陳鑫棟，仲威龍，閆佩瑤，匡佳妮，喬鍇亮，孫 濤，黃 飚，秦 源

(1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018；2. 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，天津市消化疾病研究所，天津市消化病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300052；3. 南開(kāi)大學(xué)藥學(xué)院，藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350)

肝纖維化是一種肝臟的慢性疾病，晚期肝纖維化會(huì)發(fā)展為肝硬化與肝功能衰竭，全球每年有超過(guò)100萬(wàn)人死于肝纖維化導(dǎo)致的終末期肝病[1]。目前，針對(duì)肝纖維化的主要治療思路包括：肝臟保護(hù)、抑制肝星狀細(xì)胞活性和調(diào)節(jié)免疫。盡管針對(duì)肝纖維化的藥物研究眾多，但目前臨床上缺乏治療肝纖維化的特異藥物，尚無(wú)FDA批準(zhǔn)的專(zhuān)門(mén)治療肝纖維化的藥物上市[2]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-nesenchymal transition，EMT)是指具有上皮屬性的細(xì)胞因某些因素的作用，導(dǎo)致細(xì)胞去極性，轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)屬性細(xì)胞的過(guò)程。眾多研究顯示，EMT在肝纖維化形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，抑制肝星狀細(xì)胞的EMT可以有效治療肝纖維化[3]。

黃酮類(lèi)小分子是兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過(guò)中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其廣泛存在于各種植物之中。多種黃酮分子具有保肝、護(hù)肝，抑制肝纖維化的作用[4-5]。目前，黃酮類(lèi)分子水飛薊賓常在臨床上作為保肝藥物使用，也用于治療肝纖維化[6]。芹菜素也是一種典型的黃酮分子，其廣泛存在于各種蔬菜水果中，具有抗炎、抗癌等廣泛作用[7-8]。本團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)[9]，芹菜素可以通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞EMT，發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用。但芹菜素對(duì)肝纖維化的治療作用和機(jī)制尚未有報(bào)道。由于芹菜素在日常的水果、蔬菜中含量豐富，其新的藥理機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，不僅有助于新型保肝、抗肝纖維化藥物的研發(fā)，也有助于指導(dǎo)人們通過(guò)日常飲食，預(yù)防肝病的發(fā)生。本研究將對(duì)芹菜素治療肝纖維化的藥效和藥理機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物芹菜素、水飛薊賓單體購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，CCl4及其他相關(guān)生化試劑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司(貨號(hào)：D0819)，RNA抽提試劑盒(貨號(hào)：R0026)、qRT-PCR試劑盒(貨號(hào)：D7268M)購(gòu)自碧云天生物有限公司。用DMSO將芹菜素配制20 g·L-1母液，用生理鹽水稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。醫(yī)用級(jí)玉米油購(gòu)自西安晉湘藥用輔料有限公司(貨號(hào)：456)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(貨號(hào)：C009-2-1)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)(貨號(hào)：C010-2-1)、白蛋白(ALB)(貨號(hào)：A028-2-1)及總蛋白(TP)(貨號(hào)：A045-2-2)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)健康昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)碼：0039483。磷酸化AKT(p-AKT S473，貨號(hào)：ab81283)、磷酸化PDK1(p-PDK1 S241，貨號(hào)：ab131098)蛋白抗體及免疫組化二抗(貨號(hào)：ab99697)均購(gòu)于Abcam公司。

1.2 模型建立與給藥治療將60只小鼠置于SPF屏障環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用區(qū)間分組法將小鼠隨機(jī)分組：所有小鼠稱(chēng)取體質(zhì)量后按大小排列編號(hào)，按序號(hào)依次分成10個(gè)區(qū)，隨機(jī)從每個(gè)區(qū)中取一只小鼠形成一個(gè)組，分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照水飛薊賓組(Silibinin組)、芹菜素低劑量組(Apigenin-L組)、芹菜素中劑量組(Apigenin-M組)、芹菜素高劑量組(Apigenin-H組)，每組10只。建模方案綜合參考了先前的研究并做了適當(dāng)調(diào)整[10-12]：對(duì)照組小鼠每只每次背部皮下注射玉米油2 mL·kg-1；其余各組小鼠每只每次背部皮下注射含50% CCl4的玉米油混懸液2 mL·kg-1，每隔3 d注射一次，持續(xù)12周，建模及給藥方法如Fig 1A所示。

