王國英，周剛

內蒙古自治區(qū)藥品檢驗研究院，內蒙古自治區(qū) 呼和浩特市 010020

曲安奈德新霉素貼膏是由醋酸曲安奈德、硫酸新霉素、麝香草酚、氧化鋅等加入天然橡膠等基質制成的橡膠膏劑，上海衛(wèi)生材料廠首次研發(fā)，臨床主要用于局限性神經(jīng)性皮炎、慢性濕疹及小面積的銀屑?。?-3］，近年還發(fā)現(xiàn)它可有效地治療結節(jié)性癢疹［4］、結節(jié)性疥瘡［5］、蕁麻疹［6］等。本品中的醋酸曲安奈德是一種具有持久抗炎作用的長效糖皮質激素藥物［7］，多用于治療諸如彌漫性風濕性關節(jié)炎、結締組織疾病的治療［8］。

經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)查詢，該品種共有18個生產廠家、18 個批準文號，4 種規(guī)格，分別為4 cm×6.5 cm、5 cm×6.5 cm、7 cm×10 cm、8 cm×13 cm。通過對現(xiàn)行國內外標準進行查詢，《中國藥典》（Chinese Pharmacopoeia，ChP）、《英 國 藥 典》（British Pharmacopoeia，BP）、《歐洲藥典》（European Pharmacopoeia，EP）、《美 國 藥 典》（United States Pharmacopoeia，USP）及《日本藥局方》（Japanese British Pharmacopoeia，JP）僅收載了曲安奈德原料，均未收載曲安奈德新霉素貼膏。目前該品種收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局（State Food and Drug Administration,SFDA）國家藥品標準化藥第十一冊［9］，原標準檢驗項目設置簡單，對兩種有效成分僅進行鑒別實驗，未對含量進行控制。為完善藥品質量標準，本研究建立高效液相色譜內標法測定曲安奈德新霉素貼膏中醋酸曲安奈德含量，并進行了方法學驗證，結果表明該方法科學合理，結果準確、可靠，可用于曲安奈德新霉素貼膏中醋酸曲安奈德的含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

島津2010A型高效液相色譜儀；Millpore超純水機；Sarlorius AL204、Sarlorius MSA125P-1CE-DI、Sarlorius MAX（SG EA）電子天平；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9145A 型電熱鼓風干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司）。

試劑：甲醇（色譜純），高純水（實驗室自制），正辛烷、乙醇（分析純，國藥試劑），其他為分析純。

1.2 樣品

醋酸曲安奈德對照品（批號100125-201406，純度99.1%，來源：中國食品藥品檢定研究院）；炔諾酮對照品（批號100053-201807，純度99.4%，來源：中國食品藥品檢定研究院）；三家企業(yè)提供的3 批曲安奈德新霉素貼膏，分別為企業(yè)A 樣品（批號200203，規(guī)格4 cm×6.5 cm，），企業(yè)B 樣品（批號200317，規(guī)格4 cm×6.5 cm），企業(yè)C（批號191002，規(guī)格4 cm×6.5 cm）含醋酸曲安奈德均不得少于16 μg/cm2，本次試驗及方法學考察所用樣品為企業(yè)A 樣品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長240 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；以甲醇為流動相A，水為流動相B，按表1 進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 標準溶液制備

2.2.1 內標溶液的制備 取炔諾酮對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL 中含0.20 mg 的溶液，作為內標溶液 。

2.2.2 對照品溶液的制備 取醋酸曲安奈德對照品適量，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL 中含0.80 mg 的溶液，作為對照品儲備溶液。分別精密量取對照品儲備溶液與內標溶液各1 mL，置同一50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品20 片，除去蓋襯，取約2 片量（約52 cm2），剪成小塊（約0.25 cm2），精密稱定，置分液漏斗中，加50 mL 正辛烷，精密加內標溶液1 mL，振搖使膏體溶解，用90%乙醇分次萃取（50、15、15、10 mL），合并下層溶液，水浴蒸干，將蒸干的殘渣加少量乙酸乙酯溶解，轉移至50 mL 量瓶中，再用甲醇分次溶解剩余殘渣，完全轉移至上述容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗 按曲安奈德新霉素貼膏處方，除醋酸曲安奈德外，取2 片量的輔料，置50 mL 分液漏斗中，照“供試品溶液的制備”項下方法處理，制備陰性對照溶液，取空白溶劑及陰性對照溶液，按照“2.1”項下色譜條件檢測，結果顯示，空白溶劑及輔料在醋酸曲安奈德及內標物質出峰時間內對測定不存在干擾，專屬性較好。見圖1。

