楊志平，田婉佳，王遠(yuǎn)志，趙云冬

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.北華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素.據(jù)統(tǒng)計(jì)[1-3]，全球約有50%的人口感染了Hp，嚴(yán)重威脅人們的身體健康.在我國，慢性胃炎的患病率接近90%[4]，其中，70%～90%患者伴有Hp感染.在消化性潰瘍患者中，胃潰瘍、十二指腸潰瘍的Hp檢出率分別為70%、90%，同時(shí)還有研究[5]發(fā)現(xiàn)，在人類的口腔中也存在Hp感染，并認(rèn)為可能是引起胃Hp感染及其復(fù)發(fā)的潛在因素.

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年5月—2020年9月因上消化道癥狀(反酸、胃灼熱、噯氣、腹痛、腹脹)在北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科就診的慢性胃炎患者141例，其中，慢性淺表性胃炎54例，慢性萎縮性胃炎87例.慢性淺表性胃炎組中男29例，女25例，年齡18～73歲，平均(46.98±17.35)歲；慢性萎縮性胃炎組中男45例，女42例，年齡18～75歲，平均(47.69±16.56)歲.所有患者均行電子胃鏡檢查、診斷.同時(shí)納入北華大學(xué)附屬醫(yī)院就診的無消化道癥狀的健康體檢者109例，其中，男57例，女52例，年齡18～80歲，平均(46.65±17.43)歲.

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80歲；接受13C呼氣試驗(yàn)檢查、胃鏡檢查，明確診斷為慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎者；既往未接受過Hp根除治療；近6個(gè)月內(nèi)未接受過口腔治療.

排除標(biāo)準(zhǔn)：近4周內(nèi)服用過抗菌藥物、鉍劑、抑酸劑者；患有嚴(yán)重的心、肺、腦疾病，出血性疾病，無法接受胃鏡檢查者；因嚴(yán)重肝、腎疾病對本研究所用藥物存在禁忌者及對所用藥物過敏者；有精神疾病不能配合檢查及治療者；計(jì)劃妊娠、妊娠期、哺乳期的女性；患有嚴(yán)重的口腔疾病以及口腔惡性腫瘤者；胃部大部分切除術(shù)后者；未按時(shí)規(guī)律服藥者；未按時(shí)復(fù)查者.

1.2 標(biāo)本采集

依據(jù)13C呼氣試驗(yàn)檢測結(jié)果，將141例慢性胃炎患者分胃Hp陽性組、胃Hp陰性組，對兩組中的患者進(jìn)行唾液Hp檢測，比較兩組患者唾液Hp的檢出情況.

在141例慢性胃炎患者中，胃Hp陽性患者80例，根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)，同意接受Hp根除治療且按療程規(guī)律服藥并按時(shí)復(fù)查的患者有79例.根據(jù)唾液Hp檢測結(jié)果，將79例患者分為口腔Hp陽性組、口腔Hp陰性組.所有患者均接受含有鉍劑的四聯(lián)方案(雷貝拉唑+枸櫞酸鉍鉀+阿莫西林+克拉霉素)進(jìn)行治療，療程為14 d，治療結(jié)束至少4周復(fù)查13C呼氣試驗(yàn)、唾液Hp檢測.

1.3 主要儀器、試劑與藥物

13C-呼氣試驗(yàn)診斷試劑盒(北京勃然制藥有限公司)；13C-呼氣試驗(yàn)檢測儀(廣州華友明康光電科技有限公司)；電子胃鏡(GIF-HQ 290，Olympus公司，日本)；口腔拭子基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；PCR試劑(TaqDNA聚合酶，DL2000，北京天根生化科技有限公司)；痰杯(江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司)；雷貝拉唑鈉腸溶片(江蘇豪泰藥業(yè)股份有限公司)；阿莫西林膠囊(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司)；克拉霉素分散片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；枸櫞酸鉍鉀膠囊(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠).

1.4 慢性胃炎診斷方法

患者空腹6 h以上，常規(guī)胃鏡檢查，根據(jù)胃鏡下表現(xiàn)診斷為慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎.在胃竇取活檢組織2份，在胃角處取活檢組織1份，胃體取活檢組織2份，行病理檢查.將胃鏡下診斷與病理診斷相符者作為研究對象.

1.5 13C-UBT檢查及診斷標(biāo)準(zhǔn)

患者呈空腹?fàn)顟B(tài)，口服13C尿素膠囊1粒，給予患者CO2集氣卡，囑患者平緩吹氣1～3 min，當(dāng)指示窗口指示劑逐漸變?yōu)辄S色時(shí)停止吹氣.將集氣卡置于13C-呼氣試驗(yàn)檢測儀上進(jìn)行分析，C值>50為陽性，診斷為Hp感染.

