遠月麗，易媛媛，戰(zhàn)勇，陳李淼，袁松麗，黃毅，肖之源，張嬋娟*，周新安*

（1.中國農業(yè)科學院油料作物研究所，農業(yè)農村部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢，430062；2.中國農業(yè)科學院研究生院，北京，100081；3.福建農林大學農學院作物抗性與化學生態(tài)學研究所，福建 福州，350000；4.新疆農墾科學院作物研究所/國家大豆產業(yè)技術體系石河子綜合試驗站/谷物品質與遺傳改良兵團重點實驗室，新疆 石河子，832000）

氮是植物生長發(fā)育最重要的礦質元素之一，是植物葉綠體、核酸、蛋白質以及很多次生代謝產物的重要組成成分，施用氮肥能提高作物產量[1,2]?，F代農業(yè)生產的強化種植，使得耕地土壤中可被直接吸收利用的氮源日漸有限。為提高作物產量，氮肥施用量逐年增加，占肥料年消耗的60%左右。我國氮肥年施用量超過0.26億噸，氮肥利用率僅30%左右，遠低于世界平均水平[3,4]。而且，大量施用化肥并未同比提高作物產量，高肥低效現象反而增加了農業(yè)生產成本，影響了農業(yè)可持續(xù)發(fā)展，造成不同程度的環(huán)境危害[5]。

大豆是喜氮作物，大豆籽粒形成需要大量氮素營養(yǎng)供給，高蛋白品種對氮素需求更高。大豆根瘤共生固氮將分子態(tài)氮N2轉化為可被植物利用的氨，可滿足豆科植物60%～70%的氮素需求[6，7]。但在苗期，大豆根瘤數量少，植株尚不能或很少利用根瘤菌共生固氮供給的氮素，土壤和肥料中的氮素是大豆苗期主要氮素來源[8]。但我國土壤普遍缺氮，過量施用化肥可能造成土壤酸化，流入江河湖海污染水資源[5]。選育氮肥高效利用的農作物品種是解決我國農業(yè)生產中環(huán)境與資源間矛盾的關鍵[9]。不同大豆品種的耐低氮能力存在差異，篩選氮高效利用種質資源、挖掘氮高效利用基因和培育氮高效品種是提高大豆氮利用效率、減少氮肥用量和提高大豆產量的有效途徑。

近年來，國內在水稻[10]、小麥[11]、油菜[12,13]、棉花[14]、谷子[15]和煙草[16]等作物中開展了苗期氮高效利用材料的篩選與鑒定研究，將苗期株高、葉綠素含量、生物量、根系性狀、氮積累量及氮吸收量等作為篩選指標，初步建立起氮高效評價指標體系。目前，大豆氮高效種質資源篩選研究相對有限。郝青南等[8]將干重、地上部分氮積累量、生物量增加值和氮吸收量作為判斷大豆苗期耐低氮的指標，篩選出耐低氮型品種。本研究采用營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，對78份大豆資源材料進行苗期耐低氮表型鑒定，通過分析各材料地上部分干重和總干重耐低氮脅迫指數，初步篩選出氮高效、低氮敏感和中間型大豆材料共8份，鑒定17個氮利用相關性狀，篩選出耐低氮材料2011-X-618 和低氮敏感材料2011-X-531，為大豆耐低氮機制解析和氮高效大豆新品種選育提供了優(yōu)異種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料

