PBS清洗2次，加入1 ml甲苯胺藍(lán)染色液染色10 min，PBS清洗2次后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.5免疫熒光染色觀察細(xì)胞Col Ⅱ表達(dá)水平 取出各組細(xì)胞孔板，棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入1 ml 4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS清洗2次，加入1 ml 0.5% Triton X-100室溫通透20 min。PBS清洗2次，加入1 ml 5% BSA封閉液，室溫封閉1 h。棄封閉液，加入Col Ⅱ抗體(1∶200稀釋)，4℃孵育過夜。PBS清洗2次，加入二抗(1∶200稀釋)，37℃孵育1 h。PBS清洗2次，加入300 μl抗熒光淬滅封片液(含DAPI)，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6實時熒光定量(qRT)-PCR檢測細(xì)胞中miR-147b-5p的表達(dá) 分別收集對照組和模型組細(xì)胞約1×106個，Trizol提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃，3 min；95℃，5 s，56℃，10 s，72℃，25 s，共40個循環(huán)。引物序列：miR-147b-5p正義鏈：5′-GGGTGGAAACATTTCTG-3′，反義鏈：5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；U6正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算細(xì)胞中miR-147b-5p的相對表達(dá)量。

1.7miR-147b-5p mimic及inhibitor瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞 收集退變的HNPCs，將其分為模型組、miR-147-5p mimic組、miR-147b-5p inhibitor組、mimic-NC組和inhibitor-NC組。轉(zhuǎn)染前24 h，將5×105個細(xì)胞接種于2 ml培養(yǎng)基中，分布于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取100 pmol miR-147b-5p mimic或inhibitor(或?qū)?yīng)的NC)稀釋于250 μl Opti-MEM中，輕輕混勻。取5 μl Lipofectamine?RNAiMAX稀釋于250 μl Opti-MEM中，輕輕混勻后靜置5 min。將上述2種稀釋液混合，室溫孵育20 min。將混合液滴加于細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕搖晃后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4 h后更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后檢測各組細(xì)胞miR-147b-5p表達(dá)情況，檢測實驗同1.6。

1.8實驗分組及處理 實驗分為對照組、模型組、miR-147-5p mimic組、miR-147b-5p inhibitor組、mimic-NC組和inhibitor-NC組。對照組和模型組細(xì)胞正常培養(yǎng)，miR-147-5p mimic組、miR-147b-5p inhibitor組、mimic-NC組和inhibitor-NC組分別進(jìn)行對應(yīng)的轉(zhuǎn)染實驗，24 h后，除對照組繼續(xù)正常培養(yǎng)外，其他5組均采用10 ng/ml IL-1β和25 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)48 h構(gòu)建髓核細(xì)胞退變模型。

1.9MTT法檢測細(xì)胞活力 收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，分布于96孔板中，每孔100 μl，3×103個細(xì)胞/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁。按照1.8分組處理，轉(zhuǎn)染24 h，誘導(dǎo)48 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜，低速振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測各孔于490 nm處的吸光值。

1.10流式檢測細(xì)胞凋亡 收集各組約1×106個細(xì)胞(分組處理同1.8)，400 r/min離心5 min。棄上清，加入1 ml PBS重懸細(xì)胞沉淀，400 r/min離心5 min。棄上清，加入200 μl PBS重懸，依次加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min。加入300 μl PBS，于流式細(xì)胞儀中檢測各組細(xì)胞凋亡水平。

1.11髓核細(xì)胞退變檢測 收集各組細(xì)胞(分組處理同1.8)，甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白聚糖表達(dá)實驗操作同1.4，免疫熒光染色觀察細(xì)胞Col Ⅱ表達(dá)實驗操作同1.5節(jié)。

1.12Western印跡檢測Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞(分組處理同1.8)，按照每1×106個細(xì)胞加入200 μl裂解液的比例裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，以20 μg蛋白上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉2 h。分別進(jìn)行Notch4、Hes5、Hey1、Hey2及GAPDH抗體(稀釋比均為1∶1 000)孵育，4℃過夜。PBS清洗后，進(jìn)行二抗(1∶20 000稀釋)孵育，室溫1 h。PBS洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，讀取蛋白條帶灰度值計算相對表達(dá)量。