1.6 PCR檢測技術(shù)

唾液標(biāo)本的留?。撼科鹂崭?fàn)顟B(tài)，受檢者用生理鹽水漱口3次，將唾液置入無菌的痰標(biāo)本盒中，收集唾液2～5 mL.對標(biāo)本進(jìn)行編號，完成所有患者的標(biāo)本留取，然后將取樣完成后的標(biāo)本盒放入-80 ℃的低溫環(huán)境中保存，備用.

引物的合成：選取高度保守的Hp16SrRNA：F-ACGCATAGGTCATGTGCCTC，R-GTGTCCGTTCACCC TCTCAG為引物.

Hp DNA的提?。簩? mL唾液置于離心管中，加入400 μL 緩沖液GA，再加入20 μL Proteinase K溶液，渦旋10次混勻，56 ℃放置60 min，每15 min渦旋混勻數(shù)次.之后加入400 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃放置10 min，離心去除離心管蓋內(nèi)壁的液滴，然后裂解液移至新的離心管中，加200 μL無水乙醇充分顛倒混勻.取吸附柱CR2，將裂解液加入其中，再次離心30 s，除去廢液，并加入500 μL緩沖液GD，離心并倒掉廢液，再加入600 μL漂洗液PW，重復(fù)步驟數(shù)次.最后12 000 r/min離心2 min，待吸附材料無殘留的漂洗液后，向吸附膜中間位置懸空滴加30 μL洗脫緩沖液TB，室溫放置5 min后再次進(jìn)行離心.最后將DNA產(chǎn)物保存在-20 ℃，以防DNA降解.

PCR反應(yīng)：引物選用高度保守的16SrRNA序列，預(yù)期擴(kuò)增片段長度182 bp，在反應(yīng)體系內(nèi)加入引物、DNA模板、DNA聚合酶及PCR緩沖液，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)，結(jié)束后72 ℃繼續(xù)延伸10 min.

DNA序列測定：以標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC26695菌株，由北華大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供)作為陽性對照，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物.見圖1.

M．DL2000；1.Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株；2～8.樣本；N.空白對照.圖1DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1DNA agarose gel electrophoresis

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用n(%)表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 慢性胃炎口腔Hp的陽性率

慢性胃炎患者與健康體檢者比較，口腔Hp的陽性率(55.3%)高于健康體檢者(38.5%)(P<0.05).見表1.胃Hp陽性組中口腔Hp陽性率為81.3%，口腔Hp陰性率為18.7%；胃Hp陰性組口腔Hp陽性率為21.3%，口腔Hp陰性率為78.7%，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=50.306，P<0.05).見表2.

表1 慢性胃炎口腔Hp的陽性率Tab.1 Positive rate of oral Hp in chronic gastritis

表2 胃Hp陽性組與胃Hp陰性組口腔Hp陽性率Tab.2 Positive rate of oral Hp in gastric Hp positive group and gastric Hp negative group

2.2 胃Hp陽性組與胃Hp陰性組口腔Hp陽性率

慢性淺表性胃炎患者胃Hp、口腔Hp陽性率分別為44.4%、42.6%；慢性萎縮性胃炎患者胃Hp、口腔Hp陽性率分別為64.4%、55.3%.慢性萎縮性胃炎組患者胃Hp陽性率、口腔Hp陽性率均高于慢性淺表性胃炎組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見表3～4.

表3 慢性胃炎胃Hp的陽性率Tab.3 Positive rate of gastric Hp in chronic gastritis

表4 慢性胃炎口腔Hp的陽性率Tab.4 Positive rate of oral Hp in chronic gastritis

2.3 治療后唾液Hp陽性組與唾液Hp陰性組胃Hp根除率

胃Hp陽性患者共80例，剔除未按規(guī)律服藥患者1例，實(shí)際完成79例；口腔Hp陽性組、陰性組分別是65例、14例.口腔Hp陽性患者胃Hp根除率為63.1%，口腔Hp陰性胃Hp根除率為92.9%，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表5).經(jīng)含有鉍劑的四聯(lián)療法根除治療后，口腔Hp陽性根除率為14.1%(見表6).

