楊洋，劉毓菲，黃青松，高培陽(yáng)，張傳濤▲，陳梅，楊洪靜，王武軍，肖瑋

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸科，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610072；3.成都市第五人民醫(yī)院 呼吸科，四川 成都 611130)

新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)是一種由急性呼吸道綜合癥冠狀病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的高度傳染性疾病[1]。病毒感染機(jī)體后會(huì)觸發(fā)先天免疫應(yīng)答系統(tǒng)，激活免疫細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，從而抑制病毒復(fù)制，清除病原體[2]。但是炎癥因子大量釋放會(huì)造成“過(guò)度保護(hù)”，形成“細(xì)胞因子風(fēng)暴(Cytokine Storm)”，損傷自身器官功能[3]。因此SARS-CoV-2感染后，有些患者臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、乏力等，但也有患者可快速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)、器官衰竭、膿毒血癥、休克甚至死亡[4]。其中，缺氧是推進(jìn)COVID-19病情加重的重要因素之一[5]。細(xì)胞因子、趨化因子激活后，大量聚集于肺部，損傷肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，屏障功能被破壞，造成肺泡水腫和黏液栓塞，影響通氣功能，導(dǎo)致缺氧[6]。各種細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)會(huì)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1A(Hypoxia Inducible Factor-1A，HIF-1A)表達(dá)水平，一方面會(huì)增加細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受，減緩凋亡，但另一方面也會(huì)繼續(xù)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，加重炎癥[7]。因此，干預(yù)HIF-1信號(hào)通路可能為治療COVID-19，減緩病情發(fā)展的方向之一。

COVID-19在中醫(yī)理論中屬于“疫病”范疇，中醫(yī)藥在治療COVID-19過(guò)程中發(fā)揮重要作用，諸多臨床研究證明，以“三藥三方” 為代表的中成藥和中藥方劑[8-10]能夠有效緩解COVID-19患者的臨床癥狀，減緩病情發(fā)展，降低死亡率，臨床總有效率高達(dá)90%[11]。雖然中藥復(fù)方和中成藥可以有效治療COVID-19，但其具體機(jī)制尚不完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于多種數(shù)據(jù)庫(kù)分析藥物在治療疾病過(guò)程中發(fā)揮作用的途徑和靶點(diǎn)的生物信息學(xué)方法[12-14]，還可以用于挖掘潛在的治療藥物[15-16]。本文將利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法通過(guò)HIF-1信號(hào)通路挖掘潛在的治療中藥及活性成分。

1 數(shù)據(jù)庫(kù)及工具

京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[17](https://www.genecards.org/)；基因間功能關(guān)聯(lián)關(guān)系搜索工具(Search Tool for Recurring Instances of Neighbouring Genes，STRING)數(shù)據(jù)庫(kù)[18](https://string-db.org/，Version 11.0)；Cytoscape軟件[19](Version 3.7.2)；全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)[20](Universal Protein Resource,UniProt,https://www.uniprot.org/)；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)[21](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)[22](Protein Data Bank，PDB)(http://www1.rcsb.org/)；有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)(PubChem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；化學(xué)結(jié)構(gòu)式畫(huà)圖軟件(ChemBio3D)；三維分子結(jié)構(gòu)軟件(PyMOL)；分子對(duì)接軟件(AutoDockTools 1.5.6；AutoDock Vina)。

2 方法

2.1 HIF-1信號(hào)通路相關(guān)基因的搜集

以“ko04066：HIF-1 signal pathway”在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)檢索HIF-1信號(hào)通路，下載相關(guān)基因名稱(chēng)及通路圖，并以“HIF-1 signal pathway”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行補(bǔ)充。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵模塊篩選

將HIF-1信號(hào)通路上的基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein Protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，物種選擇“Homo Sapiens”，閾值選擇“Medium Confidence”，網(wǎng)絡(luò)顯示選項(xiàng)選擇“Hide Disconnected Nodes in the Network”，并下載TSV文件。將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用cytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯远戎?Degree)、介數(shù)(Betweenness Centrality，BC)、中心性(Closeness Centrality，CC)和特征向量(Eigenvector，EC)均大于中位數(shù)篩選核心基因，并根據(jù)Degree和連接強(qiáng)度(Combined Score)調(diào)整網(wǎng)絡(luò)展示效果。

2.3 潛在治療活性成分及中藥預(yù)測(cè)