1.13統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1髓核細(xì)胞退變模型鑒定 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果(圖1)顯示，對照組正常髓核細(xì)胞多為類圓形或多角形，排列緊密，呈典型的集落樣生長，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白聚糖被染成藍(lán)色，細(xì)胞核呈圓形且深染；模型組細(xì)胞腫脹，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)紡錘形，細(xì)胞質(zhì)染色淡且不均勻，細(xì)胞核呈不規(guī)則形，符合髓核細(xì)胞退變時蛋白聚糖減少的特征。免疫熒光染色結(jié)果(圖2)顯示，對照組正常髓核細(xì)胞綠色熒光顆粒明顯多于模型組，且細(xì)胞核染色更深，即退變髓核細(xì)胞中Col Ⅱ表達(dá)明顯減少。由于48 h兩組細(xì)胞間蛋白聚糖和Col Ⅱ表達(dá)差異比24 h的效果更好，因此本研究構(gòu)建髓核細(xì)胞退變模型采用10 ng/ml IL-1β和25 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)48 h。

圖1 甲苯胺藍(lán)染色觀察HNPCs蛋白聚糖表達(dá)(×200)

圖2 免疫熒光染色觀察HNPCs Col Ⅱ表達(dá)(×200)

2.2髓核細(xì)胞中miR-147b-5p表達(dá)水平比較 與對照組(1.001±0.067)比較，模型組細(xì)胞中miR-147b-5p表達(dá)水平(0.320±0.05)明顯降低(P<0.05)。說明髓核細(xì)胞退變時miR-147b-5p表達(dá)下調(diào)。

2.3轉(zhuǎn)染效率檢測 與模型組(1.003±0.094)比較，miR-147b-5p mimic組細(xì)胞中miR-147b-5p表達(dá)水平(3.005±0.106)顯著上調(diào)，而miR-147b-5p inhibitor組(0.312±0.035)顯著下調(diào)(均P<0.05);mimic-NC組和inhibitor-NC組(0.943±0.219、0.886±0.064)均無明顯差異(P>0.05)，證明本研究成功獲得miR-147b-5p表達(dá)上調(diào)(或下調(diào))的退變髓核細(xì)胞。

2.4miR-147b-5p對退變髓核細(xì)胞活力的影響 MTT檢測各組HNPCs活力(OD值)，與對照組(0.686±0.011)比較，模型組細(xì)胞活力(0.630±0.004)顯著減弱(P<0.05)；與模型組比較，miR-147b-5p mimic組細(xì)胞活力(0.664±0.012)顯著增強，而miR-1476-5p inhibitor組細(xì)胞活力(0.602±0.008)顯著減弱(P<0.05)，mimic-NC組、inhibitor-NC組細(xì)胞活力(0.625±0.013、0.631±0.018)均無顯著差異(P>0.05)。

2.5miR-147b-5p對退變髓核細(xì)胞凋亡的影響 流式檢測各組HNPCs凋亡率，與對照組〔(5.337±0.577)%〕比較，模型組細(xì)胞凋亡率〔(7.423±0.267)%〕顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，miR-147b-5p mimic組細(xì)胞凋亡率〔(5.017±0.548)%〕顯著降低，miR-1476-5p inhibitor組細(xì)胞凋亡率〔(11.223±0.540)%〕顯著升高(P<0.05)；mimic-NC組及inhibitor-NC組〔(7.697±0.410)%、(8.030±0.046)%〕均無顯著差異(均P>0.05)。見圖3。

圖3 流式檢測每組HNPCs凋亡

2.6miR-147b-5p對退變髓核細(xì)胞蛋白聚糖及Col Ⅱ表達(dá)的影響 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果及免疫熒光染色結(jié)果顯示，模型組HNPCs中蛋白聚糖及Col Ⅱ表達(dá)明顯少于對照組；與模型組相比，miR-147b-5p mimic組HNPCs中蛋白聚糖及Col Ⅱ表達(dá)明顯增多，miR-147b-5p inhibitor組及inhibitor-NC組均明顯減少。見圖4、5。

