胡 琳，趙安鵬,秦寧寧，馬江紅，申亦可，謝 華, 李文斌，王 榮,

(1. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院藥劑科, 甘肅 蘭州 730050)

丙戊酸鈉是目前癲癇治療的一線推薦藥物，對(duì)各種類型癲癇有效，應(yīng)用廣泛，但是其治療窗窄，近期發(fā)現(xiàn)對(duì)血液系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一些不良反應(yīng)，例如高血氨癥和認(rèn)知功能障礙等[1]。臨床上通過(guò)治療藥物監(jiān)測(cè)尋找最佳用藥劑量，使患者的血藥濃度處于治療窗內(nèi)，從而間接控制藥物入靶器官即大腦的藥物濃度。中樞神經(jīng)藥物需通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織發(fā)揮藥效。狹義的血腦屏障 (blood brain barrier，BBB)[2]是指將中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周循環(huán)系統(tǒng)分開(kāi)的由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、基底膜以及與附在內(nèi)皮細(xì)胞的周細(xì)胞和神經(jīng)元組成多細(xì)胞血管結(jié)構(gòu)，它通過(guò)調(diào)節(jié)外周與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的分子交換來(lái)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)血腦屏障對(duì)藥物的通透性發(fā)生改變時(shí)，治療藥物監(jiān)測(cè)獲得的血藥濃度則可能無(wú)法正確反映腦內(nèi)藥物濃度，對(duì)藥物治療的安全性、有效性帶來(lái)潛在的危害[3]。Dagan等[4]研究表明，簡(jiǎn)單地使用血藥濃度作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中藥物濃度的替代標(biāo)志物可能會(huì)導(dǎo)致劑量不足。藥物透過(guò)血腦屏障的程度除取決于藥物自身的性質(zhì)外，血腦屏障完整程度及血腦屏障中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量與功能也是重要的因素[5]。課題組前期研究表明，高原低氧會(huì)不同程度改變血腦屏障中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[6-7]。丙戊酸鈉作為BBB中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)外排泵P-gp的底物[8]，在高原低氧環(huán)境下，其血腦透過(guò)率是否會(huì)發(fā)生改變？本研究對(duì)高原低氧環(huán)境下丙戊酸鈉的血藥濃度及入腦丙藥物濃度進(jìn)行分析，并研究缺氧對(duì)血腦屏障上藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp表達(dá)的影響，旨為高原丙戊酸鈉合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑丙戊酸鈉對(duì)照品(批號(hào)100963-202004)、替米沙坦對(duì)照品(批號(hào)100629-200401)和丙戊酸鈉(批號(hào)Y18J7C16394)分別購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院和上海源葉生物技術(shù)有限公司；色譜純乙腈(批號(hào)JA107230)購(gòu)自德國(guó)MERCK公司；乙酸銨(批號(hào)H2110077)、伊文斯藍(lán)(批號(hào)1922129)購(gòu)自aladdin；葡聚糖(70 ku，批號(hào)C1755925)購(gòu)自Merck millipore；細(xì)胞濾網(wǎng)(40 μm、100 μm)購(gòu)自biosharp；山羊抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Anti-P Glycoprotein antibody (ab170904)和Anti-Atp1a1 antibody (ab76020) 購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 主要儀器UFLC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；API3200三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Spectra Max i3酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecula公司)；蛋白免疫印跡電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)；Chemi DOCTMMP Imaging System(美國(guó)BIO-RAD公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂昆明小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘭州聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且實(shí)驗(yàn)均按照相關(guān)指導(dǎo)原則和規(guī)定進(jìn)行，審批編號(hào)：2021KYLL190。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及急進(jìn)方式將♂昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(甘肅蘭州，海拔1 500 m)和高原低氧組(青海玉樹(shù)巴塘，海拔4 010 m)。對(duì)照組小鼠(分為P1、 P2、P3、P4，共4組)在蘭州禁食12 h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)；高原低氧組小鼠(分為H1、H2、H3、H4，共4組)航空及公路托運(yùn)至青海玉樹(shù)巴塘，禁食12 h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。其中P1、H1組用于灌胃給藥，P2、H2組用于靜脈注射給藥，P3、H3組提取血腦屏障，P4組、H4組用于評(píng)價(jià)血腦屏障通透性。

