王軍華 ， 羅畫葉 ， 張翠玲 ， 李軍偉

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

mRNA疫苗是近年來發(fā)展的一種新型疫苗，相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗和DNA疫苗，mRNA疫苗具有多方面優(yōu)勢，包括：在胞質(zhì)中自我表達(dá)；不能整合到細(xì)胞的基因組上；具有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，制備成本低，生產(chǎn)周期僅需要1個(gè)月左右[1-3]。mRNA疫苗必須到達(dá)靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)才能被表達(dá)，但由于mRNA不穩(wěn)定，易被細(xì)胞質(zhì)中的RNA酶降解，如果直接注射裸露的mRNA進(jìn)入機(jī)體，會(huì)很快被降解，達(dá)不到預(yù)期的免疫效果；如果采用物理方法遞送，細(xì)胞會(huì)受到物理傷害，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，如何安全遞送外源性的mRNA并提高其表達(dá)效率便成為近年來mRNA疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，而設(shè)計(jì)高效的遞送載體成為mRNA疫苗研究的核心問題。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞穿透肽(Cell-penetrating peptides，CPPs)可以結(jié)合帶負(fù)電荷的RNA分子，而從狂犬病病毒糖蛋白(Rabies virus glycoprotein，RVG)中提取的含有29個(gè)氨基酸殘基的多肽片段是一種很有前景的細(xì)胞穿透肽，因此，本試驗(yàn)比較了來源于狂犬病病毒糖蛋白的細(xì)胞穿透肽RVG及其衍生物RVG9dR、RVG11dR對(duì)體外轉(zhuǎn)錄mRNA的遞送效果。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞穿透肽、主要試劑 質(zhì)粒pVax1-EGFP、質(zhì)粒pVax1、293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；7周齡BALB/c雌鼠，購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；3種細(xì)胞穿透肽：RVG、RVG9dR、RVG11dR(序列見表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；MEGAscriptTMT7 Transcription Kit、LiCl Precipitation Solution、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，均購自賽默飛世爾科技公司；E.coliPoly(A) Polymerase、Vaccinia Capping System，均購自NEB(北京)有限公司；DMEM培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清、非必需氨基酸(100×)，均購自Gibco公司。

表1 3種細(xì)胞穿透肽序列

1.2 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄 設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白mRNA(mRNA-EGFP)的體外轉(zhuǎn)錄模板(T7-EGFP-1F:TAATACGACTCACTATAGGGA；T7-EGFP-900R：AGGAAAGGACAGTGGGAGT),按照轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得初始mRNA, 使用氯化鋰(LiCl)溶液進(jìn)行純化，按照加帽加尾試劑盒說明書進(jìn)行加帽加尾的修飾后再次使用LiCl進(jìn)行純化，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)的mRNA-EGFP，并用Lipofectamine 2000在293T細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，證明獲得的mRNA在細(xì)胞內(nèi)有功能。

1.3 凝膠阻滯試驗(yàn) 測定mRNA-EGFP濃度后，將1 μg mRNA-EGFP與RVG按照4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4和 1∶8的質(zhì)量比例混合；另將1 μg mRNA-EGFP與RVG9dR按照2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8和1∶16的質(zhì)量比例混合；再將1 μg mRNA-EGFP與RVG11dR按照8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶4的質(zhì)量比例混合，室溫靜置20 min，分別進(jìn)行電泳，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。

1.4 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 在75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞長滿單層時(shí)，將細(xì)胞用胰酶消化、懸浮后鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每孔的細(xì)胞密度達(dá)到4×103個(gè)/孔，將培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。將3種細(xì)胞穿透肽設(shè)置相同的試驗(yàn)梯度，分別為0.01、0.1、1、10 μmol/L和100 μmol/L，每組重復(fù)3次；加入配制的混合液放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h；每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫下靜置20 min，使結(jié)晶物充分溶解；酶聯(lián)免疫檢測儀在OD490 nm處測量各孔的吸光值，利用Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較分析。

1.5 RNA酶保護(hù)試驗(yàn) 在6孔板內(nèi)每孔平鋪1×106個(gè) 293T細(xì)胞，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。試驗(yàn)前1 h，將6孔板內(nèi)原培養(yǎng)液棄掉，用PBS磷酸鹽緩沖液清洗293T細(xì)胞2次除去血清；每孔中加入1 mL Opti-MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。取滅菌后的1.5 mL離心管6個(gè)，分別加入100 μL Opti-MEM，1～3號(hào)加入1 μg mRNA-EGFP，4～6號(hào)加入10 μg RVG、8 μg RVG9dR、6 μg RVG11dR，將1～3號(hào)對(duì)應(yīng)加到4～6號(hào)離心管中，室溫靜置5 min后，將二者混合均勻室溫靜置20 min；向靜置后的4～6號(hào)離心管中各加入2 μL RNase A，于37 ℃的水浴鍋中溫育20 min；取出6孔板，將標(biāo)記為4～6號(hào)的離心管混合液加入到相應(yīng)6孔板中，添加空白對(duì)照孔；培養(yǎng)7 h后，將Opti-MEM無血清培養(yǎng)基替換為正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用倒置熒光顯微鏡觀察試驗(yàn)結(jié)果并拍照。

