汪鋒鋒 ， 蔣 凱 ， 趙鵬宇 ， 王天碩 ， 于思雯 ， 郭東華

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院 ， 黑龍江 大慶 163319)

壞死桿菌(Fusobacteriumnecrophorum,Fn)隸屬于擬桿菌科(Fusobacteriaceae)，梭桿菌屬(Fusobacterium)，是嚴格厭氧、無鞭毛、無芽孢和莢膜、多形性的革蘭陰性菌[1]。壞死桿菌存在于多種動物和人的口腔、胃腸道以及泌尿生殖道[2]，其中以牛、羊、馬、豬最易感，禽類易感性較小，在實驗動物中，小鼠最易感[3]。壞死桿菌對人的危害常表現(xiàn)為以咽炎、側頸痛和發(fā)熱為臨床特征的萊米爾綜合征(Lemierre′s syndrome，LS)[4]；對反芻動物而言，最常見的是腐蹄病(Foot rot)，該病在北美洲、南美洲、澳大利亞、新西蘭和歐洲均有報道[5-6]。國外奶牛腐蹄病的發(fā)病率為4%～55%，我國因腐蹄病而淘汰的奶牛占總淘汰奶牛的15%～30%[7]。因壞死桿菌引發(fā)的肝膿腫(Liver abscesses)在不同年齡段的牛只中均有發(fā)生，臨床可導致動物采食減少、體重減輕、生產性能降低等[8]。此外，壞死桿菌還可引起奶牛子宮內膜炎[9]和乳腺炎[10]，尤其在奶牛產后的短時間內細菌的豐富度降低，而包含壞死桿菌在內的多種致病菌呈現(xiàn)急速增殖，引起乳腺炎。奶牛乳腺炎的發(fā)生不僅會引起奶牛自身的健康問題，也會影響奶業(yè)的發(fā)展，通過超基因組焦磷酸測序技術研究乳汁中細菌DNA的多樣性，發(fā)現(xiàn)壞死桿菌也參與其中[11]。用細菌培養(yǎng)法對子宮積膿時子宮內存在的細菌進行研究，結果表明壞死桿菌和化膿隱秘桿菌是引起子宮積膿的主要病原[12]。

壞死桿菌具有多種毒力因子[13-14]，其分泌的白細胞毒素(Leukotoxin,lkt)是重要的毒力因子之一，可以損傷反芻動物的中性粒細胞、肝細胞、瘤胃上皮細胞，以及其他的宿主靶細胞，并且能介導機體產生抵抗壞死桿菌感染的特異性免疫反應[15]。研究表明，壞死桿菌的43K OMP對牛乳腺上皮細胞以及倉鼠腎細胞具有黏附作用[16-17]；Narayanan等[18]和郭東華[19]均證實壞死桿菌的主要毒力因子白細胞毒素能夠介導中性粒細胞凋亡；汪孫杰[20]驗證真核表達的重組白細胞毒素可以誘導小鼠肝上皮細胞的凋亡。但是關于壞死桿菌感染宿主細胞誘導細胞凋亡后的具體變化尚不清楚。

本研究以牛壞死桿菌A25菌株為研究對象，探究其是否參與宿主細胞的增殖和凋亡過程。將壞死桿菌感染小鼠乳腺上皮細胞系(EPH4細胞)，分別通過細胞增殖和凋亡兩方面試驗，探究牛壞死桿菌對宿主細胞增殖和凋亡的影響，旨在為進一步開展壞死桿菌在細胞生長周期以及凋亡機制相關研究和其致病機制研究提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清，購自Clark bioscience公司；青鏈霉素混合液(100×)雙抗、麥氏比濁管試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒、Beyo ClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒、細胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒(離心柱式)，均購自碧云天生物技術有限公司；DL-2 000 Marker、10×Loading Buffer、SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 熒光顯微鏡，德國徠卡公司產品；實時熒光定量PCR儀，美國伯樂公司產品；恒溫細胞培養(yǎng)箱，美國賽默飛科技公司產品；厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍公司產品；紫外分析儀，北京君意有限公司產品。

1.3 菌株、細胞、培養(yǎng)基 牛壞死桿菌標準菌株(A25菌株)Fusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorum(Fnn)，購自美國菌種保藏中心(ATCC 25286，美國)；A25菌株和EPH4細胞，均由黑龍江八一農墾大學獸醫(yī)分子病理學實驗室保存。腦心浸液瓊脂(BHI)、厭氧培養(yǎng)液，均購自Hopebiol公司(青島海博)；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及試驗分組 EPH4細胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、100 U/L青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d消化傳代1次，取對數生長期細胞用于試驗。試驗分為對照組和試驗組，對照組為未進行任何處理的EPH4細胞，試驗組為壞死桿菌處理的EPH4細胞。