2.2 樣品收集P1組和H1組小鼠(每組36只)灌胃給予 (i.g.) 136.5 mg·kg-1的丙戊酸鈉(小鼠給藥劑量由人體給藥劑量15 mg·kg-1通過(guò)體表面積換算獲得)，并于給藥第5、10、30、60、120、240 min時(shí)分別取6只小鼠取血，兩組共72只；P2組和H2組小鼠(每組60只)尾靜脈注射 (i.v.) 相同劑量的丙戊酸鈉，給藥后第2、5、30、60、120、240 min時(shí)分別取10只小鼠取血，兩組共120只，1 000×g離心5 min，取上層血漿-80 ℃保存。上述小鼠取血后立即處死，取大腦并用生理鹽水洗凈，-80℃保存。

2.3 色譜質(zhì)譜條件Gemini C18 (3.0 mm×75 mm, 3.0 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨溶液 (85 ∶15,V/V)；柱溫：25 ℃，流速：0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量：2 μL，分析時(shí)間為3 min。在ESI源負(fù)離子電離方式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (MRM)有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：噴霧電壓 (IS)為-4 500 V，霧化溫度 (TEM)為400 ℃，丙戊酸鈉和替米沙坦碰撞誘導(dǎo)解離電壓 (DP)分別為-30 psi、-15 psi，碰撞能量 (CE)為-5 psi、-19 psi。丙戊酸鈉、替米沙坦檢測(cè)離子分別為m/z 142.6→142.6、m/z 513.2→469.2。

2.4 生物樣品處理方法準(zhǔn)確吸取血漿樣品10 μL置于0.5 mL的EP管中，加入40 μL大鼠空白血漿，再加入200 μL的5 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋震蕩30 s，4 500×g離心10 min后取上清于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量2 μL。取備用腦組織，稱取0.1 g腦皮層于2 mL的EP管中，加1.0 mL生理鹽水勻漿，取25 μL勻漿液再加入175 μL的5 mg·L-1內(nèi)標(biāo)對(duì)照品工作溶液，渦旋震蕩30 s，4 500×g離心10 min后取上清液進(jìn)樣。

2.5 血腦屏障提取P3組和H3組(每組10只)小鼠處死后，立即取出大腦。大腦在冰冷的Hank’s溶液中剝?nèi)ボ浤X膜，再去除大血管和髓質(zhì)。剩余組織在Hank’s溶液使用玻璃勻漿器上下勻漿6次，勻漿液于1 000×g離心10 min。沉淀重懸于15 mL 18%葡聚糖中，然后在4 500×g離心15 min。沉淀重懸于Hank’s溶液，懸浮液先后用100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)和40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾。隨后用含有2%蛋白酶抑制劑的Hank’s溶液收集濾網(wǎng)上的腦微血管，4 500×g離心15 min后收集的沉淀即為腦微血管[9]。采用膜提取試劑盒提取腦微血管的膜蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白總量。

2.6 血腦屏障通透性評(píng)價(jià)P4組和H4組小鼠(每組6只)尾靜脈注射 (i.v.)2%伊文斯藍(lán)溶液 (2 mL·kg-1),循環(huán)45 min后迅速取出全腦用濾紙吸凈。右半球腦組織在3 mL甲酰胺中剪碎后，60 ℃水浴孵育24 h，4 500×g離心5 min。在610 nm處，測(cè)量伊文思藍(lán)含量。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，結(jié)果表示為(μg伊文思藍(lán)染色)/(g組織)。

2.7 P-gp蛋白的定量通過(guò)7%SDS-PAGE分離蛋白樣品，并在恒定電壓80 V下轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗anti-P-gp antibody, anti-ATP1a1 antibody 4 ℃過(guò)夜孵育。隨后用TBST洗4次后，室溫孵育二抗后，PVDF膜用TBST洗4次后，進(jìn)行曝光。

