郭珂一，周崢宇，趙幸娟

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)內科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，河南 鄭州 450000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理學特征是β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)異常沉積[1-2]，細胞內磷酸化的微管Tau蛋白螺旋化聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結[3-4]及神經(jīng)元丟失[1,5]。AD的主要臨床表現(xiàn)是進行性記憶能力減退、語言障礙、行為障礙、認知功能障礙等。國際阿爾茨海默癥協(xié)會(Alzheimer′s Disease International，ADI)發(fā)布的《2019全球阿爾茨海默癥報告：對癡呆的態(tài)度》中指出，2019年全世界有超過5 000萬人患有AD或其他類型的癡呆，這一數(shù)值預計2050年將達到1.52億。關于AD的發(fā)病機制有多種假說，包括β淀粉樣蛋白級聯(lián)假說[6]、膽堿能假說、Tau蛋白假說、神經(jīng)免疫炎癥假說、氧化應激假說、基因突變假說等，但其具體發(fā)病機制尚不清楚，且尚無特效治療藥物。葛根素有生津止渴升陽的作用，目前研究已證實，葛根素具有逆轉Aβ誘導的神經(jīng)損傷等活性，對AD模型大鼠的認知功能具有改善作用[7-8]，但其作用機制仍不十分明確。因此，本研究利用經(jīng)典的GAL4/UAS系統(tǒng)構建AD果蠅模型，探究葛根素對其神經(jīng)保護作用及機制，以期為葛根素在臨床AD治療中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇北極型突變Aβ42(arctic mutation Aβ42，UAS-Aβ42arc)、p〔Gal4〕A307、W1118共3種品系的黑腹果蠅，均由中國科學院上海高等研究院黃福德教授惠贈。將果蠅放入裝有用1 300 mL 蒸餾水、11.2 g瓊脂粉、30.00 g酵母粉、77.70 g玉米粉、63.20 g葡萄糖、31.62 g蔗糖配制成的培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設置濕度60%，溫度25 ℃，保種的果蠅每20 d更換1次培養(yǎng)基。

1.2 試劑與儀器葛根素購自美國Merck公司，免疫染色封閉液、免疫熒光染色一抗稀釋液、免疫熒光染色二抗稀釋液、Alexa Fluor 555 二抗購自上海碧云天生物技術有限公司，Triton-X100、1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、抗熒光衰減封片、抗熒光衰減封片劑、體積分數(shù)4%組織細胞固定液購自北京索萊寶科技有限公司，6E10 一抗購自美國BioLegend公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司，人Aβ42 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 試劑盒購自美國Invitrogen公司，碳酸氫鈉、甲酸、氫氧化鈉購自西隴科學股份有限公司，蛋白酶抑制劑cocktail購自美國Bimake公司；純水超系統(tǒng)購自美國Millipore公司，恒溫培養(yǎng)箱、烘箱購自南寧精密儀器儀表公司，體式顯微鏡購自日本Nikon公司，電子秤購自方瑞公司，制冰機購自斯科茨曼制冰系統(tǒng)(上海)有限公司，CO2麻醉板購自北京健乃喜生物技術有限公司，電磁爐購自美的集團有限公司，高速冷凍離心機購自美國貝克曼庫爾特公司，共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司，多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 果蠅雜交選擇生長良好具有較多即將羽化蛹的培養(yǎng)瓶，清除瓶內成蠅，利用CO2麻醉，收集羽化6 h內的雌蠅為處女蠅，放入培養(yǎng)瓶觀察3 d，確保雌蠅未受精。構建GAL4/UAS系統(tǒng)的Aβ42arc轉基因果蠅：將攜帶逃跑通路p〔Gal4〕A307表達的處女蠅(15～20只)與UAS-Aβ42arc雄蠅(5～10只)放于裝有果蠅培養(yǎng)基的錐形瓶中雜交，于雜交第7天時清空培養(yǎng)瓶中的親本，收集子一代果蠅標記為Aβarc果蠅。將p〔Gal4〕A307處女蠅與W1118雄蠅雜交，收集子一代為正常對照組。

