苗方，馬蘭

菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000

槲皮素（Quercetin，Que）具有明確的抗癌、抗炎作用［1-2］，但因其具有低水溶性、低生物利用度以及化學(xué)穩(wěn)定性較差的劣勢，在臨床應(yīng)用中受到了極大的限制［3］。納米技術(shù)的出現(xiàn)為槲皮素提供了前所未有的發(fā)展空間，為許多疏水性藥物提高溶解度和生物利用度提供了有效的方法。槲皮素制備成納米顆粒并經(jīng)由納米載體遞送之后，具有極高程度的抗癌潛力，在臨床應(yīng)用中擁有一定治療前景，受到各界的廣泛關(guān)注［4］。納米制劑常用于提高藥物溶解度、吸收、循環(huán)、滯留時間以及體內(nèi)分布特異性的各種遞藥系統(tǒng)，包括自乳化乳劑、納米顆粒、脂質(zhì)載體、膠束、包合物等，這些技術(shù)皆能夠提高槲皮素的生物利用度與穩(wěn)定性，極大地提高了槲皮素的臨床應(yīng)用價值［5-7］。

固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是采用適當(dāng)?shù)姆椒?，將脂質(zhì)材料制備成納米粒子，將疏水性藥物包裹或嵌合于脂質(zhì)核中用以提高溶解度，且通過生理因素增加納米粒子在體內(nèi)靶部位的蓄積。納米脂質(zhì)載體在用于遞送抗癌藥物時具有諸多顯著的優(yōu)點，如較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性、較高的載藥量和包封率、可控的藥物釋放行為、優(yōu)良的靶向性及工業(yè)化生產(chǎn)的可行性［8-10］，故將槲皮素結(jié)合脂質(zhì)納米粒技術(shù)進(jìn)行研究，可充分發(fā)揮槲皮素應(yīng)有的治療潛力。

雖然有關(guān)槲皮素納米遞藥系統(tǒng)的報道較多，但有關(guān)槲皮素的體外穩(wěn)定性研究依然較少，本研究制備包載槲皮素的脂質(zhì)納米粒（SLNs/Que），對其凍干粉末的穩(wěn)定性進(jìn)行相關(guān)制劑學(xué)評價以及體外抑制肝癌細(xì)胞的作用研究，為槲皮素臨床制劑的基礎(chǔ)開發(fā)提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子天平（ME204E，METTLER TOLEDO，瑞士）；集熱式磁力攪拌器（DF-101S，上海秋佐科學(xué)儀器有限公司）；超聲波清洗儀（SB-5200D，張家港市科宇信超聲有限公司）；動態(tài)光散射儀（Zetasizer nano ZSP，Malvern，英國）；高效液相色譜儀（L-2000，桂林伯樂馬科技有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機（SFX250，EMERSON，美國）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（MCO-18AC，SANYO，日本）；酶標(biāo)儀（Synergy H1，Bio Tek，美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 試藥

槲皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，上海純優(yōu)生物有限公司）；大豆卵磷脂（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%，上海綠都實業(yè)有限公司）；吐溫80（國藥試劑有限公司）；香豆素（C6，大連美侖生物有限公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（上海鈺森生物技術(shù)有限公司）；優(yōu)級胎牛血清（四季青生物工程公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（上海sigma-aldrich）；其他分析純及色譜純有機試劑均購于國藥試劑有限公司。

2 方法

2.1 脂質(zhì)納米粒的制備

SLNs/Que 的最佳工藝（已在前期研究中確定使用熱熔乳化超聲分散法）：70 ℃水浴加熱攪拌條件下，將已確定用量的槲皮素和單硬脂酸甘油酯溶解于無水乙醇中，作為油相；將已確定用量的大豆卵磷脂和吐溫80 溶解于純化水中，作為水相；保持溫度不變，在攪拌下，以10 mL/min 恒速地將水相溶液分散于油相溶液中；同時采用超聲波處理器處理混合溶液（時間為3 min，功率為400 w，工作與間歇各2 s），制成乳白色的初乳；超聲結(jié)束后放置于25 ℃水浴降溫，過0.45 μm 微孔濾膜，即得淡藍(lán)色透明的SLNs/Que 溶液。將制備的SLNs/Que 溶液加入10%甘露醇，分裝于西林瓶中，冷凍干燥后得到SLNs/Que 粉末。將粉末經(jīng)注射用水復(fù)溶后，得到SLNs/Que 凍干粉末復(fù)溶溶液。空白SLNs 凍干粉末亦采用上述方法制備。

