程新杰，徐艷梅，郝麗娟，赫玉霞，高燕霞△

（1. 河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011； 2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000； 3. 石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)＜石家莊＞有限公司·河北省制技工程技術(shù)研究中心·新型藥物制劑與輔料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035）

尼群地平為二氫吡啶類鈣通道拮抗劑［1-2］，可對血管平滑肌及心肌的跨膜鈣離子內(nèi)流產(chǎn)生抑制作用，且血管選擇性較強(qiáng)，引起冠狀動脈、腎小動脈等全身血管擴(kuò)張而發(fā)揮降壓作用，臨床主要用于治療高血壓和冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。?-6］。國產(chǎn)仿制藥的質(zhì)量參差不齊，迫切需要對其進(jìn)行一致性評價，以提高其質(zhì)量與療效［7-8］。口服固體制劑內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)是溶出度，可通過體外模擬制劑在胃腸道中的釋放過程來實(shí)現(xiàn)，與生物利用度密切相關(guān)。在不同pH 介質(zhì)中測定制劑的溶出曲線，可更直觀地反映藥物在體內(nèi)的釋放速率與程度［9］。本研究中以尼群地平片為模型藥物，采用高效液相色譜法檢測尼群地平含量，測定不同廠家尼群地平片在不同pH 溶出介質(zhì)中的溶出度，采用相似性因子法與參比制劑［10］的溶出曲線進(jìn)行對比，建立了尼群地平片體外溶出度的一致性評價方法，可為尼群地平片仿制藥的質(zhì)量評價和處方工藝改進(jìn)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；EDT - 14Lx 型自動溶出儀（英國Electrolab 公司）；XS105 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；PB - 20 型酸度計(jì)（德國Sartorius 公司）；Milli-Q純水制造系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

尼群地平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100585-201705，含量為99.9%）；尼群地平片（市售仿制藥，規(guī)格均為每片10 mg，A 廠，批號分別為H1709014，H1709015，H1 709016；B 廠，批 號 分 別 為376171002，376171003，376171004）；尼群地平片（原研制劑，Bayer Vital GmbH，批號為BJ33777，規(guī)格為每片10 mg）；甲醇、乙腈、四氫呋喃（色譜純，德國默克股份有限公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbox Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-四氫呋喃-水（5∶6∶14，V/V/V）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：25 ℃；檢測波長：356 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶出條件［11-12］

采用槳法測定，轉(zhuǎn)速為100 r/ min，溶出介質(zhì)體積為900 mL，溫度為（37 ± 0.5）℃，以4 種區(qū)分能力較強(qiáng)的溶劑為溶出介質(zhì)［12］。水：取純化水，添加0.15%吐溫-80，搖勻，即得；pH 1.2 氯化鈉鹽酸溶液：取氯化鈉2.0 g和鹽酸7 mL，加水至1 000 mL，添加0.15%吐溫-80，搖勻，即得；pH 4.0 醋酸鹽緩沖液：取0.05 mol/L 醋酸3.0 mL，加水至1 000 mL，加氫氧化鈉調(diào)pH 至4.0，添加0.15%吐溫-80，搖勻，即得；pH 6.8 磷酸鹽緩沖液：取0.2 mol/L 磷酸二氫鉀溶液250 mL、0.2 mol/ L 氫氧化鈉溶液118 mL，加水至1 000 mL，添加0.15%吐溫-80，搖勻，即得［12］。取樣時間點(diǎn)分別為5，10，15，30，45，60，

90，120 min。

2.3 溶液制備

取尼群地平對照品28 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為280 μg/mL的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液適量，分別加入2.2 項(xiàng)下4 種溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度均為5.6 μg/mL 的對照品溶液。取樣品（批號分 別 為H1709014，H1709015，H1709016，376171002，376171003，376171004）各6 片，溶于900 mL 4 種溶出介質(zhì)中，按2.2 項(xiàng)下條件進(jìn)行溶出試驗(yàn)，由自動溶出儀取樣，即為供試品溶液。取尼群地平片（批號為BJ33777）6 片，按供試品溶液制備方法制備參比制劑溶液。以不同pH的溶出介質(zhì)作為空白溶液。

