蘇亞霞，趙愛(ài)華

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院藥劑科，上海 200025）

免疫球蛋白A（IgA）腎病是常見(jiàn)的慢性腎小球疾病，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的肉眼血尿或鏡下血尿，且伴有不同程度的蛋白尿、高血壓、腎功能損害等，病情發(fā)展緩慢，約20%的患者在確診IgA 腎病后10 年內(nèi)會(huì)進(jìn)展為終末期腎臟疾病，需透析治療，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命［1-2］。IgA 腎病主要根據(jù)患者尿檢情況、腎功能進(jìn)展速度、是否合并高血壓、腎臟病理改變等進(jìn)行個(gè)體化治療，盡可能地將蛋白尿控制為低于1 g/ d?！陡纳迫蚰I臟病預(yù)后組織（KDIGO）臨床實(shí)踐指南：腎小球腎炎》［3］建議，當(dāng)?shù)鞍啄虺^(guò)0.5 g/d 時(shí)，推薦使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素受體拮抗劑類藥物，根據(jù)血壓情況調(diào)整藥物劑量，同時(shí)控制蛋白和鹽的攝入。蛋白尿控制不佳者，需給予糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等免疫抑制治療，但易產(chǎn)生多種藥品不良反應(yīng)。冬蟲(chóng)夏草Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc. 是治療腎臟疾病的常用中藥［4］，含有蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖、核苷、甾醇、氨基酸、維生素等化學(xué)成分［5］，具有抗菌、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝腎功能等作用［6-11］。冬蟲(chóng)夏草可防止糖尿病腎病的腎臟纖維化［12-13］；蛹蟲(chóng)草可改善膜性腎小球腎炎［14］；蟲(chóng)草菌粉制劑（百令片）可降低膜性腎病患者的蛋白尿［15］；冬蟲(chóng)夏草提取物可通過(guò)抑制系膜細(xì)胞增殖［16］和減少系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積［17］，而延緩IgA 腎病的進(jìn)展［18］。文獻(xiàn)［19-20］報(bào)道了冬蟲(chóng)夏草治療糖尿病腎病和膜性腎病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為臨床治療IgA腎病提供新思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物主要活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmsp-e. com）查詢冬蟲(chóng)夏草主要成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選冬蟲(chóng)夏草的活性成分。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分的PubChem CID，通過(guò)PubChem CID 在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索并獲取Canonical SMILES 式；若活性成分的PubChem CID 信息缺失，則根據(jù)其化學(xué)名稱在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得二維結(jié)構(gòu)式的. sdf 文件。根據(jù)活性成分的Canonical SMILES 式或二維結(jié)構(gòu)，利用Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// www. swisstargetprediction. ch）預(yù)測(cè)活性成分的作用靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）規(guī)范靶點(diǎn)蛋白的基因名稱。

1.2 活性成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的藥物活性成分及規(guī)范處理后的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，利用“Network Analyzer”功能分析節(jié)點(diǎn)的度值。度值越大，表明藥物活性成分涉及的生物功能越多，生物學(xué)重要性也越高。

1.3 IgA 腎病相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“IgA Nephropathy”為檢索詞，通過(guò)人類基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards（https：// www. genecards. org）檢索IgA 腎病相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，根據(jù)度值篩選與疾病密切相關(guān)的靶點(diǎn)；并檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org）補(bǔ)充IgA 腎病靶點(diǎn)。將篩選結(jié)果取并集，并刪除重復(fù)值，利用Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范靶點(diǎn)蛋白名稱。

1.4 冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病網(wǎng)絡(luò)可視化分析

將獲取的疾病靶點(diǎn)蛋白與藥物靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入在線工具Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index. html），獲取交集靶點(diǎn)，即冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病的潛在靶點(diǎn)，結(jié)合冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病的主要活性成分，采用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制藥物- 活性成分-疾病-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 潛在核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將冬蟲(chóng)夏草與IgA 腎病的交集靶點(diǎn)蛋白上傳至String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string - db.org），物種選擇為“Homo sapiens（Human）”；最低要求交互分?jǐn)?shù)“minimum required interaction score”設(shè)置為“medium confidence（0.400）”，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。下載該網(wǎng)絡(luò)的.tsv格式文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析，利用“Network Analyzer”功能對(duì)PPI 進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的特征參數(shù)，計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的度值，篩選冬蟲(chóng)夏草治療IgA腎病的潛在核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體（GO）生物過(guò)程分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析