圖4 甲苯胺藍(lán)染色觀察各組HNPCs中蛋白聚糖的表達(dá)(×200)

圖5 免疫熒光染色觀察各組HNPCs Col Ⅱ表達(dá)(×200)

2.7miR-147b-5p對退變髓核細(xì)胞中Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞中Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，miR-147b-5p mimic組Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01)，而miR-147b-5p inhibitor組各蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.01)。見表1、圖6。

表1 HNPCs中Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白相對內(nèi)參GAPDH蛋白的表達(dá)

1～6：對照組、模型組、miR-147b-5p mimic組、miR-147b-5p inhibitor組、mimic-NC組、inhibitor-NC組圖6 Western印跡檢測HNPCs中Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表達(dá)

3 討 論

腰痛是一種常見的骨科疾病，研究證實椎間盤退變是引起腰痛的主要原因之一〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變過程涉及椎間盤結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞數(shù)量及組成發(fā)生改變等〔11〕。髓核的結(jié)構(gòu)和生化成分發(fā)生改變，蛋白聚糖、水分含量的下降致使椎間盤承載能力降低，膠原成分的改變及含量下降導(dǎo)致其彈性逐漸喪失，即為椎間盤髓核退變的過程〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中蛋白聚糖及Col Ⅱ表達(dá)均降低，符合髓核細(xì)胞退變的病理特征〔13，14〕，即本研究成功誘導(dǎo)了髓核細(xì)胞退變模型。目前，針對椎間盤退變的治療方法仍以保守治療和手術(shù)治療為主，可緩解癥狀，然而并未對椎間盤退變進(jìn)行病因治療〔12〕。對退變的髓核細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)再生修復(fù)方案，如基因治療、細(xì)胞治療、生長因子注射治療等〔15〕，將為椎間盤退變的治療提供更多可能。miRNA通過靶向mRNA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與了多種病理生理過程，包括退行性肌肉骨骼病理〔16〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔17〕，miR-202-5p在退行性髓核細(xì)胞中低表達(dá)，抑制miR-202-5p表達(dá)可增加自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)退變髓核細(xì)胞的自噬及凋亡。Chen等〔18〕也認(rèn)為椎間盤退行性病變與miRNA的調(diào)節(jié)異常有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)miR-24-3p在退行性髓核細(xì)胞中表達(dá)水平升高，且其表達(dá)與椎間盤退變的程度呈正相關(guān)，可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡。

Notch信號通路是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括4個家族成員(Notch1，2，3，4)，調(diào)節(jié)多種致病過程，其調(diào)控作用對骨骼發(fā)育代謝具有重大的意義，同時，Notch信號通路在退變髓核細(xì)胞的修復(fù)重建中也扮演著重要角色〔7〕。當(dāng)促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)髓核細(xì)胞退變時，髓核細(xì)胞發(fā)生代償機(jī)制，Notch信號通路被激活促進(jìn)細(xì)胞增殖從而補償退變喪失的細(xì)胞數(shù)量〔8〕。但也有研究發(fā)現(xiàn)抑制Notch1基因的表達(dá)可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為髓核樣細(xì)胞中蛋白聚糖及Col Ⅱ的表達(dá)，認(rèn)為對Notch1基因表達(dá)進(jìn)行抑制可提高椎間盤髓核細(xì)胞的生物活性〔19〕。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)退變髓核細(xì)胞中miR-147b-5p表達(dá)，可抑制Notch4及其靶基因Hes5、Hey1和Hey2〔20〕表達(dá)。結(jié)合本次研究結(jié)果及上述研究，可推測炎性細(xì)胞因子引起的Notch信號通路激活在退變髓核細(xì)胞中的代償機(jī)制具有一定的限度，也可能是由于miR-147b-5p并不是通過Notch信號通路維持退變髓核細(xì)胞的數(shù)量及生物活性。

綜上，miR-147b-5p在退變髓核細(xì)胞中表達(dá)降低，增加其表達(dá)水平可恢復(fù)退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)活性，但其具體作用機(jī)制是否與Notch信號通路相關(guān)還有待進(jìn)一步驗證。