選取大豆種質資源78 份（表3），由新疆農墾科學院作物研究所提供。

1.2 低氮處理方法

1.2.1 初篩實驗 初篩實驗在中國農業(yè)科學院油料作物研究所室外生長平臺（帶遮雨裝置）進行，低氮處理參照郝青南等[8]的方法。

挑選大小一致、無花斑、無蟲眼的種子，用紙卷法發(fā)芽，6～7 d 后幼苗長出真葉時，挑選長勢一致的幼苗，移至水培盤中清水培養(yǎng)。采用規(guī)格為54 cm×36 cm 的泡沫板作為種植浮床，以海綿為固定基質，行株距6 cm×5 cm、種植孔徑2 cm。待幼苗第一片真葉完全平展（3 d 左右），去掉幼苗子葉，將清水換成1/2 Hoagland 營養(yǎng)液生長4 d 后，開始進行處理。實驗設正常氮（normal nitrogen, NN）和低氮（low nitrogen, LN）兩種處理，每種處理設3 次重復。正常Hoagland 營 養(yǎng) 液 為0.472 g·L-1Ca(NO3)2·4H2O，0.252 5 g·L-1KNO3，0.04 g·L-1NH4NO3，0.068 g·L-1KH2PO4，0.246 5 g·L-1MgSO4·7H2O，0.004 6 g·L-1Fe-EDTA， 0.000 83 g·L-1KI， 0.006 2 g·L-1H3BO3，0.019 g·L-1MnSO4·H2O，0.008 6 g·L-1ZnSO4·7H2O，0.000 024 g·L-1CuSO4·5H2O，0.000 24 g·L-1Na2MO4·2H2O，0.000 027 g·L-1CoCl2·6H2O。各試劑均為國產分析純。低氮營養(yǎng)液含0.047 2 g·L-1Ca(NO3)2·4H2O， 0.025 25 g·L-1KNO3， 0.004 g·L-1NH4NO3，其它成分不變，缺少的Ca2+和K+分別用CaCl2·2H2O 和K2SO4補足。正常氮營養(yǎng)液氮素含量為7.5 mmol/L；低氮營養(yǎng)液氮素含量為正常氮的1/10，即0.75 mmol/L。每個水培盤裝7 L 營養(yǎng)液，每三天更換一次營養(yǎng)液。處理18 d 后，取樣并進行生物量測定。1.2.2 復篩實驗 復篩在人工控制光溫的溫室內進行，光照周期為16 h 長日照條件，溫度控制在27±2℃，光照強度為30 000 LUX 左右，相對濕度為65%～85%。

由于使用Hoagland 營養(yǎng)液在溫室進行低氮處理時，大豆葉片容易長褐斑，因此采用添加NH4NO3的B&D 無氮營養(yǎng)液[17]代替Hoagland 營養(yǎng)液。復篩時正常氮營養(yǎng)液配方如表1 所示，氮含量為7.5 mmol/L；低氮營養(yǎng)液氮素含量為正常氮的1/10，即0.75 mmol/L，其他營養(yǎng)物質含量不變。去掉子葉后，將材料在1/2 正常氮營養(yǎng)液中的培養(yǎng)時間由初篩的4 d 縮短為2 d，將處理時間由初篩的18 d 縮短為12 d。其余實驗方法與步驟同初篩。處理12 d后，進行相關指標測定。

表1 大豆苗期水培實驗正常氮營養(yǎng)液組分Table1 Normal nitrogen nutrient ingredients for soybean seedling growth

1.3 測定指標

1.3.1 葉綠素含量與株高 復篩時，低氮和正常氮處理12 d后，使用便攜式葉綠素儀SPAD-502Plus測定幼苗頂端第三片完全展開葉的葉綠素相對含量；使用直尺測量幼苗株高，所測株高為從子葉節(jié)至生長點的長度。設置3 次重復，每個重復測定3株苗。

1.3.2 根構型相關性狀 復篩時，低氮和正常氮處理12 d 后，用剪刀在幼苗長有側根的部位剪下，將根組織從幼苗分離，自來水沖洗干凈，放入裝有蒸餾水的透明根盤（25 cm×20 cm）中，將側根逐一分開，用根系掃描儀（Epson V800）掃描獲得TIF 圖片，使用WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)對掃描圖像進行分析，獲取總根長（TRL,cm）、根尖數（RTN）、根體積（RV, cm3）、根表面積（RSA, cm2）和根直徑（RAD,mm）性狀數據。設置3 次重復，每個重復測定3 株幼苗。

