苑思坤，劉 亞，陳維一，郭 宏，劉惠軍，楊 飛，鄒佳潔，梁倩立

（1. 河北省保定市食品藥品檢驗所，河北 保定 071000； 2. 保定市體育運動學校，河北 保定 071000）

阿奇霉素為半合成的十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，是以紅霉素為原料，經(jīng)過肟化、貝克曼重排、還原和甲基化反應(yīng)合成得到的一種廣譜抗菌藥物［1-2］。其臨床主要用于治療敏感菌所致呼吸道、皮膚軟組織感染，以及衣原體所致傳播性疾?。?］，對小兒支原體肺炎也有較好療效［4］。其分散片可提高藥物的生物利用度［5］。目前，阿奇霉素分散片已列入河北省基本藥物管理的非基本藥物目錄。本次評價性抽驗為省級專項檢查，分別從河北省各市、縣、鄉(xiāng)三級行政轄區(qū)采集樣品，有目的性地涵蓋了生產(chǎn)企業(yè)、流通企業(yè)、使用單位等各個環(huán)節(jié)，共抽取樣品43批次，涉及22個生產(chǎn)企業(yè)，共計22個批準文號，具有較好的代表性。本研究中通過分析阿奇霉素分散片的法定標準檢驗結(jié)果，對其檢驗標準及檢驗數(shù)據(jù)進行了全面質(zhì)量評價，并參考相關(guān)標準與文獻［6-12］，建立了新的有關(guān)物質(zhì)檢驗方法，為進一步完善、提高質(zhì)量標準，更好地保證藥品質(zhì)量提供了參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），包括G1315D 型二極管陣列檢測器、EZChrom Elite 色譜工作站；e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），包括2998 型光電二極管陣列檢測器、Empower 色譜工作站；CAP225D型電子分析天平（精度為十萬分之一），PB-10型酸度計，購于德國賽多利斯公司；RCZ-8M 型溶出試驗儀，ZB - 1E 型智能崩解儀，購于天大天發(fā)公司；KQ5200 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

阿奇霉素分散片（生產(chǎn)企業(yè)編號為S1 - S22，抽驗樣品43 批次，規(guī)格為每粒含阿奇霉素0.25 g）；阿奇霉素對照品（純度為94.4%，批號為130593-201303），阿奇霉素系統(tǒng)適用性試驗對照品（批號為130609 -201706），購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫銨及其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 法定檢驗標準檢驗

2.1.1 法定檢驗項目

阿奇霉素分散片現(xiàn)行法定檢驗標準為2010 年版《中國藥典（二部）》，2015 年版與2020 年版《中國藥典》均未收載，檢驗標準多年未更新?，F(xiàn)行法定標準包括1）性狀：白色或類白色片；2）鑒別：①為薄層色譜鑒別，②為高效液相色譜鑒別，在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰保留時間應(yīng)與對照品溶液一致，以上①②2 項可選做1 項，本研究中選做鑒別②試驗；3）檢查：包括有關(guān)物質(zhì)、重量差異、溶出度、分散均勻性、含量測定。其中，含量測定采用高效液相色譜法，按外標法［13］計算。

2.1.2 檢驗結(jié)果

1）總體情況

本次評價性抽驗中，共抽取阿奇霉素分散片43 批次，檢驗43批次，合格43批次，合格率為100.00%。

2）性狀

均符合法定標準規(guī)定。

3）鑒別

高效液相色譜法檢驗結(jié)果顯示，供試品溶液色譜峰的保留時間與對照品溶液一致，均符合法定標準規(guī)定。

4）檢查

有關(guān)物質(zhì)：標準規(guī)定，阿奇霉素B、阿奇霉素Gx、紅霉素A偕亞胺醚、其他單個雜質(zhì)及各雜質(zhì)峰面積的和均應(yīng)在規(guī)定限值范圍內(nèi)。43 批次樣品中，僅有2 批次樣品檢出阿奇霉素B 峰，含量分別為0.3%與0.1%（限值為2.0%），其余批次均未檢出；30 批次檢出阿奇霉素Gx峰，最大含量為0.1%（限值為1.0%），其余批次均未檢出；40 批次檢出紅霉素A 偕亞胺醚峰，最大含量為0.1%（限值為1.0%），其余批次均未檢出；43 批次中其他單個雜質(zhì)最小含量為0.2%，最大含量為0.6%（限值為1.0%）；總雜質(zhì)最小含量為0.2%，最大含量為0.8%（限值為4.0%）。43 批次樣品中有關(guān)物質(zhì)檢驗結(jié)果均符合法定標準規(guī)定。