于實(shí)驗(yàn)第3周開(kāi)始給予小鼠藥物治療10周，Silibinin組55 mg·kg-1·d-1、Apigenin-L組15 mg·kg-1·d-1、Apigenin-M組30 mg·kg-1·d-1、Apigenin-H組60 mg·kg-1·d-1，對(duì)照組和模型組給予相同體積的生理鹽水，灌胃給藥。期間觀察小鼠體重、運(yùn)動(dòng)、飲食及毛發(fā)等情況。(芹菜素與水飛薊賓同為黃酮類(lèi)物質(zhì)，結(jié)構(gòu)相似，Silibinin組與Apigenin-M組給藥的摩爾量一致)。

1.3 肝臟大體形態(tài)記錄及肝臟系數(shù)統(tǒng)計(jì)給藥結(jié)束后，所有小鼠稱(chēng)重，并進(jìn)行解剖取出肝臟，體式顯微鏡記錄各組小鼠肝組織大體形態(tài)并進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算各組肝臟系數(shù)，根據(jù)對(duì)照組計(jì)算相對(duì)值，肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.4 肝功能指標(biāo)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠摘除眼球取血，室溫靜置30 min，低溫離心，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行各組小鼠血清ALT、AST、ALB及TP含量測(cè)定。

1.5 肝組織的病理學(xué)檢測(cè)及免疫組化將肝組織進(jìn)行固定和脫水后制作成石蠟組織切片，一部分切片使用蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色評(píng)價(jià)各組肝組織的形態(tài)學(xué)變化及膠原纖維含量的變化。另一部分切片分別使用磷酸化AKT抗體和磷酸化PDK1抗體及相應(yīng)免疫組化二抗孵育，DAB顯色。病理切片評(píng)分規(guī)則：染色強(qiáng)度評(píng)分按照無(wú)染色、淺棕黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)0、1、2、3分；染色面積評(píng)分按照1%～25%、25%～50%、50%～75%、>75%分別計(jì)1、2、3、4分；總評(píng)分為二者的乘積。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)EMT標(biāo)志物基因表達(dá)水平取各組小鼠新鮮肝臟組織20 mg，液氮中研磨裂解，提取RNA并進(jìn)行qRT-PCR，分別檢測(cè)E-cadherin基因CDH1、Vimentin基因Vim的mRNA水平。相關(guān)引物序列如下：CDH1上游引物序列為5′-TCATGAGTGTCCCCCGGTAT-3′，下游引物序列為5′-TCTTGAAGCGATTGCCCCAT-3′；Vim上游引物序列為5′-GGACCAGCTAACCAACGACA-3′，下游引物序列為5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′。

1.7 Western blot檢測(cè)小鼠肝臟組織中蛋白表達(dá)取適量肝臟組織充分裂解并收取總蛋白，利用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜進(jìn)行封閉。使用相應(yīng)抗體和二抗進(jìn)行孵育，顯影拍照記錄并計(jì)算灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠生活狀態(tài)、恢復(fù)小鼠體質(zhì)量建模期間對(duì)小鼠的一般生活狀態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠反應(yīng)靈敏，食欲較好，皮毛順滑有光澤；模型組小鼠反應(yīng)遲鈍，萎靡不振，食欲較差，皮毛雜亂無(wú)光澤；芹菜素低、中、高各劑量組及水飛薊賓組小鼠反應(yīng)速度、食欲及毛發(fā)色澤均較模型組有所好轉(zhuǎn)，且芹菜素的藥效具有量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)監(jiān)測(cè)各組小鼠的體質(zhì)量變化，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量平緩上升，建模各組小鼠隨建模時(shí)間波動(dòng)變化、整體上升，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠體質(zhì)量平均值由大到小依次為：對(duì)照組、芹菜素高劑量組、芹菜素中劑量組、水飛薊賓組、芹菜素低劑量組和模型組。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的體質(zhì)量明顯降低；與模型組相比，給藥的4組小鼠體質(zhì)量明顯升高；H組小鼠的體質(zhì)量改善明顯好于S組(Fig 1B)。