1.3.2 實驗動物分組和處理取Aβarc果蠅隨機分為AD模型組、0.10 mmol·L-1葛根素干預組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組、0.24 mmol·L-1葛根素干預組。0.10 mmol·L-1葛根素干預組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組、0.24 mmol·L-1葛根素干預組分別用終濃度為0.10、0.20、0.24 mmol·L-1葛根素按 24 g·L-1的比例添加酵母，混均后用移液器均勻地打在果蠅的培養(yǎng)基表面，AD模型組及正常對照組用含24 g·L-1酵母的超純水均勻打在培養(yǎng)基表面，每日1次，培養(yǎng)基每3 d更換1次，至第21天進行爬管能力檢測。

1.3.3 果蠅爬管能力的檢測取正常對照組、AD模型組、0.10 mmol·L-1葛根素干預組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組、0.24 mmol·L-1葛根素干預組果蠅進行爬管能力檢測。果蠅爬管實驗檢測時間點根據(jù)果蠅成長情況選用羽化后日齡21 d的雄蠅為目的果蠅。應用果蠅爬管能力檢測儀(中國科學院上海高等研究院黃福德教授設計)進行實驗，裝置包括1個矩形的金屬框架(長32 cm，寬5 cm，高12 cm)，框架內可放置10個果蠅爬行管(直徑2.4 cm，高10.0 cm)，下方有電機、計時器，通過杠桿原理，升高及下降上方的金屬框架，1次驅動可產(chǎn)生4次升降，將果蠅置于管底，間隔1 min后進行下一次驅動，利用果蠅負趨地性來測試爬行能力，之后使用果蠅爬管分析軟件RflyDetection 2.0進行統(tǒng)計。每管果蠅測試3次，以上實驗獨立重復3次，統(tǒng)計果蠅跌落至管底后21 s時所爬行高度。根據(jù)葛根素0.10、0.20、0.24 mmol·L-1濃度組果蠅爬管能力，確定0.20 mmol·L-1為葛根素最適濃度，進行果蠅壽命、腦組織中Aβ含量及斑塊面積測定實驗。

1.3.4 果蠅壽命監(jiān)測取正常對照組、AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅各80只均平均分到4個培養(yǎng)瓶，每瓶20只，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，空氣濕度控制在60%左右，3 d更換1次培養(yǎng)基，同時記錄果蠅死亡情況，直至果蠅全部死亡。瓶壁保持干燥，防止果蠅沾粘至死。

1.3.5 ELISA法檢測果蠅腦組織中Aβ蛋白表達按照人Aβ42 ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書，對標準品進行連續(xù)稀釋，將人Aβ42標準品重構為1 ng·L-1。分別取正常對照組、AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組各25只果蠅，將果蠅頭放入Ep管中，添加50 μL 含1×蛋白酶抑制劑的ELISA標準樣品稀釋液，徹底均質化，室溫孵育4 h，將勻漿在4 ℃ 下16 000×g離心20 min，取上清液。檢測時取3 μL上清液，用PBS稀釋20倍，每孔滴加50 μL，設置空白對照孔；每孔加入50 μL人Aβ42檢測抗體溶液，空白對照孔除外，室溫下振蕩孵育3 h；吸出溶液，用1×PBS洗滌4次，之后加入100 μL辣根過氧化物酶標記抗兔IgG，空白對照孔除外，室溫下孵育30 min，將溶液吸出，用1×PBS洗滌4次。加入100 μL色原體，室溫下避光孵育30 min，最后加入100 μL終止液，混合均勻，檢測450 nm處的吸光度值，繪制標準曲線：y=0.002 9x+0.045 4，R2=0.990 1，根據(jù)標準曲線計算果蠅腦組織中Aβ表達水平。