2.4 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果對照品溶液和供試品溶液色譜圖中尼群地平色譜峰保留時間相同，且空白溶液不干擾測定，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：取尼群地平對照品10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的尼群地平對照品貯備液。分別精密量取上述對照品 貯備液0.01，0.05，0.10，0.50，1.00，1.20 mL，置10 mL容量瓶中，加入2.2項(xiàng)下4種溶出介質(zhì)定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為1，5，10，50，100，120 μg/mL 的系列工作溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以尼群地平質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 尼群地平線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of linear relation test of nitrendipine（n=6）

精密度試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖。計(jì)算RSD。結(jié)果在水、pH 1.2 氯化鈉鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液和pH 6.8 磷酸鹽緩沖液不同溶出介質(zhì)中，尼群地平峰面積的RSD分別為0.05%，0.37%，0.15%，0.20%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為376171002）20 片，研細(xì)，取適量，精密稱定，約相當(dāng)于尼群地平片10 mg，置100 mL 容量瓶中，加溶出介質(zhì)適量，振搖使溶解，定容，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，棄去至少10 mL 初濾液，精密量取續(xù)濾液適量，加溶出介質(zhì)稀釋成每1 mL中含5.6 μg 的溶液，平行制備6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計(jì)算平均累積溶出量。結(jié)果在水、pH 1.2 氯化鈉鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液不同介質(zhì)中，供試品溶液平均累積溶出量的RSD分別為0.52%，1.80%，1.90%，1.32%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

1. 尼群地平A. 水 B.pH 1.2氯化鈉鹽酸溶液 C.pH 4.0醋酸鹽緩沖液D.pH 6.8磷酸鹽緩沖液圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Nitrendipine A.Water B.Sodium chloride-hydrochloric acid solution with pH 1.2 C.ABS with pH 4.0 D.PBS with pH 6.8Fig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下4 種不同pH 溶出介質(zhì)中取樣時間點(diǎn)為45 min 時的供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12 h時按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計(jì)算RSD。結(jié)果水、pH 1.2 氯化鈉鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液不同溶出介質(zhì)中尼群地平峰面積的RSD分別為0.86%，0.74%，0.91%，0.64%（n= 6），表明取樣時間點(diǎn)為45 min的供試品溶液于室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

耐用性試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各適量，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別調(diào)節(jié)流速（1.2 mL/min 和0.8 mL/min）、流動相乙腈比例（15%和25%）、柱溫（20 ℃和30 ℃）、檢測波長（354 nm 和358 nm），并使用不同色譜柱［Agilent Zorbox Eclipse XDB C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Epic C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，120 ?）］，以及不同生產(chǎn)廠家的液相色譜儀（LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；WATERS e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司）等耐用性因素進(jìn)行試驗(yàn)［13-14］。結(jié)果供試品溶液中尼群地平的峰面積基本一致，表明方法耐用性良好。

2.5 樣品溶出度測定

取樣 品（批號 分別為H1709014，H1709015，H1709016，376171002，376171003，376171004）6 片，按2.2 項(xiàng)下溶出條件進(jìn)行溶出試驗(yàn)，分別于5，10，15，30，45，60，90，120 min時取樣。分別將上述各時間點(diǎn)的供試品溶液及2.3 項(xiàng)下對照品溶液注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計(jì)算累積溶出量。以累積溶出量（%）為縱坐標(biāo)、溶出時間（min）為橫坐標(biāo)繪制溶出曲線，尼群地平片仿制藥與參比制劑［10］在不同pH 溶出介質(zhì)中的溶出曲線見圖2。結(jié)果兩個廠家6 批藥品的累積溶出曲線與參比制劑的溶出曲線差異明顯。