圖1 專屬性試驗液相色譜圖：A.空白溶劑；B.陰性對照溶液；C.對照品溶液；D.曲安奈德新霉素貼膏供試品溶液

2.3.2 線性關系考察 精密稱取醋酸曲安奈德對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL 含醋酸曲安奈德0.40 mg 的溶液，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，分別置50 mL 量瓶中，分別加入內標溶液1 mL，加甲醇稀釋至刻度，作為系列濃度標準溶液。按照“2.1”項下的色譜條件檢測，以濃度為橫坐標（X），A（對照品）/A（內標）為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=6.635 4X+0.085 2（n=6，r=0.999 0）。結果表明醋酸曲安奈德在4 μg/mL～40 μg/mL 內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 精密量取同一批供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定得醋酸曲安奈德含量的相對標準偏差（RSD）為0.9%，結果表明該實驗方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 照“供試品溶液的制備”項下處理供試品1 份，分別于0、6、12、24、36、48 h 進行了測定，48 h 內結果RSD 為1.9%，表明供試品溶液48 h 內穩(wěn)定性較好。

2.3.5 重復性試驗 取樣品，照“供試品溶液的制備”項下方法，平行制備6 份溶液，并按照“2.1”項下色譜條件檢測，結果測得醋酸曲安奈德平均含量為17.4 μg/cm2，6 份樣品RSD 為1.8%，實驗結果表明該方法重復性良好。

2.3.6 回收率試驗 取樣品20 片，除去蓋襯，精密稱定，剪成小塊（約0.25 cm2），取約1 片量，精密稱定，置分液漏斗中，按表2 加入對照品，照“供試品溶液制備”項下方法自“加50 mL 正辛烷……”進行處理，得供試品溶液，并按照“2.1”項下色譜條件檢測，結果顯示，低、中、高三個濃度回收率在98.5%～100.6%，平均回收率為99.4%，9 份回收率RSD 為0.7%，表明該方法準確度良好，結果見表2。

表2 回收率試驗結果

2.3.7 耐用性試驗 取對照品溶液分別對柱溫、流速、色譜柱、儀器進行耐用性試驗考察，通過改變柱溫25 ℃、30 ℃、40 ℃，改變流速0.8、1.0、1.2 mL/min，更換不同品牌色譜柱CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm），phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）及不同品牌高效液相色譜儀島津LC-2010，Agilent 1260，進行方法耐用性試驗，結果顯示各峰理論塔板數(shù)、分離度均能達到檢測要求，表明方法耐用性較好。

2.4 樣品含量測定

取3 個廠家的3 批樣品，分別照“供試品溶液制備”項下方法，制備供試品溶液，每批樣品制備2 份，并按照“2.1”項下色譜條件檢測，計算含量，結果見表3。

表3 不同生產廠家醋酸曲安奈德測定結果

3 討論

3.1 方法建立的意義

曲安奈德新霉素貼膏現(xiàn)行法定標準中，未對醋酸曲安奈德的含量進行控制。近十年文獻顯示，僅兩篇文獻報道了該品種含量測定方法，均使用石油醚提取后再用乙醇沉淀的方法［10-11］。實際操作過程中發(fā)現(xiàn)，由于貼膏劑基質復雜，處方中含有天然橡膠，且各企業(yè)生產工藝各不相同，復雜的樣品前處理過程，導致平均回收率僅能達到92%［1］，因此有必要建立一個快速、簡便、可靠、準確度高、重復性好的方法，為該制劑的質量控制提供方法依據(jù)。

3.2 提取方法的制定

3.2.1 提取溶劑的選擇 法定檢驗標準中測定含膏量時，采用了90～120#汽油作為溶劑，本實驗分別對97#汽油、93#汽油、石油醚、正辛烷進行了考察。采用浸泡半小時、振搖、待膏體全部溶解后分次加入50 mL 乙醇萃取的方法進行提?。?0］。實驗結果顯示，加入石油醚、97#汽油、93#汽油溶解的膏體有沉淀產生，而正辛烷作為溶劑時，加入乙醇后無沉淀產生，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，且測定結果顯示，正辛烷提取效率優(yōu)于93#汽油、97#汽油和石油醚，93#汽油、97#汽油較難獲取，因此選擇正辛烷作為提取溶劑。

3.2.2 方法準確性驗證 選取正辛烷為提取溶劑，分別制備3 份供試品溶液及3 份回收率實驗溶液，結果表明，3 份供試品含量的RSD 為5.0%，回收率在92.6%～110.0%之間，RSD 為8.6%，證明提取平行性較差，導致結果準確度下降。參考《中國藥典》2020 年版二部中醋酸曲安奈德乳膏［12］，加入炔諾酮作為內標物質進行測定。

3.2.3 正交試驗優(yōu)化提取方法 考慮到樣品基質復雜，提取過程繁瑣，通過設計一個三因素三水平的實驗，分別選定萃取用乙醇濃度、萃取次數(shù)、裁剪大小作為三個因素，每個因素設計三個水平，按L9（34）正交表安排實驗，9 組實驗結果顯示，對實驗結果影響最大的因素是萃取用乙醇的濃度，提取最佳條件是將貼膏剪成0.25 cm2的小塊，用90%乙醇萃取4 次。