于暉，謝慧英，周鴻，胡航

江西省疾病預(yù)防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330029

蜂蜜作為中藥材收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部［1］，也是蜜丸的重要輔料來(lái)源［2］，具有補(bǔ)中、潤(rùn)燥、解毒、止痛等藥用功效，用于肺燥干咳、脘腹虛痛、腸燥便秘等。黃芪蜂蜜、三七蜂蜜、枸杞蜂蜜、黨參蜂蜜、枇杷蜂蜜、益母草蜂蜜等藥用蜂蜜對(duì)慢性病具有良好的輔助醫(yī)療作用［3-4］，深受大眾的喜愛(ài)。然而人們往往忽視了存儲(chǔ)蜂蜜的容器給人體帶來(lái)潛在危害。聚碳酸酯和環(huán)氧樹(shù)脂等有機(jī)材料，因其具備一定的抗沖撞性和輕便性［5］，成為人們用來(lái)存儲(chǔ)蜂蜜的常用容器。由于聚碳酸酯和環(huán)氧樹(shù)脂等合成材料的重要組成原料為雙酚類(lèi)化合物［6-7］，包括雙酚A（bisphenol A,BPA），雙酚F（bisphenol F,BPF）和雙酚S（bisphenol S,BPS）。雙酚類(lèi)化合物對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等具有潛在的生理毒性，并具有一定的致畸性和致癌性，可導(dǎo)致動(dòng)物生殖細(xì)胞的畸形和繁殖率的下降［8-10］。目前雙酚類(lèi)化合物的研究大多集中于谷物、肉類(lèi)、桶裝水等食品的檢測(cè)［11-13］，而藥用蜂蜜中雙酚類(lèi)化合物對(duì)人體健康造成潛在的危害方面報(bào)道較少［14］。因此準(zhǔn)確測(cè)定藥用蜂蜜中雙酚類(lèi)化合物，為研究藥用蜂蜜中雙酚類(lèi)化合物對(duì)人體健康的影響有著重要意義。

由于多壁碳納米管是一種具有良好吸附能力的納米材料，本研究利用羧基化石墨多壁碳納米管凈化樣品，聯(lián)合超高效液相色譜—串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法，建立一種快捷靈敏高效、精準(zhǔn)穩(wěn)定，適用于藥用蜂蜜中雙酚A、雙酚F 和雙酚S 的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-30A 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB SCIEX QTRAP ○R5500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex 公司）；TGL-16M 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；1-16K 小型高速（冷凍）離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；SK8200HP 型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Vortex-5 型渦旋振蕩器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；MG-2200 型氮吹儀（日本理化器械株式會(huì)社）。

乙腈中BPA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL）、乙腈中BPS 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL）、乙腈中BPA-D4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL）和甲醇中BPS-13C12 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL）均購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司；甲醇中BPF 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（10 mg/mL）購(gòu)自美國(guó)AccuStandard公司；BPF-13C6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥98.0%）購(gòu)自加拿大TRC 公司；乙腈、甲醇、甲酸（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Merck 公司）；乙酸乙酯、丙酮（色譜級(jí)，美國(guó)Merck 公司）；羧基化多壁碳納米管（MWCNTs-COOH，純 度≥95%，直 徑8～15 nm，長(zhǎng) 度50 μm）和羧基化石墨多壁碳納米管（GMWCNTs-COOH，純度≥99.9%，直徑8～15 nm，長(zhǎng)度10-50 μm）均購(gòu)自南京吉倉(cāng)納米科技有限公司；HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL）購(gòu)自美國(guó)Waters 公司。10 批藥用蜂蜜樣品購(gòu)自藥店（批號(hào)分別為企業(yè)A：20 210126；企業(yè)B：20 191111；企業(yè)C：20 200401；企業(yè)D：20 200113；企業(yè)E：20 200805；企業(yè)F：20 210210；企業(yè)G：20 201218；企業(yè)H：20 200305；企業(yè)I：20 200101；企業(yè)J：20210220）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制 用初始流動(dòng)相稀釋?zhuān)渲瞥葿PA 和BPF 濃 度均為500 ng/mL、BPS 濃度 為100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2 同位素內(nèi)標(biāo)使用液配制 用初始流動(dòng)相稀釋?zhuān)渲瞥葿PA-D4 和BPF-13C6 濃度均為100 ng/mL、BPS-13C12 濃度為20 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)使用液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 試樣提取 稱(chēng)取混勻的樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入100 μL 同位素內(nèi)標(biāo)使用液（1.2.2），加入25 mL 20%乙腈水溶液，渦旋混勻，超聲提取20 min，以8 000 r/min于4 ℃離心5 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至另一50 mL 離心管中，加50 μL 甲酸，渦旋混勻，待凈化。