1.3.3 生物量測定 初篩時，低氮和正常氮處理18 d后，收獲大豆幼苗，將根組織和地上部組織分別置于105℃烘箱殺青30 min，60℃烘干至恒重，用萬分之一天平準確稱量地上部分干重（SDW）和地下部分干重（RDW），計算總干重（TDW）。設置3次重復，每個重復測定3株幼苗。

復篩時，低氮和正常氮處理12 d 后，按照初篩時的方法稱量每種材料的地上部干重和地下部干重，并計算總干重與根冠比（RSR）。

計算公式如下：

總干重=地下部分干重+地上部分干重；

根冠比=地下部分干重/地上部分干重。

1.3.4 氮含量測定 復篩時，將用于生物量測定的樣品繼續(xù)進行氮含量的測定。氮含量測定采用凱氏定氮法。氮含量測定完畢后同時計算整株氮含量（%）及整株總氮（mg）。

計算公式如下：

地上部總氮（mg）=植物地上部分干重（g）× 地上部分氮含量（%）×1000；

地下部總氮（mg）=植物地下部分干重（g）× 地下部分氮含量（%）×1000；

整株總氮（mg）=地上部總氮（mg）+地下部總氮（mg）；

整株氮含量（%）=總氮量（mg）/（總干重（g）×1000）×100。

1.4 數據分析

采用Microsoft Office Excel（2013）和IBM SPSS Statistics20.0軟件整理分析實驗數據。

2 結果與分析

2.1 不同氮處理生物量差異

不同資源材料地上部分干重、地下部分干重和總干重變異系數在低氮處理條件下分別達到29.20%、30.40%和28.44%，在正常氮處理條件下分別為30.04%、28.08%和29.14%，表明不同資源材料的生物量在兩種氮水平下均表現出很大的差異（表2）。

表2 78份大豆種質在正常氮和低氮條件下苗期生物量的差異Table 2 Differences in seedling biomass of 78 soybean accessions under normal and low nitrogen conditions

本實驗計算比較耐低氮脅迫指數（表3），以地上部干重及總干重耐低氮指數均大于0.8 為標準，初步篩選3 份耐低氮材料2011-X-559、2011-X-618、2011-X-639，以地上部干重及總干重耐低氮指數均小于0.6 為標準，篩選出3 份低氮敏感材料2011-X-472、2011-X-531、2011-X-547 及2 份中間型材料吉育86、東農53。

表3 78份大豆種質及干重耐低氮脅迫指數Table 3 Seventy-eight soybean accessions with their low nitrogen tolerant indexes of dry weight

2.2 苗期耐低氮材料篩選指標

2.2.1 變異分析 低氮處理后，17 個性狀指標均發(fā)生了顯著變化，具體表現為地上部干重、總干重、氮含量、總氮量、株高和葉綠素含量顯著降低；地下部干重和根冠比顯著增加；根構型指標除根直徑顯著降低外，其他性狀指標均顯著增加（表4）。不同氮素水平下，大豆苗期株高、根尖數、根體積、根表面積等的變異系數都大于12%，表明耐低氮性在不同材料間差異大（表4）。在正常氮處理下，17 個性狀變異系數范圍為4.06%～24.58%，其中以株高、根尖數、地上部干重、地下部干重和總干重較大；在低氮脅迫下，各指標變異系數范圍為4.51%～26.13%，其中以根尖數、株高、根體積、根表面積和總根長較大；比較耐低氮脅迫指數，各指標變異系數范圍為4.45%～17.37%，其中以地上部總氮、株高、整株總氮、地下部總氮和根體積較大（表4）。

表4 8份大豆材料苗期各指標的變異情況Table 4 Variation of each index of 8 soybean accessions at seedling stage