重量差異：標準規(guī)定，20 片重量均在重量差異限度范圍內(nèi)，或超出裝量差異限度的不得多于2 片，并不得有1 片超出限度1 倍。43 批次中，有41 批次均在限度范圍內(nèi)（占95.35%），有2 批次中有1 片超出限度但未超過1 倍（占4.65%），無2 片超出限度且不超出限度1 倍的批次。

溶出度：標準規(guī)定，限度為標示量的75%。43 批次樣品均符合規(guī)定。檢驗結(jié)果見圖1。

圖1 阿奇霉素分散片溶出度檢驗結(jié)果分布Fig.1 Dissolution distribution of Azithromycin Dispersible Tablets

分散均勻性：標準規(guī)定，6片在3 min內(nèi)全部崩解，并通過篩網(wǎng)。43批次均符合規(guī)定，其中7批次在1～2 min全部崩解，占16.28%；26 批次在2～3 min 全部崩解，占60.47%。

含量測定：標準規(guī)定，含阿奇霉素（C38H72N2O12）應(yīng)為標示量的90.0%～110.0%。43 批次的阿奇霉素含量為91.1%～101.9%，平均含量為95.8%，近似服從正態(tài)分布。各生產(chǎn)企業(yè)阿奇霉素分散片中阿奇霉素的平均含量見表1。

表1 各生產(chǎn)企業(yè)阿奇霉素分散片中阿奇霉素平均含量（%）Tab.1 Average contents of azithromycin in Azithromycin Dispersible Tablets from different manufacturers（%）

2.2 探索性研究

2.2.1 標準檢驗方法

2010 年版《中國藥典（二部）》中阿奇霉素分散片有關(guān)物質(zhì)項下關(guān)于阿奇霉素B 的規(guī)定為相對保留時間約為1.53 處的色譜峰，43 批次樣品中僅有2 批次樣品在此保留時間處檢出阿奇霉素B 色譜峰，其余41 批次樣品均檢出疑似峰，但疑似峰的相對保留時間在阿奇霉素主峰的相對保留時間±5%范圍內(nèi)，絕大多數(shù)超出了10%，故按2010 年版《中國藥典（二部）》阿奇霉素分散片有關(guān)物質(zhì)標準判定，此疑似峰不屬于阿奇霉素B，判定為未檢出（見圖2）。采用二極管陣列檢測器對疑似峰進行光譜分析，疑似峰與阿奇霉素B峰的光譜圖基本一致（見圖3），表明采用現(xiàn)行藥品標準測定阿奇霉素分散片有關(guān)物質(zhì)時，阿奇霉素B存在漏判。

1. 保留時間±5%范圍 2. 疑似阿奇霉素B峰圖2 阿奇霉素分散片有關(guān)物質(zhì)檢查色譜圖1.Range of retention time（±5%） 2.Suspected peak of azithromycin BFig.2 Chromatograms of detection for relevant substances in Azithromycin Dispersible Tablets

A. 阿奇霉素B B. 疑似峰圖3 光譜掃描圖A.Azithromycin B B.Suspected peakFig.3 Spectral scanning images

考慮到色譜柱可能是影響樣品保留時間的重要因素，故考察了6 種不同品牌及規(guī)格的色譜柱，采用2010年版《中國藥典（二部）》有關(guān)物質(zhì)項下的色譜條件進行檢測，結(jié)果采用3 種柱長為200 mm 的色譜柱，3 次檢驗中有2 次主峰保留時間超出范圍；采用3 種柱長為250 mm 的色譜柱，3 次檢驗中主峰保留時間均在范圍內(nèi)。詳見表2。

表2 阿奇霉素主峰在不同品牌及規(guī)格色譜柱的保留時間Tab.2 Retention time of the main peak of azithromycin by chromatographic columns with different brands and specifications

