周金鳳，曾憲晶，劉姝，袁金華，龍菲

井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 吉安 343000

缺血性腦血管?。╥schemic cerebrovascular disease，ICD）是一類(lèi)因腦局部血液循環(huán)中斷引起的神經(jīng)功能障礙性疾病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率的特點(diǎn)。隨著我國(guó)人口老齡化加快，腦血管疾病已經(jīng)成為致死、致殘的主要疾病之一，其中缺血性腦卒中最為突出，約占腦血管疾病的70%［1］。目前對(duì)ICD 尚缺乏有效的防治手段，給患病家庭帶來(lái)沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。研究表明：腦缺血缺氧發(fā)生后，細(xì)胞炎性因子參與啟動(dòng)腦缺血損傷炎癥反應(yīng)程序，炎性反應(yīng)在急性腦缺血損傷過(guò)程中扮演重要角色，并可影響患者預(yù)后［2］。因此，早期積極有效干預(yù)缺血損傷所致的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)程序的啟動(dòng)是防治腦損傷加劇的重要環(huán)節(jié)。

在探究腦損傷治療過(guò)程中，通過(guò)藥物預(yù)處理干預(yù)手段來(lái)誘導(dǎo)腦缺血耐受被證明是一種能有效減輕腦損傷的方法［3］。瑞芬太尼作為μ 型阿片受體激動(dòng)劑，能誘導(dǎo)產(chǎn)生預(yù)處理樣腦保護(hù)作用，我們?cè)谇捌谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼預(yù)處理具有抑制神經(jīng)元壞死和凋亡作用［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)進(jìn)一步探究瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)急性腦缺血損傷大鼠炎性因子表達(dá)影響的變化，繼續(xù)探究其對(duì)腦損傷的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與造模方法

健康SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，鼠齡（12～15 周），空白組6 只，假手術(shù)組、急性腦缺血組、瑞芬太尼預(yù)處理組，每組各18 只，體質(zhì)量（250±50）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)為：SYXK 2012-0001，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 2016-0002，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，參照l(shuí)onga 法［5］制備大鼠腦缺血損傷模型（MCAO）。造模成功后將各組在不同處死時(shí)間點(diǎn)6 h、12 h、24 h 進(jìn)一步分為3 個(gè)亞組，每亞組6 只。假手術(shù)組：僅行左側(cè)頸總動(dòng)脈分離，縫合，不行血管結(jié)扎也不做缺氧缺血處理。瑞芬太尼預(yù)處理組：術(shù)前2 h 將大鼠裝入鼠盒固定，行尾靜脈穿刺并留置靜脈套管針，接微量泵輸入瑞芬太尼（人福醫(yī)藥公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030197），給藥劑量參照人與動(dòng)物體表面積折算的等效劑量系數(shù)折算法［6］，每次輸注5 min，連續(xù)3次，輸注速率為0.8 μg·kg-1·min-1，每次輸注完后給予5 min 間歇期，整個(gè)預(yù)處理過(guò)程約30 min。急性腦缺血組：操作步驟同瑞芬太尼預(yù)處理組，輸注等量生理鹽水代替瑞芬太尼。大腦MCAO 造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：（1）患側(cè)右前爪部分屈曲或完全屈曲；（2）行走時(shí)身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；（3）行走時(shí)身體向偏癱側(cè)跌倒。

1.2 取樣、切片制作

大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，剪開(kāi)胸腹腔，暴露心臟，通過(guò)心臟快速灌注約100 mL 生理鹽水，灌洗至肝臟變白，右心耳流出清亮液體后，再灌注4%多聚甲醛（PFA）溶液約150 mL 固定，至大鼠尾巴及四肢強(qiáng)直僵硬后，撬開(kāi)顱骨，完整取腦放入生理鹽水中漂洗殘血后，置于4%多聚甲醛中固定。24 h 后腦組織取出切塊，經(jīng)不同梯度乙醇脫水，浸蠟，石蠟包埋，用切片機(jī)制作約4 μm 厚度的冠狀切片，常規(guī)HE 染色后，光鏡下觀察缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)病理變化。