2.2.2 相關性分析 為進一步篩選出評價大豆耐低氮能力的指標，對所測定的17個指標進行相關性分析。在正常氮條件下，各指標間表現出明顯的相關性，植株總干重與根體積呈極顯著正相關（r=0.949**）；整株氮含量與地上部氮含量呈極顯著正相關（r=0.954**）；整株總氮與總干重呈極顯著正相關（r=0.971**）；總根長與根表面呈極顯著正相關（r=0.872**）；根體積與整株總氮呈極顯著正相關（r=0.913**）。在低氮條件下，各指標間表現出明顯的相關性，植株總干重與地上部干重呈極顯著正相關（r=0.987**）；整株氮含量與總干重呈極顯著負相關（r=-0.898**）；整株總氮與地上部總氮呈極顯著正相關（r=0.939**）；總根長與根表面積呈顯著正相關（r=0.829*）；根表面積與根體積呈極顯著正相關（r=0.925**）；根體積與總干重呈顯著正相關（r=0.725*）（表5）。

表5 8份大豆材料苗期各表型性狀在正常氮水平（對角線上方）和低氮水平（對角線下方）的Pearson相關系數Table 5 Pearson correlation coefficients of traits of 8 soybean accessioins at seedling stage under normal(above the diagonal)and low(below the diagonal)nitrogen conditions

2.2.3 主成分分析 對17個性狀耐低氮脅迫指數進行主成分分析。主成分分析結果表明，3 個主成分的累積貢獻率可以達到81.25%，說明這3 個成分具有較強的代表性（圖1）。主成分1 的方差貢獻率為47.81%，在主成分1 中，除了地下部氮含量為負向載荷外，其余性狀均為正向載荷，其中向量值較大的性狀包括根冠比、地下部干重、整株總氮、地上部總氮、總干重和地上部干重，可概括為“生物量因子”；主成分2 可以反映所有變異的20.75%，與主成分2較相關的性狀包括地下部氮含量、地下部總氮、整株氮含量、根表面積、根體積和平均根直徑，可概括為“根系形態(tài)因子”；主成分3 可以解釋全部變異的12.68%，與主成分3 較相關的性狀有葉綠素含量、總根長和地上部氮含量（圖1）。

圖1 大豆幼苗17個氮利用相關性狀的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of 17 traits related to nitrogen use efficiency at soybean seedling stage

結合各性狀指標的變異系數、相關性分析和主成分分析，將總干重、整株氮含量、整株總氮、總根長、根表面積和根體積6 個指標作為苗期間接判定大豆耐氮能力的依據。

2.3 氮高效及低氮敏感大豆資源精準鑒定

不同大豆材料苗期總干重、整株氮含量和整株總氮性狀的耐低氮指數均小于1，而總根長、根體積和根表面積性狀的耐低氮指數均大于1，分布于1.13到1.73范圍之間，表明在低氮脅迫條件下大豆會通過促進根系的生長來獲取更多的氮素（表6）。其中，2011-X-618 的整株總氮、總根長、根表面積、根體積4 個指標的耐低氮指數在8 個材料中均表現為最大值，總干重、整株氮含量2個指標的耐低氮指數分別位于第2、4 位。2011-X-531 總干重、整株總氮、根體積3 個指標的耐低氮指數在8 個材料中均表現為最小值，整株氮含量、總根長、根表面積3 個指標的耐低氮指數分別位于第6、7、7位。

表6 8份大豆材料耐低氮脅迫指數比較Table 6 Comparison of low nitrogen tolerance index of 8 soybean accessions

由圖2 可以看出，與正常氮條件下相比，材料2011-X-618在低氮脅迫下植株地上部變化較小，葉片輕微變黃，根系極為發(fā)達；而2011-X-531 在低氮脅迫下植株矮小，與正常氮條件下表型差異較大，其根系相比正常氮條件下發(fā)達程度變化較小。因此，對比8 個大豆材料的6 個性狀耐低氮脅迫指數，并結合兩個氮素水平下性狀表現值，可以初步認為2011-X-618 為大豆苗期耐低氮材料，2011-X-531為大豆苗期低氮敏感型材料。