1.6 細(xì)胞熒光試驗(yàn) 在6孔板內(nèi)每孔平鋪1×106個(gè) 293T細(xì)胞，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。試驗(yàn)前1 h，將6孔板內(nèi)原培養(yǎng)液棄掉，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗293T細(xì)胞2次除去血清。試驗(yàn)分為 3個(gè)組，第1組：RVG 8 μg、10 μg、12 μg； 第2組：RVG9dR 6 μg、8 μg、10 μg；第3組：RVG11dR 4 μg、6 μg、8 μg，各組分別轉(zhuǎn)染1 μg mRNA-EGFP, 并設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 h，將Opti-MEM無血清培養(yǎng)基替換為正常的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 凝膠阻滯試驗(yàn) 3種細(xì)胞穿透肽RVG、RVG9dR、RVG11dR分別與1 μg mRNA-EGFP以不同的比例混勻，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，如圖1所示，mRNA-EGFP與RVG的最適比例為1∶8；mRNA- EGFP與RVG9dR的最適比例為1∶4；mRNA-EGFP 與RVG11dR的最適比例為1∶2。

圖1 3種細(xì)胞穿透肽和mRNA-EGFP的凝膠阻滯試驗(yàn)

2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 3種細(xì)胞穿透肽RVG、RVG9dR、RVG11dR對(duì)293T細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖2所示，3種細(xì)胞穿透肽對(duì)293T細(xì)胞的半抑制濃度(50% inhibiting concentration, IC50)分別是95、90 μmol/L和81 μmol/L,說明在RVG的C末端添加多精氨酸可導(dǎo)致其細(xì)胞毒性的增加。

圖2 RVG、RVG9dR、RVG11dR對(duì)293T細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.3 RNA酶保護(hù)試驗(yàn) 分別用RVG、RVG9dR、RVG11dR將mRNA-EGFP包被后，再與RNase A作用后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后在倒置熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖3所示，mRNA-EGFP在細(xì)胞內(nèi)都能正常表達(dá)，說明3種細(xì)胞穿透肽都能保護(hù)mRNA-EGFP不被RNA酶所降解。

圖3 RNase A 保護(hù)試驗(yàn)細(xì)胞熒光結(jié)果

2.4 細(xì)胞熒光試驗(yàn) 根據(jù)凝膠阻滯試驗(yàn)的結(jié)果將第1組細(xì)胞穿透肽RVG分別以8 μg、10 μg、12 μg與1 μg的mRNA-EGFP作用；將第2組細(xì)胞穿透肽RVG9dR分別以6 μg、8 μg、10 μg與1 μg的mRNA-EGFP作用；將第3組細(xì)胞穿透肽RVG11dR分別以4 μg、6 μg、8 μg與 1 μg的mRNA-EGFP作用，然后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，如圖4所示，RVG11dR 6 μg(圖4K)和RVG11dR 8 μg(圖4L)作用的細(xì)胞內(nèi)熒光最強(qiáng)，說明3個(gè)細(xì)胞穿透肽中，RVG11dR對(duì)mRNA-EGFP的轉(zhuǎn)運(yùn)效果最好，但是6 μg和8 μg RVG11dR對(duì)mRNA-EGFP 的轉(zhuǎn)運(yùn)效果基本沒有差別。