1.3.6 免疫熒光法檢測果蠅腦組織中Aβ斑塊面積分別取正常對照組、AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組3只果蠅，將果蠅放置在添加體積分數(shù)4%組織固定液的Ep管中3 h，之后應用含吐溫20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline containing Tween-20，PBST)洗3次，每次15 min。體式顯微鏡下剝出果蠅腦組織，PBST清洗3次，每次15 min。免疫染色封閉液封閉30 min，滴加一抗6E10(滴度1100)，4 ℃過夜孵育，PBST洗3次，每次15 min，滴加Alexa Fluor555二抗 (滴度1500)孵育2 h，PBST洗3次，每次15 min。用微量移液槍將腦組織吸出置于載玻片上，滴加抗熒光衰減封片劑，蓋上蓋玻片，指甲油封片，應用共聚焦顯微鏡觀察并計算腦組織中Aβ斑塊面積占比。

2 結果

2.1 5組果蠅爬管能力比較正常對照組、AD模型組、0.10 mmol·L-1葛根素干預組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組、0.24 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度分別為(6.82±0.43)、(1.86±0.27)、(3.14±0.16)、(4.20±0.21)、(3.56±0.20)cm。5組間果蠅爬管高度比較差異有統(tǒng)計學意義(F=139.620，P<0.05)；AD模型組、0.10 mmol·L-1葛根素干預組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組、0.24 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度顯著低于正常對照組，0.10 mmol·L-1葛根素干預組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組、0.24 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度顯著高于AD模型組，0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度顯著高于0.10 mmol·L-1葛根素干預組和0.24 mmol·L-1葛根素干預組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；0.10 mmol·L-1葛根素干預組與0.24 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 正常對照組、AD模型組和0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅壽命比較結果見圖1。正常對照組、AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅的中位生存期分別為48.0、27.0、40.5 d，AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅的中位生存期顯著短于正常對照組，0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅的中位生存期顯著長于AD模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 正常對照組、AD模型組和0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅壽命Fig.1 Lifespan of drosophila in the normal control group,AD model group and 0.20 mmol·L-1 puerarin intervention group

2.3 正常對照組、AD模型組和0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ表達水平比較正常對照組、AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ表達水平分別為(0.00±0.00)、(44.83±3.42)、(29.73±2.44) ng·L-1，3組果蠅腦組織中Aβ表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=265.540，P<0.05)；AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ表達水平顯著高于正常對照組，0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ表達水平顯著低于AD模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 正常對照組、AD模型組和0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ斑塊面積占比比較

結果見圖2。正常對照組、AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ斑塊面積占比分別為(0.00±0.00)%、(3.25±0.74)%、(1.04±0.22)%。3組間果蠅腦組織中Aβ斑塊面積占比比較差異有統(tǒng)計學意義(F=72.360，P<0.05)； AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ斑塊面積占比顯著高于正常對照組，0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ斑塊面積占比顯著低于AD模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A:正常對照組；B：AD模型組；C：0.20 mmol·L-1葛根素干預組。圖2 正常對照組、AD模型組和0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ斑塊(免疫熒光染色)Fig.2 Aβ plaques in the brain tissue of drosophila in the normal control group,AD model group and 0.20 mmol·L-1 puerarin intervention group (immunofluorescence staining)

3 討論

AD是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，近年來其發(fā)病率呈升高趨勢，但其發(fā)病機制尚不明確，尚無特效藥，且我國人口基數(shù)大，老齡化加劇，因此，防治AD及新藥研發(fā)顯得尤為重要。中藥的研發(fā)有其獨特的優(yōu)勢，同時也存在著諸多不穩(wěn)定性因素，因此，確定中藥有效成分及劑量是AD創(chuàng)新性藥物研發(fā)的重中之重。