圖2 不同氮濃度處理下氮利用效率差異大豆材料植株表型Fig.2 Phenotype of soybean accessions with different nitrogen use efficiency under nitrogen stress

3 討論

一般植物耐低營養(yǎng)篩選的環(huán)境有土培、沙培和水培等，水培的優(yōu)點在于它能準確地控制營養(yǎng)介質，快速篩選大批量的基因型。為縮短篩選時間、加快篩選速度，本試驗采用水培法在苗期進行篩選。篩選濃度也很重要，如果濃度太低，極不耐低氮的基因型會逐漸枯萎，濃度太高則會加重篩選壓力，優(yōu)良基因型的遺傳優(yōu)勢得不到充分發(fā)揮。本實驗所采用的低氮濃度是經預實驗后確定的，濃度與郝青南等[8]采用的一致。

在氮高效型品種篩選過程中，應盡量減少環(huán)境、養(yǎng)分以及病蟲害等因素的影響，因此篩選指標的確定尤為重要。由于缺氮會導致植物體一系列的表型性狀發(fā)生直接或間接的變化，所以選擇與缺氮密切相關且容易被測定的表型性狀作為初級篩選指標，或可提高氮高效利用基因型的篩選效率。陸潭及王金生等在耐低鉀大豆品種篩選及大豆營養(yǎng)高效利用型品種篩選中均將生物量作為重要的篩選指標[18，19]。本實驗中，兩種氮素水平下不同基因型生物量表現出很大的差異，因此本研究選擇將植株干重作為初步篩選指標。

植物根形態(tài)構型具有可塑性，植物可以通過調節(jié)自身根的形態(tài)和構型來適應外界的環(huán)境條件，并影響植物種內和種間的競爭關系[20,21]。植物對土壤中氮素的獲取很大程度上取決于其根系形態(tài)。有報道顯示低氮脅迫顯著影響根系形態(tài)特征[22]。近年來，在小麥和玉米等作物中均有根構型與氮效率相關的報道[23,24]。大豆中已有關于根構型與磷效率研究相關的報道，發(fā)現土壤中磷的有效性等環(huán)境因素對根構型具有調節(jié)作用；具有較好根形態(tài)構型的大豆基因型有利于從土壤中吸收有效磷和其它養(yǎng)分[25～27]。尹元萍等[28]利用根系形態(tài)構型成功篩選磷高效大豆基因型。在大豆中，關于根構型與氮利用效率相關報道較少。本實驗結果表明，低氮脅迫條件下大豆幼苗通過增加根體積、根表面積、總根長和根尖數等根系性狀從營養(yǎng)液中獲取更多的氮素，用于植株的生長發(fā)育。本研究結果也顯示，在低氮條件下，大豆幼苗的生物量與根體積、平均根直徑呈顯著相關，植株根體積與根表面積呈極顯著正相關，根表面積與總根長、平均根直徑與植株總氮呈顯著相關。這些結果說明，可以將根體積、根表面積和總根長作為重要篩選指標。

4 結論

大豆苗期耐低氮篩選指標的確定還沒有相應的報道，建立科學快速高效的氮高效資源篩選方法和技術指標顯得十分必要。水稻、玉米和小麥等作物已經建立了苗期氮高效評價指標體系。本實驗綜合這些作物評價氮高效的指標以及大豆本身固有的氮素利用特點，測定相關性狀指標，通過主成分分析及相關性分析，將總干重、整株氮含量、整株總氮、總根長、根表面積、根體積六個指標作為苗期耐低氮大豆資源的精細鑒定指標，并通過耐低氮脅迫指數來修正環(huán)境因素的影響和不同材料自身生物性狀背景的差異。參照上述指標綜合評價，篩選出氮高效材料2011-X-618 和低氮敏感型材料2011-X-531。