將冬蟲(chóng)夏草與IgA 腎病的共有靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp），對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過(guò)程分析和KEGG通路富集分析。P＜0.01為顯著富集，運(yùn)用R 語(yǔ)言對(duì)排名前10 的生物過(guò)程及通路進(jìn)行可視化處理，篩選潛在靶標(biāo)可能涉及的生物學(xué)過(guò)程及通路。

2 結(jié)果

2.1 藥物主要活性成分及靶點(diǎn)

通過(guò)檢索TCMSP，PubChem，Swiss TargetPrediction，Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得冬蟲(chóng)夏草的活性成分7個(gè)（見(jiàn)表1），藥物靶點(diǎn)167個(gè)。

表1 冬蟲(chóng)夏草活性成分基本信息Tab.1 Basic information of active components of Cordyceps

2.2 活性成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將7 個(gè)冬蟲(chóng)夏草活性成分和167 個(gè)藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制藥物活性成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖1）。冬蟲(chóng)夏草中節(jié)點(diǎn)的度值較大，涉及生物過(guò)程較多，可能具有較大藥用價(jià)值的活性成分有酒酵母甾醇、膽固醇棕櫚酸酯、過(guò)氧麥角甾醇、花生四烯酸、β-谷甾醇。

圖1 冬蟲(chóng)夏草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network of active components of Cordyceps-targets

2.3 IgA 腎病相關(guān)靶點(diǎn)

以“IgA Nephropathy”為檢索詞，通過(guò)檢索Gene-Cards，OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范靶點(diǎn)蛋白名稱，共獲得1 336個(gè)與IgA腎病相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.4 冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病網(wǎng)絡(luò)可視化分析

將1 336個(gè)IgA腎病靶點(diǎn)與167個(gè)藥物靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入在線工具Venny 2.1.0，共獲得50個(gè)交集靶點(diǎn)（見(jiàn)圖2）。結(jié)合冬蟲(chóng)夏草的7 個(gè)主要活性成分，采用Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖3），共得到網(wǎng)絡(luò)關(guān)系134條。

圖2 冬蟲(chóng)夏草與IgA腎病交集靶點(diǎn)的維恩圖Fig.2 Venny diagram of intersection of Cordyceps targets and IgA nephropathy targets

圖3 冬蟲(chóng)夏草治療IgA腎病的藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Network of drugs-active components-diseases-targets of Cordyceps in the treatment of IgA nephropathy

2.5 潛在核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將50個(gè)交集靶點(diǎn)蛋白上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建核心靶點(diǎn)PPI，借助Cytoscape 3.7.2 軟件對(duì)其進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，并計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的度值。由圖4可知，該網(wǎng)絡(luò)共包含49 個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中1 個(gè)為游離靶點(diǎn)，舍棄），217 條邊。圓形越大，表示度值越大；線條越粗，表示互作分?jǐn)?shù)越高。該網(wǎng)絡(luò)中度值的平均值為9.5，度值大于平均值的靶點(diǎn)有15個(gè)，分別為腫瘤壞死因子（TNF），Scr家族酪氨酸激酶（SFK），表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），環(huán)加氧酶2（PTGS2），雌激素受體1（ESR1），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體ɑ（PPARɑ），激酶插入?yún)^(qū)域受體（KDR），核受體亞家族3C組成員1（NR3C1），鼠雙微體基因2（MDM2），細(xì)胞色素P450 家族19 亞家族A 成員1（CYP19A1），絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14），孕酮受體（PGR），三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子B 亞家族成員1（ABCB1），淀粉樣前體蛋白（APP）。其中，TNF，SFK，EGFR，PPARγ，PTGS2，ESR1的度值均大于雙倍均值，可能是冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病的核心靶點(diǎn)。

圖4 冬蟲(chóng)夏草治療IgA腎病的潛在核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of potential core targets of Cordyceps in the treatment of IgA nephropathy