1.3 RT-PCR 檢測(cè)TNF-α、IL-6 及IL-8 表達(dá)水平

將大鼠缺血側(cè)腦組織切下冷凍磨碎，勻漿處理至組織完全裂解，提取mRNA 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，接著將獲得的QPCR 引物與模板進(jìn)行擴(kuò)增，TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 與β-actin 的引物用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，交由上海生工股份有限公司合成，合成得到的引物為凍干粉末，取適量的無(wú)酶水進(jìn)行溶解，得到100 μM 的引物母液，稀釋成PCR 擴(kuò)增所需引物濃度為2 μM，序列如下見(jiàn)表1，結(jié)果計(jì)算：采用的內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，LC 480 檢測(cè)得出的CT 值為cDNA 熒光強(qiáng)度達(dá)到所設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)，ΔCt=目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值。每個(gè)樣品中mRNA 相對(duì)表達(dá)量=2-ΔCt×100%

表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

空白組與假手術(shù)組大鼠的無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，在各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均無(wú)明顯變化；急性腦缺血組和瑞芬太尼預(yù)處理組大鼠在術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，與腦缺血組相比，瑞芬太尼預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分（分，，n=6）

表2 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分（分，，n=6）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與急性腦缺血組比較：bP＜0.05。

2.2 TTC 染色缺血側(cè)腦組織結(jié)果分析

每組隨機(jī)選取一塊腦組織，加以修整，漂洗殘血后放入4% PBS 固定、冰凍、切片，最后置于2% TTC 染色液中均勻染色。正常腦組織染色呈紅色，梗死區(qū)呈現(xiàn)灰白色。結(jié)果可見(jiàn)：假手術(shù)組腦切片染色未見(jiàn)明顯異常，腦缺血組和瑞芬太尼預(yù)處理組大鼠腦組織樣本均可見(jiàn)大小不等、界線清晰的蒼白色梗死區(qū)域；與腦缺血組相比，瑞芬太尼預(yù)處理組大鼠腦梗死體積明顯縮?。≒＜0.05）。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 各組大鼠TTC染色缺血側(cè)腦組織梗死體積圖（肉眼可視圖）

表3 各組大鼠腦組織梗死體積比較（，n=6）

表3 各組大鼠腦組織梗死體積比較（，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與急性腦缺血組比較，bP＜0.05。

2.3 大鼠腦組織HE 染色結(jié)果分析

大鼠腦組織HE 染色結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2A、圖2B為空白組及假手術(shù)組神經(jīng)元染色情況，切片見(jiàn)大鼠神經(jīng)元形態(tài)完整，呈圓或橢圓形，排列整齊，核仁明顯，胞核染色清晰均勻。

圖2C、圖2D 是腦缺血組在處死點(diǎn)6 h、24 h染色情況，鏡下6 h 時(shí)見(jiàn)胞體腫脹，缺血周?chē)鷧^(qū)明顯水腫，梗死區(qū)域神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，排列不齊。在24 h 時(shí)神經(jīng)元壞死和凋亡明顯，水腫、腫脹減輕，胞體縮小，見(jiàn)大量固縮變性壞死神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞核消失，部分區(qū)域核固縮深染，邊緣區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胞質(zhì)內(nèi)形成微空泡。

圖2E、圖2F 為瑞芬太尼預(yù)處理組在處死點(diǎn)6 h、24 h 染色情況，在6 h 時(shí)細(xì)胞多層密集排列，胞膜較完整，水腫不明顯，在24 h 時(shí)部分神經(jīng)元胞體縮小，色深染，周?chē)?jiàn)少量固縮壞死神經(jīng)元，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，整體病理改變較腦缺血組減輕。

圖2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織切片HE染色（×400）

2.4 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-6 及IL-8 mRNA表達(dá)水平

大鼠造模后，空白組和假手術(shù)組的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 表達(dá)水平兩組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組及假手術(shù)組兩組比較，急性腦缺血組和瑞芬太尼預(yù)處理組TNF-α、IL-6及IL-8 mRNA 表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與急性腦缺血組同時(shí)間點(diǎn)相比，瑞芬太尼預(yù)處理組的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 表達(dá)水平明顯低于腦缺血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4～6。