結(jié)果表明，色譜柱長度是影響保留時間的主要因素，而不同廠家、型號的色譜柱也對保留時間有一定影響，現(xiàn)行法定標準中定位阿奇霉素B為主峰相對保留時間為1.53 處的色譜峰，6 種不同色譜柱中有2 種保留時間均超出了范圍，導致漏判。表明現(xiàn)行質(zhì)量標準的耐用性有欠缺。

2.2.2 新方法的建立

1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Waters Sunfire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：A為磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用30%磷酸溶液調(diào)pH至8.0）-乙腈（45∶55，V/V），B 為甲醇，采用梯度洗脫程序（見表3）對阿奇霉素分散片的有關(guān)物質(zhì)進行分離；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 mn；進樣量：50 μL。在此色譜條件下，阿奇霉素主峰與各主要雜質(zhì)峰分離效果良好，各峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于2 000。

表3 梯度洗脫程序（%）Tab.3 Gradient elution process（%）

2）溶液制備

稀釋液：以磷酸二氫銨溶液（取磷酸二氫銨1.72 g，精密稱定，加水溶解并稀釋至1 000 mL，用氨試液調(diào)pH至10.0±0.10）-甲醇-乙腈（7∶6∶6，V/V/V）作為稀釋液。

系統(tǒng)適用性試驗溶液：取阿奇霉素系統(tǒng)適用性試驗對照品（含雜質(zhì)R，Q，J，S，I，A，H，B）適量，精密稱定，加稀釋液溶解并稀釋成每1 mL約含10 mg的溶液。

供試品溶液：取樣品細粉適量，精密稱定，加稀釋液溶解并定量稀釋成每1 mL約含10 mg的溶液。

對照品溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置200 mL容量瓶中，用稀釋液稀釋并定容，搖勻，即得。

3）方法學考察

專屬性試驗：（1）輔料干擾試驗。按企業(yè)提供的阿奇霉素分散片處方工藝配制空白輔料，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果空白輔料不干擾阿奇霉素及雜質(zhì)的測定。詳見圖4 A。（2）分離效果試驗。精密量取溶液制備項下系統(tǒng)適用性試驗溶液（含雜質(zhì)R，Q，J，S，I，A，H，B）與供試品溶液各1 mL，混勻，注入高效液相色譜儀。結(jié)果阿奇霉素主峰與各主要雜質(zhì)峰間分離效果良好，各峰分離度均大于1.5。詳見圖4 B。

1. 雜質(zhì)R（紅霉素A 9，11-亞胺醚） 2. 雜質(zhì)Q（紅霉素A 6，9-亞胺醚） 3. 雜質(zhì)J（3-O-去克拉定糖基阿奇霉素）4. 雜質(zhì)I（3'-N-去甲基阿奇霉素） 5. 雜質(zhì)S（紅霉素A-E-肟） 6. 雜質(zhì)A（氮紅霉素A） 7. 雜質(zhì)H 8. 阿奇霉素 9. 雜質(zhì)B（阿奇霉素B）A. 輔料干擾試驗 B. 分離效果試驗圖4 專屬性試驗高效液相色譜圖1.Impurity R（erythromycin A 9，11-iminoether） 2.Impurity Q（erythromycin A 6，9-iminoether） 3.Impurity J（desosaminylazithromycin） 4.Impurity I（N-demethylazithromycin） 5.Impurity S（erythromycin A-E-oxime） 6.Impurity A（Azaerthromycin A） 7.Impurity H 8.Azithromycin 9.Impurity B（azithromycin B）A.Excipients interference test B.Separation effect testFig.4 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關(guān)系考察：取阿奇霉素對照品適量，加稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 含0.1 mg 的溶液。精密量取此溶液1，2，5，10，15，20 mL，分別置50 mL容量瓶中，加稀釋液稀釋并定容，搖勻，每1 mL 溶液含阿奇霉素2.003，4.006，10.014，20.028，30.042，40.056 μg，相當于雜質(zhì)的量為0.2%，0.4%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%。分別取50 μL 進樣測定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=2 905.3X-6 405.1（R2=0.999 1，n=6）。結(jié)果表明，阿奇霉素質(zhì)量濃度在2.003～40.056 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：用逐級稀釋法，以阿奇霉素峰計，以信噪比（S/N）為3∶1 時的質(zhì)量濃度為檢測限，以S/N為10∶1 時的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果檢測限為0.12 μg/mL，定量限為0.40 μg/mL。