2.6 溶出曲線相似性判定［15］

取2 批 樣 品（A 廠 批 號H1709015，B 廠 批 號376171004），按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行溶出試驗(yàn)。結(jié)果45 min時，A 廠樣品在水中溶出量為35.78%，而B 廠樣品為26.53%；60 min 時，A 廠樣品在另外3 種不同溶出介質(zhì)中的溶出量為38.40%～41.74%，而B 廠樣品僅為23.42%～24.58%，這與參比制劑45 min 或60 min 時85%以上的溶出量相差甚遠(yuǎn)，且f2均小于50?？梢姡? 個廠家的尼群地平片在水、pH 1.2 氯化鈉鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽緩沖液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液不同溶出介質(zhì)中的溶出行為均不滿足相似要求，溶出速度均低于參比制劑，且溶出不完全。詳見表2。

表2 尼群地平片仿制藥和參比制劑在4種不同溶出介質(zhì)中的平均累積溶出量和f2值Tab.2 Average cumulative dissolution amount and f2 values of generic drug and reference preparation of Nitrendipine Tablets in four kinds of different dissolution media

3 討論

我國作為仿制藥大國，仿制藥質(zhì)量參差不齊，對藥品的安全性和有效性評價造成了嚴(yán)重影響。為全面提高仿制藥的內(nèi)在品質(zhì)和制藥企業(yè)的綜合能力，同時確保人民用藥安全，并降低醫(yī)療費(fèi)用的支出，開展仿制藥一致性評價工作十分必要。測定參比制劑和仿制藥在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線，并采用相似因子法判定其體外溶出度差異，是評價口服固體制劑內(nèi)在品質(zhì)的重要手段［16］。目前，國家藥品監(jiān)督管理局推薦使用此方法，也是口服固體制劑一致性評價中使用最廣泛的方法。

A. 水 B.pH 1.2氯化鈉鹽酸溶液 C.pH 4.0醋酸鹽緩沖液 D.pH 6.8磷酸鹽緩沖液圖2 尼群地平片仿制藥和參比制劑在4種不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線（n=6）A.Water B.Sodium chloride-hydrochloric acid solution with pH 1.2 C.ABS with pH 4.0 D.PBS with pH 6.8Fig.2 Dissolution profiles of the generic drug and reference preparation of Nitrendipine Tablets in four kinds of different dissolution media（n=6）

通過比較尼群地平片仿制藥與參比制劑在4 種不同pH 溶出介質(zhì)中的溶出度，可以觀察到市售仿制藥與參比制劑的溶出曲線并不相似，說明存在一定質(zhì)量差異。分析其原因，可能為仿制藥的原料、輔料的種類和質(zhì)量、生產(chǎn)工藝等。仿制藥生產(chǎn)企業(yè)需要綜合評價和考慮原料、輔料和處方工藝的影響，進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)品及處方工藝，提升仿制藥與參比制劑的相似度。

采用相似因子法判斷仿制藥與參比制劑之間溶出曲線的相似性，當(dāng)2 條溶出曲線的f2≥50 時，表示溶出度相似。仿制藥與參比制劑的平均累積溶出量達(dá)到85%以上的取樣點(diǎn)不超過1 個。參比制劑在水中45 min時平均累積溶出量為88.00%，故選取的時間點(diǎn)為5，10，15，30，45 min；在另外3 種溶出介質(zhì)中60 min 時平均累積溶出量至少達(dá)86.00%，故選取的時間點(diǎn)為5，10，15，30，45，60 min。

本研究中建立了測定尼群地平片仿制藥在不同pH溶出介質(zhì)中溶出度的高效液相色譜法，繪制溶出曲線，并與參比制劑的溶出曲線進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，2 個廠家的6批尼群地平片仿制藥和參比制劑相比，溶出曲線均不相似，溶出速度慢且不完全，說明仿制藥和參比制劑溶出行為不一致，其質(zhì)量與生產(chǎn)工藝有待提高。本方法適用于尼群地平片仿制藥溶出度的測定，可為尼群地平片仿制藥的質(zhì)量一致性評價提供參考。