1.3.2 凈化 準(zhǔn)確稱(chēng)取90.0 mg GMWCNTs-COOH，裝填成兩端有篩板的聚丙烯固相萃取柱，經(jīng)12 mL甲醇和6 mL 純水活化平衡，上樣，6 mL 20%甲醇水溶液淋洗，用6 mL 甲醇-丙酮（4:1）洗脫，洗脫液氮吹至近干，用1 mL 初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)?2 000 r/min 離心1 min，收集上清液待測(cè)。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：10 ℃；流動(dòng)相：A，水；B，甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，20%B～100% B；5～6 min，100% B；6～6.1 min，100%B～20% B；6.1～9 min，20% B。進(jìn)樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI（-）；離子噴霧電壓4 500 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度：550 ℃；氣簾氣：35.0 L/h ；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）進(jìn)行采集。目標(biāo)離子采集質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，目標(biāo)化合物MRM 譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 BPA、BPF和BPS總離子圖

表1 BPA、BPF、BPS及同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取填料的選擇

比 較GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH 和HLB 3種固相萃取柱對(duì)BPA、BPF 和BPS 的吸附效率，當(dāng)樣品添加水平為40 μg/kg 時(shí)，分別過(guò)GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH 和HLB3種固相萃取柱，BPA、BPF 和BPS 的絕對(duì)回收率見(jiàn)圖2。結(jié)果表明GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH和HLB3種固相萃取柱對(duì)BPA、BPF 和BPS 的吸附效率為：GMWCNTs-COOH＞MWCNTs-COOH＞HLB。因 此選擇GMWCNTs-COOH 作為固相萃取填料。這是因?yàn)樘技{米管具有共軛平面結(jié)構(gòu)，相比于HLB 柱填料，與BPA、BPF 和BPS 的作用力較強(qiáng)［15］，而GMWCNTs-COOH 比MWCNTs-COOH石墨化程度高，缺陷較少，因此三種固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 對(duì)BPA、BPF 和BPS 的吸附效率最高。

圖2 不同固相萃取填料對(duì)BPA、BPF和BPS的吸附效率

2.2 固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 柱容量的優(yōu)化

分別考察了不同柱容量的GMWCNTs-COOH 固相萃取柱（30 mg、60 mg、90 mg、120 mg）對(duì)3 種目標(biāo)化合物的回收率影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同柱容量對(duì)BPA、BPF和BPS的影響

實(shí)驗(yàn)表明BPA、BPF 和BPS 的絕對(duì)回收率隨著GMWCNTs-COOH 柱容量的增大而增大，當(dāng)固相萃取柱的柱容量大于90 mg 時(shí)，BPA、BPF、BPS的絕對(duì)回收率變化趨于平穩(wěn)，因此固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 柱容量為90 mg。

2.3 洗脫溶劑的選擇

分別采用甲醇-丙酮（4:1）、乙酸乙酯、乙腈作為洗脫溶劑，對(duì)吸附在GMWCNTs-COOH 上的目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，洗脫效率見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示：甲醇-丙酮（4∶1）的洗脫效果優(yōu)于乙酸乙酯和乙腈。因此選擇甲醇-丙酮（4∶1）作為洗脫溶劑。

圖4 不同洗脫溶劑對(duì)BPA、BPF和BPS的洗脫效果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢出限和定量限

配制BPA、BPF質(zhì)量濃度為1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L，BPS 質(zhì)量濃度為0.20 μg/L、0.40 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、10 μg/L，同位素內(nèi)標(biāo)BPA-D4、BPF-13C6 濃度為10 μg/L，BPS-13C12 濃度2.0 μg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，上機(jī)測(cè)定。以目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。使用3 倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限，10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算定量限。3 種目標(biāo)化合物的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見(jiàn)表2。

表2 3種目標(biāo)物的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

在蜂蜜中添加低、中、高三個(gè)水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平6 份平行，按方法進(jìn)行處理測(cè)定，BPA、BPS 和BPF 的平均加標(biāo)回收率為87.7%～105.2%，RSD 為2.4%～5.3%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品蜂蜜中3種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品分析

使用本方法對(duì)10 份市售蜂蜜進(jìn)行檢測(cè)，其中1 份蜂蜜檢出BPA，BPA 含量為3.9 μg/kg，BPS 和BPF 均未檢出，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 樣品中雙酚A（BPA）及其內(nèi)標(biāo)子離子圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)考察了采用不同固相萃取填料對(duì)藥用蜂蜜樣品中BPA、BPF 和BPS 的提取效率并建立了固相萃取-超高效液相-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定藥用蜂蜜中BPA、BPF 和BPS 的分析方法。本實(shí)驗(yàn)表明羧基化石墨多壁碳納米管（GMWCNTs-COOH）有較好的吸附效果，且凈化效果明顯。同時(shí)實(shí)驗(yàn)使用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，確保方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能夠滿(mǎn)足方法學(xué)檢驗(yàn)要求。

本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，滿(mǎn)足于大批量藥用蜂蜜中BPA、BPF 和BPS 的檢測(cè)需求，為進(jìn)一步開(kāi)展藥用蜂蜜中雙酚類(lèi)化合物對(duì)人體健康危害評(píng)估提供了技術(shù)支撐。