研究證實，葛根素可保護AD模型大鼠Aβ?lián)p傷的神經(jīng)元細胞、抑制腦內神經(jīng)元凋亡，改善認知功能和空間記憶功能[9-13]。但大多數(shù)研究均是針對大鼠、小鼠及細胞，關于葛根素對AD果蠅的神經(jīng)保護作用的研究報道較少。黑腹果蠅為動物模型，具有繁殖周期短，基因簡單，與人類基因同源，易于培養(yǎng)，經(jīng)濟實惠，便于分子標記和表型標記等優(yōu)勢。驅動子A307在逃跑通路表達，可使Aβ在果蠅的神經(jīng)元胞體和軸突內沉積，使神經(jīng)肌肉接頭的突觸能力下降，導致果蠅行為學表型惡化和腦內Aβ斑塊沉積加劇。應用UAS-Aβ42arc轉基因果蠅與攜帶逃跑通路啟動的p〔Gal4〕A307果蠅雜交可構建AD果蠅模型[14]。

果蠅爬管能力是果蠅模型實驗中常用檢測指標，利用負趨地性，反映果蠅運動能力，可用來評估葛根素對AD果蠅的神經(jīng)保護效果[15]。本研究結果顯示，AD模型組、0.10 mmol·L-1葛根素干預組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組、0.24 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度顯著低于正常對照組，0.10 mmol·L-1葛根素干預組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組、0.24 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度顯著高于AD模型組，0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度顯著高于0.10 mmol·L-1葛根素干預組和 0.24 mmol·L-1葛根素干預組，0.10 mmol·L-1葛根素干預組與0.24 mmol·L-1葛根素干預組果蠅爬管高度比較差異無統(tǒng)計學意義；說明AD模型果蠅的運動能力顯著降低，而葛根素可顯著改善AD果蠅的運動能力，其中0.20 mmol·L-1葛根素對AD模型果蠅的運動能力的改善作用最明顯。因此，選擇0.20 mmol·L-1為葛根素最適濃度，進行后續(xù)果蠅壽命、果蠅腦組織中Aβ含量及斑塊測定實驗。

AD果蠅實驗中果蠅壽命是重要的評估指標，AD通常會導致動物模型存活時間減少，因此，觀察果蠅的生存時間可以判斷藥物對果蠅發(fā)揮神經(jīng)保護的效果。本研究結果顯示，AD模型組和0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅的中位生存期顯著短于正常對照組，0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅的中位生存期顯著長于AD模型組；說明AD模型果蠅存在神經(jīng)損傷，其壽命明顯縮短，葛根素可在一定程度上對AD果蠅產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，從而延長AD果蠅的壽命。

Aβ相對分子質量為4 000，具有神經(jīng)毒性，可誘導神經(jīng)細胞損傷，是典型AD的病理特征之一。Aβ由APP水解產(chǎn)生，依照氨基酸特性所組成，可呈單體亦可呈聚合體存在，其中寡聚體尤為重要，目前Aβ被認為是造成AD認知障礙及神經(jīng)損傷的主要因素；其低分子量寡聚體的主要二級結構β折疊，易折疊成β-片層結構，增加細胞神經(jīng)毒性[16-18]。Aβ作為AD的重要指標，是診斷及治療中不可代替的標準之一。本研究結果顯示，AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ表達水平顯著高于正常對照組，0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ表達水平顯著低于AD模型組；AD模型組、0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ斑塊面積占比顯著高于正常對照組，0.20 mmol·L-1葛根素干預組果蠅腦組織中Aβ斑塊面積占比顯著低于AD模型組；證實AD的發(fā)病與腦組織中Aβ的形成和沉積而產(chǎn)生神經(jīng)毒性相關，而葛根素可以通過減少AD果蠅腦組織中Aβ含量和抑制Aβ在腦組織中的沉積，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

綜上所述，葛根素可通過減少AD果蠅腦組織中Aβ含量和抑制Aβ沉積來發(fā)揮神經(jīng)保護作用，從而提高AD果蠅運動能力，延長AD果蠅壽命。