表4 各組大鼠腦組織TNF-α mRNA表達(dá)影響（，n=6）

表4 各組大鼠腦組織TNF-α mRNA表達(dá)影響（，n=6）

注：與空白、假手術(shù)組比較：aP＜0.01；與急性腦缺血組比較：bP＜0.05。

表5 各組大鼠腦組織IL-6 mRNA表達(dá)影響（，n=6）

表5 各組大鼠腦組織IL-6 mRNA表達(dá)影響（，n=6）

注：與空白、假手術(shù)組比較：aP＜0.01；與急性腦缺血組比較：bP＜0.05。

表6 各組大鼠腦組織IL-8 mRNA表達(dá)影響（，n=6）

表6 各組大鼠腦組織IL-8 mRNA表達(dá)影響（，n=6）

注：與空白組、假手術(shù)組比較：aP＜0.01；與急性腦缺血組比較：bP＜0.05。

3 討論

腦缺血損傷后，大量炎性因子的釋放與聚集會(huì)對(duì)神經(jīng)元造成損傷或凋亡，進(jìn)而誘發(fā)腦組織損傷［7］，其中機(jī)制之一啟動(dòng)了炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)程序，隨著炎性因子釋放與聚集的增加，神經(jīng)元損傷進(jìn)一步加重，使缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變，進(jìn)而促使炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，其過(guò)程涉及多種炎性細(xì)胞因子參與，以TNF-α、IL-6、IL-8 等為代表的炎性遞質(zhì)失控釋放而形成的“瀑布效應(yīng)”是腦缺血損傷的免疫炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)［8］。TNF-α 是TNF 活性成分，既能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，控制IL-8、IL-6 等諸多炎性遞質(zhì)的生成及分泌，又可參與血管內(nèi)皮損傷及凝血過(guò)程，在腦缺血性損傷中扮演重要角色［9］。IL-6 升高可致中性粒細(xì)胞趨化到炎癥損傷的局部，分泌大量炎性遞質(zhì)，促進(jìn)炎癥瀑布形成，加重炎癥損傷，影響神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)［10］。IL-8 屬于炎性反應(yīng)型或誘導(dǎo)型的趨化性細(xì)胞因子，具有中性粒細(xì)胞趨化劑的所有特性，可誘導(dǎo)形態(tài)改變及趨化、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度一過(guò)性升高、顆粒內(nèi)含物釋放、黏附蛋白上調(diào)等，從而促進(jìn)炎性反應(yīng)［11］。腦損傷越重，炎性遞質(zhì)釋放越明顯，TNF-α 可促進(jìn)腦損傷中的IL-8、IL-6 等因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，而IL-8、IL-6則進(jìn)一步刺激TNF-α 活化，協(xié)同起促炎作用。

缺血性腦損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，目前尚缺乏有效的干預(yù)方法。近年來(lái)動(dòng)物試驗(yàn)研究表明：藥物預(yù)處理可能是防治缺血損傷的有效手段，部分臟器在經(jīng)歷一次或多次的短暫缺血后，對(duì)隨后發(fā)生的長(zhǎng)時(shí)間缺血有很好的耐受力，可明顯減輕缺血所致的損傷。在藥物預(yù)處理過(guò)程中，麻醉性鎮(zhèn)痛藥品是近年來(lái)預(yù)處理藥物選擇的熱點(diǎn)之一。有關(guān)阿片類(lèi)藥物對(duì)腦缺血再灌注損傷的研究結(jié)果表明：δ、μ、κ 受體均參與了減輕腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制［12-13］。研究表明瑞芬太尼能調(diào)節(jié)線粒體的功能，μ 受體和δ 受體均是通過(guò)G 蛋白和K+通道相偶聯(lián)，這兩種阿片受體被激動(dòng)后均可引起K+通道開(kāi)放［14］，線粒體ATP 敏感性鉀通道的開(kāi)放，可減輕線粒體過(guò)氧化損傷而可能具有減輕腦缺血再灌注損傷的作用，而δ受體激活可減少谷氨酸鹽和組織缺氧所引起的神經(jīng)元的死亡［15］。此外，阿片受體通過(guò)降低環(huán)磷酸腺苷（cAMP）產(chǎn)生，減輕激活蛋白激酶A（PKA），從而PKA 對(duì)Ca2+激活的鉀通道抑制作用減弱，細(xì)胞膜去極化作用減弱，Glu 釋放減少，NMDA 受體激活減少，Ca2+內(nèi)流減少，減輕“鈣超載”，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用［16］。本實(shí)驗(yàn)中瑞芬太尼預(yù)處理組TNF-α、IL-6、IL-8 表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)明顯低于急性腦缺血組，且神經(jīng)細(xì)胞的病理反應(yīng)減輕，提示瑞芬太尼預(yù)處理具有減輕炎性因子的作用，與臨床報(bào)道一致［17］。

綜上所述，瑞芬太尼預(yù)處理后大鼠腦梗死體積縮小，神經(jīng)元病理反應(yīng)減輕，腦組織炎性因子表達(dá)降低，表明瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)急性腦缺血損傷具有一定的保護(hù)作用。