2.6 GO 生物過(guò)程和KEGG 通路富集分析

GO 生物過(guò)程分析共富集到180 條生物過(guò)程，其中顯著富集（P＜0.01）的生物過(guò)程有65條。根據(jù)P值升序排列，取前10 條生物過(guò)程以氣泡圖展示（見(jiàn)圖5）。結(jié)果顯示，冬蟲(chóng)夏草主要通過(guò)對(duì)甾體激素的反應(yīng)、小分子代謝過(guò)程的調(diào)控、脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)控、炎性反應(yīng)的調(diào)控、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1 和ERK2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控等生物過(guò)程治療IgA腎病。

圖5 冬蟲(chóng)夏草治療IgA腎病的GO生物過(guò)程分析氣泡圖Fig.5 Bubble map of GO biological process analysis of Cordyceps in the treatment of IgA nephropathy

KEGG 通路富集分析富集到50 條通路，其中顯著富集（P＜0.01）的通路有12 條。根據(jù)P值升序排列，取前10 條生物過(guò)程以氣泡圖展示（見(jiàn)圖6）。結(jié)果顯示，冬蟲(chóng)夏草主要通過(guò)人類巨細(xì)胞病毒感染、Rap1信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、C 型凝集素受體信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路等治療IgA腎病。

圖6 冬蟲(chóng)夏草治療IgA腎病的KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble map of KEGG pathway enrichment analysis of Cordyceps in the treatment of IgA nephropathy

3 討論

IgA 腎病是臨床常見(jiàn)的腎小球疾病，在亞洲地區(qū)發(fā)病率較高，約占原發(fā)性腎小球疾病的35%～55%［21］，約20%～40%的IgA 腎病后期可發(fā)展為腎功能不全甚至終末期腎臟?。?2-23］。目前，臨床主要應(yīng)用ACEI、血管緊張素受體拮抗劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等進(jìn)行治療，有一定療效，但隨著病程的遷延、治療周期的延長(zhǎng)，藥品不良反應(yīng)凸顯。

冬蟲(chóng)夏草藥用歷史悠久，可追溯的相關(guān)漢文字始載于《四川通志》，《本草從新》《本草綱目拾遺》也記載其有保肺、益腎、止血、化痰等功效。歷版《中國(guó)藥典》均將冬蟲(chóng)夏草收錄在內(nèi)，其功能與主治為補(bǔ)腎益肺、止血化痰，用于腎虛精虧、陽(yáng)痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘、勞嗽咯血?，F(xiàn)代研究證實(shí)，冬蟲(chóng)夏草對(duì)腎臟具有顯著的保護(hù)作用，如冬蟲(chóng)夏草制劑與ACEI 或血管緊張素受體拮抗劑類藥物合用對(duì)慢性腎臟病的愈后優(yōu)于單用上述2類藥物［24-25］。黃燕萍等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲(chóng)夏草能提高機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，抑制IgA 腎病大鼠免疫復(fù)合物的沉積，減輕腎臟病理變化，延緩IgA 腎病進(jìn)展。崔美玉［26］對(duì)30 例經(jīng)活檢確診為IgA 腎病的患者在給予內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上加用冬蟲(chóng)夏草水煎劑口服，有效率為86.7%，提示冬蟲(chóng)夏草對(duì)IgA腎病的治療效果確切。XIAO 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲(chóng)夏草可能通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠Th22 細(xì)胞的趨化性，以抑制IgA 腎病的炎性反應(yīng)。

本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病的潛在作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性預(yù)測(cè)，結(jié)果冬蟲(chóng)夏草共包含7 個(gè)主要活性成分，對(duì)應(yīng)167 個(gè)藥物靶點(diǎn)，共獲得IgA 腎病靶點(diǎn)1 336 個(gè)，50 個(gè)冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病的潛在作用靶點(diǎn)；通過(guò)構(gòu)建PPI，篩選得到冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病的6 個(gè)核心靶點(diǎn)，即TNF，SFK，EGFR，PPARG，PTGS2，ESR1。TNF 可引起細(xì)胞凋亡，是機(jī)體炎性和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，其中TNF-α 與IgA 腎病病情的進(jìn)展呈正相關(guān)，可刺激系膜細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展［27-28］。SFK可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移及血管形成等多種生物學(xué)過(guò)程，在各種慢性腎臟病的腎纖維化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［29］。EGFR是一種受體酪氨酸激酶，廣泛表達(dá)于細(xì)胞膜表面，活化后可引起蛋白表達(dá)、細(xì)胞分裂與增殖等，抑制EGFR 的表達(dá)可明顯減少足細(xì)胞損傷和凋亡，以及抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎臟［30］。PPARG 在腎臟、肝臟、脂肪等組織中均有不同程度的表達(dá)，參與多種生理及病理過(guò)程，包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、脂肪細(xì)胞的分化等生理及病理過(guò)程，多種抗纖維化微小核糖核酸受轉(zhuǎn)錄因子PPARG 的調(diào)控，PPARG 可能是抗纖維化治療的靶點(diǎn)［31］。PTGS2 主要參與炎性調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激等生理病理過(guò)程，腎臟病患者普遍存在微炎性狀態(tài)，且氧化應(yīng)激與腎臟病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［32］。ESR1 基因可編碼雌激素受體，雌激素是已知的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)劑，與雌激素受體結(jié)合后可活化靶基因轉(zhuǎn)錄，抑制核因子κB的表達(dá)，參與機(jī)體的炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和應(yīng)激反應(yīng)［33］。