1.4.2 壞死桿菌培養(yǎng)及計數 從-80 ℃取出1管壞死桿菌標準菌株A25(甘油與細菌1∶9凍存)，接種于5 mL厭氧培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代培養(yǎng)3次，培養(yǎng)于溫度為37 ℃，氣體壞境為85% N2、10% H2、5% CO2的厭氧箱中，復壯后的細菌按照1∶20的比例接種于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期進行試驗。根據麥氏比濁管試劑盒說明書，使用紫外分析儀測定培養(yǎng)細菌的OD600值，與已知OD600值相比較，計算細菌濃度，見表1。

表1 麥氏比濁法

1.4.3 EdU標記法檢測細胞增殖 用細胞培養(yǎng)液1∶500倍稀釋EdU，使其工作濃度為10 μmol/L，加入到處理后的細胞中，孵育2 h，使用4%多聚甲醛固定細胞，洗滌液洗滌3次，每次5 min，再加入0.3%的Triton X-100孵育15 min，洗滌液洗滌3次，每次5 min，加入反應液避光孵育30 min，洗滌液洗滌3次，每次5 min，加入含DAPI的封片液，隨后通過熒光顯微鏡觀察并記錄。

1.4.4 Hoechst染色檢測細胞凋亡 將處于對數生長期的EPH4細胞用DMEM完全培養(yǎng)基調整至濃度為1×105個/mL的細胞懸液，加入到6孔板中，以感染復數(MOI)為100感染壞死桿菌2、4 h和6 h，感染結束后棄去培養(yǎng)基，加入固定液，10 min后棄去固定液，PBS洗3次，每次3 min，加入Hoechst 33258染色液，染色5 min，棄去染色液，PBS洗3次，每次3 min，滴加抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡觀察并記錄。

1.4.5 DNA Ladder試驗 將處于對數生長期的EPH4細胞用DMEM完全培養(yǎng)基調整至濃度為1×105個/mL 的細胞懸液，加入到6孔板中，以MOI為100感染壞死桿菌2、4 h和6 h，按照細胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒說明書提取DNA，進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測凋亡基因 收集感染后的EPH4細胞，TRIzol法提取樣品中的總RNA，分光光度計測定RNA濃度，逆轉錄合成cDNA。按照SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑盒說明書進行RT-qPCR。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；反應體系：TB GreenPremix12.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，cDNA 1 μL， ddH2O 10.5 μL。引物序列見表2，引物由擎科生物有限公司合成，以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算各基因的mRNA相對表達量。

表2 凋亡基因引物序列

2 結果

2.1 壞死桿菌對EPH4細胞增殖的影響 為了研究壞死桿菌對EPH4細胞增殖的影響，采用EdU增殖檢測法檢測細胞在感染時間為2、4 h和6 h，MOI為0、50、100、200、500、1 000時的細胞增殖率。EdU試驗結果如封二彩版圖1A所示，隨著感染時間與感染濃度的增加，細胞增殖逐漸減弱，對總細胞數(見封二彩版圖1B)與EdU的陽性細胞增殖率(見封二彩版圖1C)統(tǒng)計分析，結果顯示，與對照組相比，試驗組在相同感染時間下，壞死桿菌可顯著抑制EPH4細胞增殖(P<0.05)。

2.2 壞死桿菌誘導EPH4細胞凋亡 為了研究壞死桿菌對EPH4細胞凋亡的影響，壞死桿菌按照MOI為100感染EPH4細胞2、4 h和6 h，通過Hoechst 33258染色觀察細胞形態(tài)，通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段化。Hoechst 33258染色后，活細胞為正常藍色的圓形或橢圓形，而凋亡細胞因染色質固縮，其細胞核呈致密濃染，顏色為亮藍色。與對照組相比，隨著感染時間的增加，試驗組EPH4細胞呈現(xiàn)不同程度的亮藍色熒光，且呈現(xiàn)時間依賴性(圖2A)。壞死桿菌感染后提取EPH4細胞的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，與對照組相比，壞死桿菌感染細胞2、4 h和6 h后，分別出現(xiàn)不同程度的DNA“梯狀”條帶(圖2B)，表明壞死桿菌可誘導EPH4細胞凋亡。