Fig 1 Modeling drug administration profile and body weight change of miceA：Model establishment and administration of mice in each group; B：The trend of body weight in each group.

2.2 芹菜素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟形態(tài)、肝系數(shù)及肝功能的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)束解剖小鼠，將肝臟置于體視顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟顏色變淺變暗，表面粗糙有小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較韌，體積縮小。水飛薊賓和芹菜素均可以緩解模型小鼠肝臟病變，芹菜素的藥效具有量效關(guān)系且高劑量組效果好于水飛薊賓組(Fig 2A)。統(tǒng)計(jì)各組小鼠的肝系數(shù)并根據(jù)對(duì)照組計(jì)算相對(duì)值，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝系數(shù)明顯高于對(duì)照組，水飛薊賓、芹菜素中劑量和高劑量組均可以明顯降低肝纖維化小鼠的肝系數(shù)，且高劑量芹菜素的效果好于水飛薊賓組(Fig 2B)。分別測(cè)定各組小鼠血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)ALT、AST、ALB及TP的含量，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST水平升高，ALB、TP水平降低，顯示模型組建模成功；與模型組相比，芹菜素組和水飛薊賓組小鼠血清中ALT、AST水平降低，ALB、TP水平升高(Fig 2C)。

Fig 2 Morphology and liver coefficient levels of mouse liverA：Representative pictures of liver gross morphology in each group; B：Relative liver coefficient levels of mice in each 1：Control; 2:Model; 3:Silibinin; 4:Apigeniu-L; 5:Apigenin-M; 6:Apigenin-H. ##P<0.01 vs Control group；*P<0.05, **P<0.01 vs Model group；△△P<0.01 vs Silibinin group.

2.3 芹菜素降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟組織病理?yè)p傷利用HE染色和Masson染色觀察小鼠肝組織病理學(xué)改變。對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞呈放射狀排列，中央靜脈清晰，無(wú)壞死、炎癥及纖維化發(fā)生，病理學(xué)評(píng)分最低；模型組小鼠肝細(xì)胞小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝板排列紊亂，呈彌漫性改變。肝間質(zhì)可見(jiàn)明顯的脂肪變性、壞死，膠原沉積明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肝纖維化程度明顯高于其他各組，病理學(xué)評(píng)分最高；與模型組相比，4個(gè)給藥組小鼠肝臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)病變均有明顯改善，假小葉較少，膠原沉積和炎細(xì)胞浸潤(rùn)較少，病理學(xué)評(píng)分均低于模型組，且芹菜素給藥組的病理學(xué)評(píng)分隨劑量升高而降低，其中中劑量和高劑量芹菜素給藥組病理學(xué)評(píng)分顯著低于模型組(Fig 3A-D)。

Fig 3 Pathological lesion staining of mouse A-B：Representative images of HE staining in liver tissue sections and statistics of pathological score; C-D：Representative images of Masson staining and pathological score statistics of liver tissue sections. 1：Control; 2:Model; 3:Silibinin; 4:Apigeniu-L; 5:Apigenin-M; 6:Apigenin-H. ##P<0.01 vs Control group；*P<0.05， **P<0.01 vs Model group.