2.2 槲皮素體外分析方法建立

配置質(zhì)量濃度在2.0 μg/mL～12.0 μg/mL范圍的系列槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，采用紫外可見分光光度法測定槲皮素溶液的吸光度（375 nm波長），將槲皮素溶液濃度和吸光度值分別作為橫坐標(biāo)（X）和縱坐標(biāo)（Y），對其進(jìn)行線性回歸分析［11］。分別取2.0、8.0、12.0 μg/mL 的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作日內(nèi)和日間精密度。精密量取白色的SLNs/Que凍干粉末，采用無水乙醇破乳后，配置成9 份供試品溶液，每份加入不同質(zhì)量的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（每份1 mL，分別加入0.4 mg、0.5 mg 和0.6 mg，各3 份），稀釋定容后，測定加樣回收率。

2.3 SLNs/Que 包封率和載藥量測定

精密移取制備好的SLNs/Que溶液，15 000 r/min離心20 min，沉淀的納米粒用無水乙醇破乳后，紫外可見分光光度法測定吸光度值（375 nm），按公式（1）和（2）計算得包封率和載藥量。

2.4 穩(wěn)定性檢查

將SLNs/Que 溶液及SLNs/Que 凍干粉末貯藏于干燥器中，分別于0、30、60、90 d 取樣，對SLNs/Que 溶液及SLNs/Que 凍干粉末復(fù)溶溶液進(jìn)行觀察。使用激光粒度儀測定粒徑和zeta電位。按“2.3”項下方法，測定并計算載藥量和包封率。

2.5 體外釋放行為考察

采用透析法測定SLNs/Que 的體外釋放行為。精密量取0、30、60 和90 d 凍干粉末復(fù)溶的SLNs/Que溶液、未凍干的SLNs/Que 溶液和游離槲皮素溶液各6.0 mL，裝入處理好的透析袋，兩端扎緊，浸入含1%吐溫80（v/v）pH 7.4 磷酸鹽緩沖液的200 mL 溶出介質(zhì)中，進(jìn)行體外釋放檢查（37±0.5 ℃，100 r/min）。在相應(yīng)的透析取樣時間點，分別吸取2.0 mL 釋放介質(zhì)（同時補加同體積同溫度的溶出介質(zhì)），采用紫外可見分光光度法測定槲皮素濃度。將計算后的槲皮素累計釋放百分率繪制成體外釋放曲線。

2.6 四甲基偶氮唑藍(lán)比色法測定細(xì)胞活力

HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2和飽和濕度環(huán)境下含5%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中。將細(xì)胞懸液，接種于96 孔板（2×104個）中。培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)液。設(shè)定空白對照組（為細(xì)胞培養(yǎng)液）、空白制劑組（為培養(yǎng)液+不同濃度空白SLNs 溶液）、游離藥物組（為培養(yǎng)液+不同濃度游離槲皮素溶液）、給藥制劑組（為培養(yǎng)液+不同槲皮素濃度的SLNs/Que溶液），加樣（各組100 μL）。分別孵育48 和72 h 后，每孔加入25 μL 四甲基偶氮唑藍(lán)溶液（5 mg/mL）處理，測定各孔的光密度OD 值（λ=490 nm），按以下公式（3）計算細(xì)胞存活率（以不加藥物的空白細(xì)胞為對照組），并計算IC50值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 統(tǒng)計，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素體外分析方法建立

采用紫外可見分光光度法建立槲皮素體外分析方法，線性回歸方程為Y=0.124X+0.062 2，r=0.999 5。結(jié)果表明，槲皮素在特定的范圍內(nèi)（2.0μg/mL～12.0 μg/mL）質(zhì)量濃度與吸光度呈良好線性。見圖1。高、中和低三種濃度測定的日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD 均小于2.0%，表明測定方法的日間和日內(nèi)精密度良好。測定方法的加樣回收率結(jié)果分別為96.28%、95.47%和101.3%（n=3），表明SLNs輔料對槲皮素含量的測定無影響。

圖1 槲皮素質(zhì)量濃度與吸光度線性回歸圖

3.2 SLNs/Que 的制劑學(xué)性質(zhì)

考察熱熔乳化超聲分散法最佳工藝制備SLNs/Que 溶液及SLNs/Que 凍干粉末復(fù)溶溶液的制劑學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如表1 所示。研究結(jié)果表明，SLNs/Que 溶液和凍干后60 d 內(nèi)的復(fù)溶溶液，其外觀形態(tài)均為透明澄清、粒徑、zeta 電位、包封率和載藥量無變化，但凍干后90 d 的復(fù)溶溶液，可觀察到外觀渾濁，且呈現(xiàn)一系列不穩(wěn)定現(xiàn)象如包封率與載藥量明顯降低、粒徑增大、Zeta 電位降低。