表5 治療后唾液Hp陽性與唾液Hp陰性組胃Hp根除率

表6 治療前后口腔Hp陽性率Tab.6 Oral Hp positive rate before and after treatment

3 討 論

Hp屬于一種微需氧的革蘭陰性桿菌，于1982年由澳大利亞學(xué)者M(jìn)ARSHALL和WARREN首次提出[6].有研究[1-4，7]表明：Hp與慢性胃炎、消化性潰瘍密切相關(guān)，并成為其最主要的致病因素.國際癌癥研究中心已將Hp列為Ⅰ類致癌因子，據(jù)統(tǒng)計(jì)[8]，我國超過50%的人口伴有胃Hp感染，Hp感染已成為我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，明確Hp感染途徑及根除的治療方案至關(guān)重要.

1989年KRAJDEN S等[9]及1993年FERGUSON D J等[10]分別在胃Hp陽性患者的牙菌斑中及胃炎患者的唾液中分離出Hp，認(rèn)為牙菌斑、唾液是口腔Hp主要存在部位[11-13].此后諸多國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用不同的檢測方法還從牙周袋、齦溝、舌背黏膜等部位發(fā)現(xiàn)了Hp的存在，這表明口腔是除胃以外另一個(gè)Hp生存場所.由于牙菌斑Hp的檢出率會因采集牙菌斑的牙位不同而不同，其次標(biāo)本的采集還與口腔醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)有關(guān)，而唾液標(biāo)本具有易采集、Hp靈敏度較高、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此，本研究選用唾液作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本.

1997年意大利學(xué)者TURSI A等[14]提出Hp傳播方式主要有糞-口、口-口、胃-口、胃-胃.劉洋等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)胃食管反流病(GERD)患者口腔Hp感染率高于不伴有GERD患者.流行病學(xué)[16-17]報(bào)道，經(jīng)常性集體用餐、共用餐具可增加口-口接觸概率，胃Hp感染率也相對較高.還有研究[18]指出：Hp感染與水資源污染有關(guān)，但口腔Hp感染與胃Hp感染的確切關(guān)系至今尚無定論.本研究結(jié)果表明：與Hp相關(guān)的慢性胃炎中口腔Hp感染率為55.3%，明顯高于健康對照組的38.5%(P<0.05)；在胃Hp陽性的患者中口腔Hp檢出率為81.3%，胃Hp陰性的患者中口腔Hp檢出率為21.3%，差異顯著(P<0.05).此結(jié)果說明口腔Hp感染與慢性胃炎及胃Hp感染具有相關(guān)性.另外，本研究對兩種不同種類胃炎患者的口腔Hp感染率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)慢性萎縮性胃炎組口腔Hp感染率高達(dá)55.3%，明顯高于慢性淺表性胃炎組(42.6%)(P<0.05)，表明口腔Hp感染與慢性萎縮性胃炎相關(guān).原因?yàn)橥僖篐p不易根除，會隨食物不斷地進(jìn)入胃內(nèi)，使胃長期處于Hp感染狀態(tài)；其次，唾液Hp也會產(chǎn)生一些毒素，引起全身的免疫反應(yīng)及胃黏膜損傷.口腔黏膜、胃黏膜都屬于消化道黏膜，均來自外胚層，二者之間可能存在相同的抗原，因此，口腔Hp感染也可能是慢性萎縮性胃炎主要原因之一.

關(guān)于Hp的根除治療方案，目前“三聯(lián)方案”已被“四聯(lián)方案”替代，Hp的根除率有了很大提高，但仍有10%～20%的Hp根除失敗，或有復(fù)發(fā)，與耐藥性、患者依從性等有關(guān).有學(xué)者[19-21]研究發(fā)現(xiàn)：對胃Hp感染的患者進(jìn)行三聯(lián)或四聯(lián)的Hp根除治療時(shí)，不伴有口腔Hp感染患者的胃Hp根除率顯著高于伴口腔Hp感染的患者.本研究結(jié)果顯示：當(dāng)慢性胃炎患者同時(shí)存在口腔Hp感染及胃Hp感染時(shí)，與口腔Hp感染陰性組比較，胃Hp的根除率明顯下降(P<0.05).同時(shí)，含有鉍劑的四聯(lián)療法對口腔Hp的根除率僅為14.1%.有研究[22]報(bào)道：在牙菌斑上存在一種細(xì)菌生物膜，對牙菌斑內(nèi)的Hp具有防護(hù)作用，降低了抗菌藥物的殺菌和(或)抑菌作用，當(dāng)進(jìn)行全身用藥后，其根除率不理想.也有研究[23-24]報(bào)道，當(dāng)患者口腔及胃內(nèi)均出現(xiàn)Hp感染時(shí)，胃Hp及口腔Hp的聯(lián)合治療可提高胃Hp根除率，減少復(fù)發(fā)率.但目前尚無確實(shí)有效的根除口腔幽門螺桿菌的方案，還有待于進(jìn)一步研究.