穩(wěn)定性試驗：精密量取供試品溶液適量，分別于放置0，2，4，6，8 h 時按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果阿奇霉素B 峰面積的RSD為1.23%（n=5），且其他雜質(zhì)含量未顯著增加，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：精密稱取同一樣品，依法制備供試品溶液，平行5份，再按上述色譜條件進樣測定。結(jié)果阿奇霉素B峰面積的RSD為1.37%（n=5），表明方法重復性良好。

耐用性試驗：取系統(tǒng)適用性試驗溶液50 μL，色譜柱采用Agilent 5 TC - C18（2）柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Shiseido Capcell PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），按上述色譜條件分別注入Agilent 1260 型及Waters e2695型高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果阿奇霉素主峰、各主要雜質(zhì)峰間分離效果良好，分離度均大于1.5。取溶液制備項下供試品溶液及對照品溶液各50 μL，分別進樣測定，每臺儀器各進樣1次。結(jié)果阿奇霉素B峰面積的RSD為1.79%（n=2），表明方法耐用性良好。

4）樣品中阿奇霉素含量測定

取43批樣品各適量，依法制備供試品溶液，進樣測定。結(jié)果按新建立的方法檢驗，43 批次樣品中均檢出阿奇霉素B，無漏判情況，檢測結(jié)果均在規(guī)定限值范圍（限值為2.0%）內(nèi)，但有2 批次樣品接近限值（1.9%，1.8%）。詳見表4。

表4 43批次樣品中阿奇霉素B含量檢測結(jié)果（%）Tab.4 Results of content detection of azithromycin B in 43 batches of samples（%）

3 討論

抽驗結(jié)果表明，河北省不同層面（市、縣、鄉(xiāng)）、不同環(huán)節(jié)（生產(chǎn)、流通、使用）、不同保存條件（溫度、濕度）的阿奇霉素分散片的質(zhì)量無明顯差異。

不同廠家的生產(chǎn)工藝在合理性、可控性和穩(wěn)定性方面存在一定差異，如個別廠家的同批藥品重量差異較大，在檢驗中發(fā)現(xiàn)有2批次樣品重量差異項雖符合規(guī)定，但均有1 片超出限度（但不超過1 倍），說明其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性相對較差；有1批次樣品阿奇霉素含量接近標準規(guī)定的低限值，1 批接近高限值，總體占比為4.65%?？梢姡a(chǎn)企業(yè)應(yīng)嚴格把握好原料藥的質(zhì)量關(guān)，精準控制原料藥投量。

阿奇霉素分散片現(xiàn)行國家標準中，有關(guān)物質(zhì)項下關(guān)于阿奇霉素B 的定位為相對保留時間約為1.53 處的色譜峰，43批次樣品僅有2批次在定位位置檢出了阿奇霉素B 峰，出現(xiàn)了漏判。本研究中考察了6 種不同品牌（2種規(guī)格）的色譜柱，結(jié)果采用3種200 mm柱長的色譜柱進行檢驗時，3 次檢驗中有2 次阿奇霉素B 的保留時間超出范圍；采用3 種250 mm 柱長的色譜柱進行檢驗時，3 次檢驗阿奇霉素B 的保留時間均在范圍內(nèi)，表明色譜柱為影響色譜峰保留時間及阿奇霉素B 檢出的重要因素，而柱長是影響檢驗結(jié)果的關(guān)鍵因素。

本研究中建立的新的有關(guān)物質(zhì)測定方法采用了特定雜質(zhì)峰對照保留時間定位的方法，結(jié)果43 批次樣品中均檢出了阿奇霉素B，極大地提高了檢出率，保證了藥品質(zhì)量。但有2 批次樣品阿奇霉素B 偏高（1.9%，1.8%），接近限值（2.0%），生產(chǎn)廠家應(yīng)引起重視，加強基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)管理。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便、專屬性強，線性關(guān)系考察和重復性試驗結(jié)果，以及確定的檢測限均滿足規(guī)定要求，可作為阿奇霉素分散片有關(guān)物質(zhì)的檢驗方法。