2.4 芹菜素抑制肝細(xì)胞EMT前期研究顯示，芹菜素可以抑制肝癌細(xì)胞EMT，從而發(fā)揮抗癌作用。本研究利用各組小鼠肝臟組織進(jìn)行qRT-PCR，分別檢測(cè)了EMT標(biāo)志物E-cadherin和Vimentin蛋白的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中上皮表型標(biāo)志物E-cadherin基因CDH1表達(dá)水平明顯降低、間充質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin基因Vim表達(dá)水平明顯上高。芹菜素可以顯著抑制模型鼠肝臟細(xì)胞EMT，提高E-cadherin表達(dá)水平、降低Vimentin表達(dá)水平，且中、高劑量具有量效關(guān)系，結(jié)果如Fig 4A和4B所示。利用Western blot對(duì)各組小鼠肝臟組織中E-cadherin和Vimentin蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與qRT-PCR相似(Fig 4C)。

Fig 4 Effect of apigenin on EMT-related markers and signaling pathways in mouse A：Relative gene expression of E-cadherin; B：Relative gene expression of Vimentin; C：Expression levels of E-cadherin and Vimentin in liver tissues of mice in each group. 1：Control; 2:Model; 3:Silibinin; 4:Apigeniu-L; 5:Apigenin-M; 6:Apigenin-H. ##P<0.01 vs Control group； **P<0.01 vs Model group.

2.5 芹菜素抑制PDK1/AKT信號(hào)通路PDK1和AKT磷酸化在EMT過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，也是引起肝纖維化的重要原因。本研究中，利用免疫組化評(píng)價(jià)了各組小鼠肝臟組織中磷酸化PDK(p-PDK S241)和磷酸化AKT(p-AKT S473)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，肝纖維化小鼠肝臟組織中p-PDK和p-AKT表達(dá)水平明顯升高，芹菜素可以顯著抑制肝纖維化小鼠p-PDK和p-AKT表達(dá)，且中、高劑量具有量效關(guān)系(Fig 5A-D)。利用Western blot對(duì)各組小鼠肝臟組織中p-PDK S241和p-AKT S473蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與免疫組化相似(Fig 5E)。

Fig 5 Effect of apigenin on PDK1/AKT signaling pathway in mouse liver A-B：p-PDK1 S241 immunohistochemical representative images and pathological score statistics; C-D：p-Akt S473 immunohistochemical representative image and pathological scores statistics; E：Protein expression levels of p-PDK1 S241 and p-Akt S473 in liver tissues of mice in each group. 1：Control; 2:Model; 3:Silibinin; 4:Apigeniu-L; 5:Apigenin-M; 6:Apigenin-H. ##P<0.01 vs Control group； **P<0.01 vs Model group

3 討論

肝纖維化是指肝臟在各種致病因素作用之下，產(chǎn)生有活性的成纖維細(xì)胞，最終引起肝細(xì)胞外基質(zhì)彌漫性過(guò)度沉積的病理過(guò)程[13]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，天然小分子在抑制、逆轉(zhuǎn)肝纖維化方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其中黃酮類(lèi)小分子的藥效尤為顯著[14]。芹菜素是一種典型的黃酮類(lèi)分子，本研究利用CCl4建立了小鼠肝纖維化模型，并評(píng)價(jià)了芹菜素對(duì)模型鼠的治療作用及藥理機(jī)制。

CCl4是一種具有肝臟毒性的有機(jī)溶劑，能夠引起肝細(xì)胞損傷、激活肝星狀細(xì)胞并增加細(xì)胞外基質(zhì)，從而引起肝纖維化。CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化病程穩(wěn)定，在病理學(xué)上與人肝纖維化具有很強(qiáng)的相似性[15]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有顯著的治療效果，能夠改善肝纖維化小鼠生活狀態(tài)、降低肝組織的病理?yè)p傷。