GO 生物過(guò)程分析結(jié)果顯示，冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病可能涉及的生物過(guò)程包括對(duì)甾體激素的反應(yīng)、小分子代謝過(guò)程的調(diào)控、脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)控、炎性反應(yīng)的調(diào)控、ERK1 和ERK2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控等。甾體激素包括腎上腺皮質(zhì)激素和性激素兩大類，其中腎上腺皮質(zhì)激素具有抗炎、抗過(guò)敏、免疫抑制等重要生理和藥理學(xué)作用［34］，腎臟疾病的發(fā)生常伴有炎性反應(yīng)，減輕炎性反應(yīng)能改善腎功能損傷［35］，免疫抑制是腎臟疾病治療的常用手段。許多小分子代謝產(chǎn)物參與細(xì)胞的凋亡和自噬過(guò)程［36］，在腎臟疾病中足細(xì)胞過(guò)度凋亡和自噬會(huì)引發(fā)蛋白尿。脂質(zhì)代謝異常與腎功能損傷關(guān)系密切，高脂血癥可通過(guò)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞導(dǎo)致脂質(zhì)腎毒性［37］。ERK1 和ERK2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控［38］。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，冬蟲(chóng)夏草治療IgA腎病可能通過(guò)人類巨細(xì)胞病毒感染、Rap1信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、C 型凝集素受體信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路等。巨細(xì)胞病毒普遍存在，且多數(shù)是人類巨細(xì)胞病毒，巨細(xì)胞病毒感染是免疫功能障礙的標(biāo)志，也是慢性疾病的病因，可導(dǎo)致間質(zhì)性腎炎的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖、足細(xì)胞脫落、腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化等［39］。Rap1 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)腎臟對(duì)水和鈉的重吸收，介導(dǎo)腎臟纖維化及腎小管細(xì)胞的增殖、凋亡等［40］。腎臟疾病患者會(huì)出現(xiàn)代謝及內(nèi)分泌紊亂，其中生長(zhǎng)激素- 胰島素樣生長(zhǎng)因子軸在調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞的增生及腎血流量等方面發(fā)揮著重要作用，腎小球足細(xì)胞可表達(dá)功能性生長(zhǎng)激素受體，生長(zhǎng)激素能提升活性氧的水平，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組，提示生長(zhǎng)激素的作用與腎小球功能障礙之間的新機(jī)制聯(lián)系［41-42］。此外，胰島素抵抗會(huì)加重IgA 腎病腎小管間質(zhì)病變［43］。C 型凝集素可識(shí)別廣泛的配體，并調(diào)節(jié)多種生理功能，在自身免疫性疾病中具有重要作用，與腎臟疾病中炎癥的持續(xù)發(fā)生相關(guān)［44］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是內(nèi)皮細(xì)胞的特殊生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化、血管形成等，主要在腎小球足細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)腎臟疾病的動(dòng)態(tài)觀察、治療及預(yù)后有十分重要的作用［45］。冬蟲(chóng)夏草治療IgA腎病可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、抗炎、減少足細(xì)胞凋亡、抑制系膜細(xì)胞增殖等機(jī)制而發(fā)揮保護(hù)腎臟、延緩疾病進(jìn)展的作用。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草治療IgA 腎病的作用機(jī)制，涉及多種活性成分、多個(gè)作用靶點(diǎn)、多條通路及生物過(guò)程。但由于本研究只是基于數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，具體的藥物作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證。