表1 SLNs/Que溶液及SLNs/Que凍干粉末復(fù)溶溶液的制劑學(xué)考察結(jié)果（）

表1 SLNs/Que溶液及SLNs/Que凍干粉末復(fù)溶溶液的制劑學(xué)考察結(jié)果（）

3.3 SLNs/Que 的體外釋放性質(zhì)研究

不同制劑組槲皮素的累計釋放曲線如圖2 所示，游離槲皮素組2 h 的累計釋放量高達(dá)（86.7±3.43）%，4 h 的累計釋放量達(dá)到了90%以上；SLNs/Que 凍干粉末90 d 的復(fù)溶溶液組2 h 的累計釋放量為（65.6±6.23）%，12 h 的累計釋放量達(dá)到了90%以上；而SLNs/Que 溶液組、凍干粉末的復(fù)溶溶液組（0 d、30 d、60 d）的累計釋放曲線相似，累計釋放量基本相同，無顯著的凸釋現(xiàn)象，且均呈現(xiàn)了較好的緩釋效果，48 h 的累計釋放量達(dá)到90%，基本釋放完全。

圖2 體外釋放曲線（n=3）

以上結(jié)果表明，SLNs/Que 凍干粉末保存60 d的復(fù)溶溶液與新制備的SLNs/Que 溶液的制劑學(xué)性質(zhì)及體外釋放行為基本一致，后續(xù)采用保存60 d 內(nèi)的SLNs/Que 凍干粉末復(fù)溶溶液進(jìn)行相關(guān)實驗。

3.4 體外細(xì)胞毒性研究

采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法測定SLNs/Que 對HepG2 細(xì)胞的毒性作用。不同濃度空白SLNs 組細(xì)胞的生存率均大于90%，表明空白SLNs 對HepG2細(xì)胞幾乎無毒性作用，空白載體材料安全性較高。不同濃度的空白SLNs 對HepG2 細(xì)胞處理不同時間后的細(xì)胞存活率如圖3 所示。

圖3 HepG2經(jīng)空白SLNs處理48 h和72 h后的細(xì)胞存活率（n=5）

HepG2 細(xì)胞經(jīng)SLNs/Que 和槲皮素原料藥處理不同時間后的細(xì)胞存活率如圖4 所示。結(jié)果表明，隨著槲皮素原料藥濃度增加，其對細(xì)胞的毒性也增加。HepG2 細(xì)胞經(jīng)SLNs/Que 和槲皮素原料藥處理后48 h和72 h的IC50值如表2所示。48 h和72 h時，SLNs/Que 的IC50分別降低57.73%和76.27%。與槲皮素原料藥的IC50相比，將槲皮素制成固體脂質(zhì)納米粒后IC50明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，通過脂質(zhì)納米粒包載后，槲皮素對HepG2 細(xì)胞毒性作用增強。

圖4 HepG2細(xì)胞經(jīng)SLNs/Que和槲皮素原料藥處理48 h（A）和72 h（B）后的細(xì)胞存活率（n=5）

表2 SLNs/Que和槲皮素原料藥的IC50（）

表2 SLNs/Que和槲皮素原料藥的IC50（）

4 討論

由于槲皮素在水中溶解度較低，且體內(nèi)的分布不具有特異性，因此導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到了極大的限制。本研究采用熱熔乳化超聲分散法制備的SLNs/Que 脂質(zhì)納米粒，改善以上不足的同時，兼具控制槲皮素緩慢釋放的作用，且更易于工業(yè)化生產(chǎn)［12］。SLNs/Que 是以脂質(zhì)為骨架材料，卵磷脂及吐溫80 為乳化劑制備的納米實心小球。對于微粒分散體系來說，適宜的粒徑除了利于制劑的體外穩(wěn)定性，還能決定微粒在體內(nèi)的分布行為，最終對制劑的靶向效果產(chǎn)生一定的影響。由于槲皮素分散于脂質(zhì)骨架材料中，在釋放過程中，以擴散的方式來實現(xiàn)相對緩慢的釋放，維持體內(nèi)穩(wěn)定的血藥濃度。最終結(jié)果顯示，本研究制備的脂質(zhì)納米粒在保存90 d后，其凍干粉末的穩(wěn)定性下降明顯，可能與凍干保護(hù)劑甘露醇的用量有關(guān)［13-14］，今后將對此問題進(jìn)行進(jìn)一步的研究與探討。