將核心基因上傳至Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因-蛋白映射，并將匹配的蛋白靶標(biāo)上傳至中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)，檢索內(nèi)容選擇“Target name”，根據(jù)口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%，類(lèi)藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18篩選活性成分。保存每個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)活性成分的MOL號(hào)和相關(guān)中藥，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建基因-活性成分-中藥作用網(wǎng)絡(luò)，使用其內(nèi)置工具Network Analyzer工具計(jì)算各個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree。

2.4 分子對(duì)接

在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載Degree前五活性成分的SDF文件，在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心基因蛋白的3D結(jié)構(gòu)，運(yùn)用ChemBio3D軟件和PyMOL軟件對(duì)化合物和蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，然后利用AutoDockTools1.5.6及AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果中結(jié)合能越小提示結(jié)合強(qiáng)度越高。

3 結(jié)果

3.1 HIF-1信號(hào)通路相關(guān)基因

在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)下載HIF-1信號(hào)通路圖(見(jiàn)圖1)，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得相關(guān)基因126個(gè)。

圖1 HIF-1信號(hào)通路圖

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

將HIF-1信號(hào)通路上的基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，獲得一個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)(Number of Nodes)為126(包含2個(gè)游離節(jié)點(diǎn))，邊數(shù)(Number of Edges)為1815的網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用CytoNCA插件拓?fù)浞治?，獲得GAPDH、AKT1、EGFR、VEGFA、MAPK1、HIF1A等44個(gè)核心基因(見(jiàn)圖2)。

圖2 HIF-1信號(hào)通路相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)核心

3.3 根據(jù)HIF-1信號(hào)通路核心基因預(yù)測(cè)潛在治療活性成分及中藥

將44個(gè)核心基因上傳至Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因-蛋白映射，并將匹配的蛋白靶點(diǎn)上傳至TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，共有16個(gè)蛋白靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分符合OB≥30%，DL≥0.18。共檢索到233個(gè)活性成分，對(duì)應(yīng)439種中藥。將這些基因?qū)?yīng)的活性成分和中藥導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建中藥-活性成分-基因網(wǎng)絡(luò)圖，并用Network Analyzer工具計(jì)算各個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree。由于部分中藥僅對(duì)應(yīng)單一活性成分及靶點(diǎn)，考慮到多靶點(diǎn)為中藥作用特點(diǎn)，因此保留Degree≥3的中藥及活性成分(見(jiàn)圖3)。以Degree排序，排名前三的活性成分Degree遠(yuǎn)高于其他，依次為槲皮素(Quercetin，MOL000098)、山奈酚(Kaempferol，MOL000422)、木犀草素(Luteolin，MOL000006)見(jiàn)表1；排名前五的中藥為余甘子、白果、枇杷葉、紅花、苦參，均包含至少4個(gè)活性成分，作用至少10個(gè)核心基因，具體見(jiàn)表2。

圖3 中藥-活性成分-基因網(wǎng)絡(luò)圖

表1 基因-活性成分-中藥網(wǎng)絡(luò)中排名前五活性成分

表2 基因-活性成分-中藥網(wǎng)絡(luò)中排名前十中藥

3.4 分子對(duì)接

所有對(duì)接結(jié)果均<-6 kcal/mol，說(shuō)明有較強(qiáng)的結(jié)合強(qiáng)度(見(jiàn)圖4)。運(yùn)用PyMOL 軟件對(duì)AKT1、MAPK1、HIF1A、VEGFA四個(gè)基因結(jié)合活性最高的結(jié)果進(jìn)行可視化(見(jiàn)圖5)。

圖4 分子對(duì)接結(jié)果

圖5 分子對(duì)接結(jié)果展示

4 討論

SARS-CoV-2感染后，先天免疫系統(tǒng)激活，多種細(xì)胞因子釋放以助于清除病毒[20]。但是，過(guò)量的細(xì)胞因子可使保護(hù)性的免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變成破壞性的免疫反應(yīng)，造成嚴(yán)重的肺部炎癥和肺水腫，導(dǎo)致呼吸困難、低氧血癥甚至死亡[15]。缺氧反應(yīng)是先天免疫應(yīng)答形成的一種微環(huán)境特性，即是免疫應(yīng)答的結(jié)果，又可以激活HIF-1A，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細(xì)胞因子，參與和促進(jìn)炎癥反應(yīng)[23]，形成惡性循環(huán)。因此，本文選取HIF-1信號(hào)通路作為治療COVID-19藥物預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)。