2.8 數(shù)據(jù)處理腦/血藥物濃度比值=腦組織藥物濃度(μg·g-1) /血漿藥物濃度(mg·L-1)，即K(brain/plasma)=C (brain)/C (plasma)[10]；曝光圖片通過(guò)ImageJ軟件分析目的蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 方法驗(yàn)證

3.1.1專屬性 取空白血漿、空白腦組織、空白血漿加丙戊酸鈉、空白腦組織加丙戊酸鈉及給藥后的小鼠生物樣品，按照“1.4.2”方法處理進(jìn)樣,丙戊酸及內(nèi)標(biāo)替米沙坦的典型色譜圖見(jiàn)Fig 1，從圖可知該方法對(duì)丙戊酸鈉和內(nèi)標(biāo)替米沙坦的專屬性良好，腦組織及血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾色譜分析，滿足定量要求。

Fig 1 Chromatograms of sodium valproate in biological samplesA，B: Blank plasma and blank brain, C，D: Blank plasma and blank brain spiked with standard sodium valproate, E-F: Sample of plasma and brain, Blue: Sodium valproate; Red: IS.

3.1.2線性范圍 丙戊酸在血漿和腦組織中線性范圍為0.05～100 mg·L-1，得到的線性回歸方程為:Y=0.001 51X+4.49(r=0.997 4)；Y=0.013 1X+0.598 6(r=0.999 6)，結(jié)果表明待測(cè)物在設(shè)定濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。

3.1.3精密度與準(zhǔn)確度 結(jié)果見(jiàn)Tab 1，丙戊酸鈉的日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度均滿足生物樣品測(cè)定要求。

Tab 1 Accuracy and precision of sodium

3.1.4基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 丙戊酸鈉滿足定量要求，并且不存在明顯的生物樣品基質(zhì)效應(yīng)。

3.1.5穩(wěn)定性 丙戊酸鈉生物樣品在4 ℃保存24 h、3次反復(fù)凍融、-80 ℃保存一個(gè)月的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：在不同條件處理后，丙戊酸鈉生物樣品中濃度變化≤8.87%，表明具有良好的穩(wěn)定性。

3.2 生物樣品中藥物濃度的測(cè)定結(jié)果

3.2.1灌胃給藥的樣品藥物濃度 小鼠灌胃給藥丙戊酸鈉后，第5、10、30、60、120、240 min時(shí)血漿及腦組織中丙戊酸鈉分布見(jiàn)Fig 2。與對(duì)照組相比，給藥第30、60 min時(shí)高原組血藥濃度分別降低了35.77%、33.7%；高原組腦組織中藥物濃度高于對(duì)照組，其中給藥第60、120 min時(shí)高原腦組織藥物濃度分別升高了148.3%、172.0%；高原組腦/血藥物濃度比值在第10、30、60、120 min時(shí)分別增加44.0%、57.9%、176.8%、184.5%。

Fig 2 Concentrations and brain/plasma ratio of 136.5 mg·kg-1 sodium valproate in mice by intragastric administration(n=6)A: Plasma, B: Brain,C: Brain/blood ratio *P<0.05,**P<0.01 vs P1

3.2.2尾靜脈注射給藥的樣品藥物濃度 小鼠尾靜脈注射丙戊酸鈉第2、5、30、60、120、240 min時(shí)，血漿及腦組織中丙戊酸鈉藥物濃度見(jiàn)下Fig 3。由圖可知，與對(duì)照組相比，當(dāng)血藥濃度值相差不大時(shí)，高原組腦皮層中藥物濃度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，且在第60 min時(shí)濃度增大27.4%，在第120 min時(shí)增大62.4%，在第240 min時(shí)增大45.8%。與對(duì)照組相比，高原組腦/血藥物濃度比值在第60、120、240 min時(shí)分別增加了33.9%、50.6%、125.6%。

Fig 3 Concentrations and brain/plasma ratio of 136.5 mg·kg-1 sodium valproate in mice injected intravenously administration(n=6)A: Plasma, B: Brain,C: Brain/plasma ratio *P<0.05,**P<0.01 vs P2