圖4 細(xì)胞熒光試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

mRNA的生產(chǎn)是通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得，體外轉(zhuǎn)錄是利用T7、T3或Sp6噬菌體RNA聚合酶以一個(gè)線性化的、編碼目的基因mRNA的質(zhì)粒DNA(Plasmid DNA，pDNA)作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后獲得前體mRNA[4]。而本試驗(yàn)中采用的體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是利用含有T7啟動(dòng)子的線性化的DNA作為模板，用于體外轉(zhuǎn)錄的模板至少包含1個(gè)啟動(dòng)子、1個(gè)編碼目的基因的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，然后用RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，再用DNA酶消化處理后就可以排除殘留的線性化的DNA[5]。目前，mRNA的體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)并不是十分完善，只通過普通的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄出的mRNA極其不穩(wěn)定，為了提高其穩(wěn)定性，需要在前體mRNA的5′端通過5′-5′三磷酸連接1個(gè)帽子結(jié)構(gòu)[6]，在轉(zhuǎn)錄過程中添加帽子類似物有可能轉(zhuǎn)錄出帶有帽子結(jié)構(gòu)的mRNA， 而本試驗(yàn)采用的是在轉(zhuǎn)錄結(jié)束后利用加帽試劑盒添加帽子結(jié)構(gòu)[7]，在三磷酸酶、鳥苷基轉(zhuǎn)移酶和(鳥嘌呤-7-)甲基轉(zhuǎn)移酶的共同作用下在RNA的5′三磷酸添加1個(gè)帽子結(jié)構(gòu)[8]，這可以增加蛋白的表達(dá)量，提高mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)其免遭核酸外切酶的攻擊[9]。同時(shí)，還需要在前體mRNA的3′端添加一段Poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)，可以采用在pDNA后添加1個(gè)Poly(A)序列用于轉(zhuǎn)錄成Poly(A)尾巴，同樣這一步驟本試驗(yàn)中也采用在轉(zhuǎn)錄后使用加尾試劑盒進(jìn)行添加[10]，Poly(A)尾巴可以增強(qiáng)mRNA翻譯效率，提高mRNA的穩(wěn)定性。經(jīng)過加帽、加尾之后才能形成具有生物活性的mRNA，進(jìn)一步提高mRNA的蛋白表達(dá)。

細(xì)胞穿透肽是一種短肽，在遞送載體中扮演著十分重要的角色，它能夠不依賴特異性膜受體獨(dú)立穿過細(xì)胞膜，甚至有些細(xì)胞穿透肽的入胞并不依賴能量[11]，其具有良好的生物相容性，且細(xì)胞毒性小，完成入胞轉(zhuǎn)運(yùn)后可降解，并能與生物活性蛋白直接融合進(jìn)行重組表達(dá)[12]。細(xì)胞穿透肽的組成和結(jié)構(gòu)多種多樣，因此各類細(xì)胞穿透肽穿透細(xì)胞膜的方式和效率也各不相同。本試驗(yàn)中比較了來源于狂犬病糖蛋白的細(xì)胞穿透肽以及其衍生物對(duì)體外轉(zhuǎn)錄mRNA的遞送效果。

從狂犬病病毒糖蛋白中提取的含有29個(gè)氨基酸殘基的多肽片段RVG，作為一種陽離子細(xì)胞穿透肽，除了具有前面介紹的特點(diǎn)之外，它還有獨(dú)特的優(yōu)勢：嗜神經(jīng)性、血腦屏障通透性和生物安全性。RVG可以穿過血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)進(jìn)入腦細(xì)胞[13]，到目前為止已被證明可以成功地用于攜帶質(zhì)粒[14]、siRNA[15]、蛋白質(zhì)[16]和納米顆粒[17]進(jìn)入腦細(xì)胞。有研究表明，含有少精氨酸殘基的嵌合RVG(RVG-9R)可以通過電荷相互作用與siRNA結(jié)合，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)樹突狀細(xì)胞(DCs)從而抑制流感病毒的復(fù)制[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，RVG-9R融合肽將DNA疫苗靶向轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)DCs可有效提高針對(duì)牛痘和西尼羅河病毒感染的免疫應(yīng)答，精氨酸的低聚物使其具有更高的穿膜效率[19]，此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸的數(shù)量和排列順序?qū)ζ浯┠つ芰τ兄匾挠绊慬20]。

本試驗(yàn)合成了來源于狂犬病病毒糖蛋白的細(xì)胞穿透肽RVG并設(shè)計(jì)、合成其衍生物RVG9dR、RVG11dR。結(jié)果顯示：3種細(xì)胞穿透肽都對(duì)mRNA具有一定的包被、保護(hù)和遞送效果，其中RVG11dR的包被效果最好、遞送效率最高。有研究證實(shí)，帶有29個(gè)精氨酸的RVG能夠遞送熒光蛋白到特定細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)[21]，因此可以適當(dāng)增加精氨酸的數(shù)量來提高RVG的遞送和保護(hù)效果，在本試驗(yàn)中RVG9dR和RVG11dR對(duì)mRNA的遞送效率皆比RVG高，說明在RVG的C末端添加多精氨酸可以提高其對(duì)mRNA的包裝與轉(zhuǎn)運(yùn)能力，但是細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果又表明在RVG的C末端添加多精氨酸也可導(dǎo)致其細(xì)胞毒性的增加。研究證明，陽離子脂質(zhì)體納米顆粒(Lipid nanoparticles，LNPs)可作為高效的遞送小干擾RNA(siRNA)的工具[22]，或許將其與細(xì)胞穿透肽結(jié)合后會(huì)對(duì)mRNA的遞送和保護(hù)產(chǎn)生積極效果[23]。因此，以后的研究中可以考慮采用將細(xì)胞穿透肽與脂質(zhì)體納米顆粒相結(jié)合的方式提高對(duì)mRNA的遞送效力。