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18為條件共篩選出233種活性成分，對(duì)應(yīng)439種中藥。但是預(yù)測(cè)出的中藥部分包含的活性成分及作用的靶點(diǎn)較少，因此本文進(jìn)一步根據(jù)Degree對(duì)中藥進(jìn)行篩選，中藥Degree越高，說(shuō)明包含的活性成分及作用的靶點(diǎn)越重要，越能有效調(diào)控HIF-1信號(hào)通路。最終篩選出以槲皮素、山奈酚、木犀草素等為代表的活性成分，以余甘子、白果、枇杷葉、紅花、苦參等為代表的中藥。

槲皮素、山奈酚和木犀草素為廣泛存在于自然界的黃酮類(lèi)活性成分，具有抗炎、抗缺血再灌注損傷、抗氧化應(yīng)激損傷、改善內(nèi)皮功能等作用[24-26]。研究表明，槲皮素能夠有效保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞，減輕損傷程度[27]，還能通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1信號(hào)通路起到腦保護(hù)作用[28]，并促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的神經(jīng)再生[29]。山奈酚能夠通過(guò)激活mTOR通路促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞增殖,抑制缺氧心肌細(xì)胞凋亡,降低活性氧水平和抑制自噬[30]，還能夠在缺氧條件下抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和HIF-1活性，從而有效地抑制肝癌細(xì)胞的存活[31]。木犀草素可用于食品抗氧化劑，可減少活性氧的積累，防止曲霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用，并能通過(guò)HIF-1信號(hào)通路促進(jìn)血管生成和上皮恢復(fù)[32]。在對(duì)“三方三藥”的研究中，槲皮素、山奈酚和木犀草素均為高頻有效活性成分[33-38]，與3CL水解酶及ACE2受體具有良好結(jié)合活性，能夠有效抑制SARS-COV-2與ACE2蛋白結(jié)合，起到治療COVID-19的作用。

COVID-19臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力,伴惡心、嘔吐、便溏、腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀,舌苔多厚膩。中醫(yī)認(rèn)為，COVID-19當(dāng)以濕毒疫論治[39]。本研究構(gòu)建的基因-活性成分-中藥網(wǎng)絡(luò)中Degree較高的中藥多歸肺、胃、肝、大腸經(jīng)，功效主要偏于清熱、止咳、和胃、涼血，與COVID-19臨床癥狀相符，可能為治療COVID-19的潛在中藥。余甘子屬大戟科葉下珠屬植物，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血，消食健胃，生津止咳的作用。研究證明，余甘子能夠提高小鼠在缺氧環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)能力，對(duì)腦缺血缺氧具有保護(hù)作用[40]，還能夠能降低缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓、右室高壓和減輕右室肥厚[41]。白果系銀杏科植物，歸肺、腎經(jīng)，具有斂肺氣，定喘嗽，止帶濁，縮小便的功效。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，白果注射液能顯著降低缺氧性肺動(dòng)脈高壓和血中一氧化氮水平，起到保護(hù)作用[42]。枇杷葉為薔薇科植物枇杷的干燥葉，歸肺、胃經(jīng)，具有清肺止咳，降逆止嘔的功效。枇杷葉是臨床治療肺系疾病的常用藥物，多用來(lái)治療肺熱咳嗽、痰濕蘊(yùn)肺[43-44]，藥理研究證明，枇杷葉具有抗炎、抗氧化應(yīng)激的作用[45]。紅花屬菊科植物，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛的功效。研究證明，紅花可以通過(guò)調(diào)節(jié)pVHL/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路增強(qiáng)血管生成，從而促進(jìn)成骨分化[46]，還可以抑制HIF-1α及Caspase-3蛋白的表達(dá),減少神經(jīng)元的凋亡，起到對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。苦參是豆科、槐屬草本或亞灌木植物，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕，殺蟲(chóng)，利尿的功效。苦參堿對(duì)HIF-1A具有抑制作用，且隨濃度升高而增強(qiáng)，能夠減輕低氧條件下的炎癥反應(yīng)，并能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑[47]。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)HIF-1信號(hào)通路相關(guān)基因的分析和潛在活性成分和中藥的挖掘，發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚、木犀草素等活性成分，及余甘子、白果、枇杷葉、紅花、苦參等中藥可以發(fā)揮抗缺氧、抗炎、減輕缺氧損傷和促進(jìn)血管、上皮重塑的作用，為進(jìn)一步探索治療COVID-19的有效藥物提功了理論依據(jù)。但是，本研究?jī)H僅是利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選預(yù)測(cè)，由于中藥成分復(fù)雜，作用基因繁多，目前相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)尚不完善，因此結(jié)果可能存在偏差，還需臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這些藥物的治療效果。