進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，芹菜素通過(guò)PDK1/AKT信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞EMT進(jìn)而發(fā)揮藥效。間充質(zhì)細(xì)胞在肝纖維化形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，EMT過(guò)程使得具有上皮表型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型。EMT過(guò)程在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因此，抑制EMT對(duì)治療肝纖維化具有重要作用，也是目前肝纖維化治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。芹菜素具有抗炎、抗癌的作用，能夠通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞EMT發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素抑制了肝纖維化模型小鼠肝臟細(xì)胞Vimentin表達(dá)水平，同時(shí)提高了E-cadherin表達(dá)水平，Vimentin和E-cadherin蛋白分別為間充質(zhì)表型細(xì)胞標(biāo)志物和上皮表型細(xì)胞標(biāo)志物，該結(jié)果表明芹菜素在發(fā)生肝纖維化的肝臟細(xì)胞中抑制了EMT過(guò)程。PDK1/AKT信號(hào)通路與多個(gè)EMT相關(guān)蛋白關(guān)系密切，在發(fā)生EMT的細(xì)胞中，PDK1和AKT往往以磷酸化激活狀態(tài)存在[17]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素可以顯著抑制PDK1磷酸化水平和AKT磷酸化水平，通過(guò)抑制PDK1/AKT通路發(fā)揮抗纖維化的作用。

黃酮類(lèi)分子富含于日常水果、蔬菜和多種野生植物之中，具有廣泛的藥理作用。在本研究中，將水飛薊賓作為陽(yáng)性藥進(jìn)行對(duì)比研究，該分子亦為黃酮分子。水飛薊賓能夠起到穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、維持肝細(xì)胞完整的作用，在臨床上作為保肝、護(hù)肝，預(yù)防、治療肝纖維化的藥物使用。本研究結(jié)果顯示，芹菜素和水飛薊賓對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化均有治療作用，在相同摩爾濃度下，二者藥效相當(dāng)，進(jìn)一步提高芹菜素的用藥劑量，藥效進(jìn)一步提高且未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。本研究初步闡釋了芹菜素的藥理機(jī)制，也進(jìn)一步豐富了黃酮類(lèi)分子的藥理作用，為研究黃酮類(lèi)分子的共性藥理特征提供了信息。

肝纖維化導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)受到損傷，會(huì)導(dǎo)致肝硬化進(jìn)而導(dǎo)致肝癌發(fā)生[18]。目前，肝硬化和肝癌暫時(shí)沒(méi)有有效的且能夠普及的治療方案，但是肝纖維化具有可逆性，治療肝纖維化為治療慢性肝病提供了有效的早期窗口，具有重要意義。盡管針對(duì)肝纖維化治療的藥物研究眾多，且取得較快發(fā)展，迄今為止，還沒(méi)FDA批準(zhǔn)的專(zhuān)門(mén)治療纖維化的藥物上市。針對(duì)病毒性肝炎，臨床上常使用干擾素和核苷酸類(lèi)藥物阻止、延緩肝纖維化的進(jìn)展，甚至可以達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的效果。但其他病因的肝纖維化暫時(shí)缺乏有效的手段。

芹菜素來(lái)源于食物，安全性良好，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，擁有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為保肝、護(hù)肝，治療肝纖維化藥物的潛力。同時(shí)芹菜素在日常的水果、蔬菜中含量豐富，芹菜素新的藥效和藥理機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，有助于指導(dǎo)人們通過(guò)日常飲食調(diào)節(jié)，達(dá)到預(yù)防肝病的保健作用。

本研究存在一定的不足，尚缺少在細(xì)胞水平、動(dòng)物水平的深入機(jī)制研究，缺少對(duì)芹菜素毒副作用、藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面的系統(tǒng)研究。在未來(lái)的研究中，需對(duì)以上內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充研究。此外，還可針對(duì)芹菜素預(yù)防肝纖維化的效果開(kāi)展研究。在藥物化學(xué)方面，可通過(guò)對(duì)芹菜素有針對(duì)性的改構(gòu)進(jìn)一步增強(qiáng)其藥理活性。

綜上所述，芹菜素可以通過(guò)抑制PDK1/AKT信號(hào)通路來(lái)抑制肝細(xì)胞EMT，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。芹菜素具有進(jìn)一步研發(fā)為保肝、護(hù)肝，治療肝纖維化的藥物的潛力。