圖2 壞死桿菌對EPH4細胞凋亡的影響

2.3 RT-qPCR檢測壞死桿菌感染EPH4細胞后凋亡基因mRNA的相對表達量 將EPH4細胞接種于6孔板中，壞死桿菌按照MOI為100感染EPH4細胞，分別在感染2、4 h和6 h后收集細胞。提取細胞總RNA，逆轉錄后RT-qPCR檢測凋亡基因的mRNA相對表達量。結果顯示，與對照組相比，壞死桿菌感染2 h和4 h時，促凋亡基因Bax的mRNA相對表達量顯著上調(P<0.001)，抑凋亡基因Bcl-2的mRNA的相對表達量無顯著性差異(P>0.05)，Bax與Bcl-2基因的mRNA相對表達量的比值也顯著性上調(P<0.05)；而壞死桿菌感染6 h時，促凋亡基因Bax的mRNA相對表達量顯著下調(P<0.001)，抑凋亡基因Bcl-2的mRNA相對表達量顯著上調(P<0.001)，Bax與Bcl-2基因的mRNA相對表達量的比值顯著性下調(P<0.001)(圖3A～3C)。與對照組相比，壞死桿菌感染細胞2 h和4 h時后，促凋亡基因AIF的mRNA相對表達量顯著下調(P<0.001)，在感染6 h時，其mRNA相對表達量顯著上調(P<0.001)。與對照組相比，壞死桿菌感染細胞2 h時，Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達量顯著下調(P<0.05)，而感染4 h和6 h時，其mRNA相對表達量顯著上調(P<0.001)(圖3D～3F)。結果表明壞死桿菌感染細胞后，可引發(fā)細胞凋亡，該結果與Hoechst 33258染色和DNA Ladder試驗結果一致。

圖3 RT-qPCR檢測凋亡基因的mRNA表達水平

3 討論

壞死桿菌是一種多形性桿菌，革蘭染色呈陰性，病灶內細菌鏡檢呈長絲狀，著色不均勻，臨床引起以壞死性和化膿性感染為主要特征的壞死桿菌病。隨著對壞死桿菌的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)壞死桿菌作為機會性病原體參與人和動物的壞死性和化膿性疾病，例如動物的腐蹄病、肝膿腫、乳腺炎和人的Lemierre′s綜合征[21]等。壞死桿菌的毒力因子主要有白細胞毒素、溶血素、內毒素、外膜蛋白、皮膚壞死毒素等，大量研究表明這些毒力因子在病原菌黏附宿主細胞、病原菌與宿主細胞相互作用并大量繁殖、病原菌產物導致宿主細胞損傷或死亡等方面起到重要作用[17-21]，但壞死桿菌誘導細胞凋亡的研究甚少。

因此，本研究首先通過壞死桿菌A25菌株感染鼠乳腺上皮細胞，采用EdU增殖試驗檢測壞死桿菌在不同感染復數和不同感染時間條件下對細胞增殖的影響。結果表明，壞死桿菌以時間與濃度依賴性抑制鼠乳腺上皮細胞增殖。細菌感染后，可以通過誘導免疫細胞或上皮細胞凋亡促進細菌感染，細胞凋亡通常不會引起炎癥反應[22]，因此其是細菌感染的首選途徑，此外，細菌感染后，還可以通過促進細胞凋亡進而促進自身的感染與增殖[23]。壞死桿菌同樣可以誘導細胞發(fā)生凋亡，當細胞發(fā)生凋亡時，染色質濃縮，形成凋亡小體，DNA斷裂形成180 bp 大小的片段，電泳時形成“Ladder”條帶[24]，在壞死桿菌感染EPH4細胞后，Hoechst染色觀察到凋亡小體的出現(xiàn)，核酸電泳DNA呈現(xiàn)“Ladder”條帶。

細胞發(fā)生凋亡時，不僅呈現(xiàn)細胞形態(tài)上的變化，在基因水平上也會發(fā)生變化，因此，本研究在mRNA水平上進一步驗證細胞凋亡的發(fā)生，RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，壞死桿菌感染EPH4細胞2 h時，促凋亡基因Bax和Bax/Bcl-2的mRNA相對表達量顯著上調；感染4 h時，促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對表達量極顯著上調；感染6 h時，促凋亡基因AIF的mRNA相對表達量極顯著上調。當細胞發(fā)生凋亡時，線粒體膜上的Bcl-2家族的促凋亡基因在死亡刺激信號下，調控線粒體膜的通透性，從而釋放AIF等促凋亡因子，在促凋亡因子的作用下，募集Pro-caspase-9，從而激活Caspase-3，啟動Caspase級聯(lián)反應[25]。而對于在感染后期抑凋亡基因Bcl-2的上調以及Bax/Bcl-2的下調，出現(xiàn)抑制細胞凋亡的現(xiàn)象，可能是由于感染時間增加，細胞死亡方式偏向細胞壞死[26]，這也與DNA Ladder和Hoechst染色結果一致。本研究證明了牛壞死桿菌能夠抑制EPH4細胞增殖且誘導細胞凋亡，為壞死桿菌致病機制的研究提供了一定的理論依據。