3.3 血腦屏障完整性評(píng)價(jià)對(duì)照組與高原組小鼠腦組織中伊文斯藍(lán)含量分別 (3.65±0.88) μg·g-1和 (3.67±0.76) μg·g-1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明血腦屏障的完整性無(wú)明顯改變。

3.4 高原低氧對(duì)小鼠血腦屏障中P-gp表達(dá)的影響通過(guò)Western blot對(duì)腦微血管段中ABC族藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp進(jìn)行定量，在分子量為170 ku處檢測(cè)到特異性條帶。如Fig 4，與對(duì)照組相比，高原組P-gp蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降了58.5% (P<0.05)。

Fig 4 Influence of altitude hypoxia environment (4010 m ) on P-gp protein expression level in blood brain barrier *P<0.05 vs P3

4 討論

癲癇患者不能被徹底治愈，需終身用藥。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期或高劑量服用丙戊酸鈉的患者會(huì)發(fā)生一系列不良反應(yīng)，例如神經(jīng)毒性[1]。高原低氧環(huán)境會(huì)不同程度改變血腦屏障中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，所以研究高原低氧對(duì)丙戊酸鈉入腦的影響十分必要。本研究通過(guò)灌胃和注射兩種給藥方式研究高原低氧對(duì)丙戊酸鈉的血腦屏障透過(guò)率的影響。結(jié)果表明，丙戊酸在高原組的血腦屏障透過(guò)率均高于對(duì)照組。除藥物自身性質(zhì)外，血腦屏障完整程度及血腦屏障中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量與功能也是影響藥物血腦屏障透過(guò)率的重要因素。

在研究高原低氧對(duì)丙戊酸鈉腦組織分布影響之前，我們首先使用伊文斯藍(lán)對(duì)血腦屏障進(jìn)行完整性評(píng)價(jià)。伊文斯藍(lán)可與白蛋白(血漿中分子量最小的蛋白之一)形成復(fù)合體，若血腦屏障完整性受到破壞，復(fù)合體會(huì)遷移到腦組織中。根據(jù)腦組織中伊文斯藍(lán)的含量可判斷血腦屏障的完整性。伊文斯藍(lán)結(jié)果表明，高原組與對(duì)照組腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量無(wú)顯著性差異，表明本研究所采用的高原低氧條件對(duì)小鼠的血腦屏障完整性無(wú)明顯影響，這與前期課題組結(jié)果相同[11]。許多耐藥性癲癇患者對(duì)多種抗癲癇藥表現(xiàn)出耐藥性，這些患者血藥濃度在有效范圍值內(nèi)時(shí)，卻沒(méi)有達(dá)到抗癲癇效果[12]，研究發(fā)現(xiàn)這可能是由于腦區(qū)域中P-gp和其他外排轉(zhuǎn)運(yùn)體高表達(dá)的原因。P-糖蛋白 (P-gp)是一種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在小鼠腦微血管管腔表面表達(dá)，其可將進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞的部分底物藥物再次排向血液(即管腔側(cè))，從而減少藥物向腦組織的分布，研究表明減少BBB處P-gp的表達(dá)或抑制其功能會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)藥物濃度增加[13]。大多數(shù)抗癲癇藥是P-gp的底物。通過(guò)對(duì)所提取的小鼠腦微血管的P-gp進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)，高原低氧環(huán)境下小鼠腦微血管的P-gp表達(dá)量下降，這可能是高原組丙戊酸鈉腦血透過(guò)率高于對(duì)照組的原因。因?yàn)镻-gp是外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其低表達(dá)量可能會(huì)使腦內(nèi)丙戊酸鈉外排減少。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)高原低氧環(huán)境增加了丙戊酸在小鼠血腦屏障上的透過(guò)程度，從而改變了丙戊酸在小鼠體內(nèi)的腦血分布，這可能與高原低氧環(huán)境下調(diào)了小鼠腦微血管上P-gp的表達(dá)量有關(guān)，這為高原癲癇患者合理用藥提供依據(jù)。